芽孢杆菌PB6在预防或治疗胃肠道疾病及免疫相关疾病中的用途

摘要

发现产脂肽的芽孢杆菌属细菌当作为益生菌给予时可有效治疗和预防胃肠道疾病。特别地，经鉴别为PB6的芽孢杆菌属细菌当作为益生菌给予时可用于治疗抗生素相关性腹泻(AAD)或者更严重的病变艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)。另外，已经发现这些细菌可有效治疗免疫相关疾病如炎症性肠病(IBD)。

说明书

本申请要求2005年11月29日申请的美国专利申请系列号No. 60/740,518的优先权。

发明背景

本发明一般性涉及给予细菌以治疗胃肠道疾病，更特别涉及给予 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株治疗抗生素相关性 腹泻(AAD)和艰难梭菌(Clostridium difficile)相关性疾病(CDAD)。

术语“抗生素相关性腹泻”是指在使用抗菌剂之后的良性、自限 性腹泻。典型地，这种腹泻未鉴别出病原体，腹泻是由于肠道菌群的 组成和功能改变所致。大多数患者响应于支持措施和停用抗生素。

长期应用多种抗生素、特别是应用肠道吸收较差或高度胆汁分泌 的广谱抗生素，导致肠道菌群的组成和功能发生变化，因此导致AAD 高发^1，2。肠道菌群的组成及功能变化的程度受正常菌群抵抗建群的能 力及所用抗生素类型的影响。结肠厌氧性菌群的减少干扰碳水化合物 和胆汁酸的代谢，可以发生渗透性或分泌性腹泻。由于微生物和代谢 的改变而导致机会病原体过度生长。

艰难梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，占所有AAD的15％ -20％。特别地，这种生物体在具有肠炎的AAD病例及在所有具有伪 膜的那些病例中可以大量分离到。其在自然环境中广泛存在，可以存 活相当长的时间，经粪-口途径传播至易感人群。据信其是婴幼儿正 常菌群的一部分，且可以在大约5％健康成人及直至1/3的无症状或 群居的住院患者中分离。

AAD的临床表现可以是从轻度腹泻至暴发性肠炎³。艰难梭菌 肠炎的严重性看来受许多因素影响，包括年龄、并存疾病、宿主免疫 应答及降低肠蠕动剂的应用。令人感兴趣地，细菌基因型和毒素产生 看来起很小作用⁴。所述疾病的主要症状是腹泻，通常在治疗期间发 生，但是在停止应用抗生素之后8周仍可以出现。在大多数AAD病 例中，患者具有稀便、轻度肠炎症状，无全身症状。所述腹泻对支持 措施和停止应用抗生素迅速作出响应。

艰难梭菌在1935年首次阐述⁵，但是直至二十世纪七十年代后 期才将其与抗生素相关性腹泻联系起来。艰难梭菌是一种形成孢子的 革兰氏阳性厌氧杆菌，产生至少两种外毒素：毒素A(主要是肠毒素) 和毒素B(主要是细胞毒素)。该生物体在人体中导致胃肠道感染，从 无症状建群至严重腹泻、伪膜性肠炎(PMC)、中毒性巨结肠、结肠穿 孔及死亡^6，7，8。产生艰难梭菌建群的第一步是结肠的正常菌群破坏， 通常是由于抗生素所致，或者罕见地由于抗肿瘤或免疫抑制剂引起 ^9，10。建群通过粪-口途径发生；摄食的艰难梭菌孢子幸免于胃酸屏障 并在结肠中萌发^11，12。CDAD的症状可以在抗生素治疗的第一天即开 始，或者直至抗生素治疗结束几周后才开始¹³。最近揭示了如下两种 因素增加在医院获得艰难梭菌建群的患者中症状性疾病发生的可能 性：其它疾病的严重性，毒素A的血清IgG抗体水平降低¹⁴。这些结 果提示预先存在的抗毒素A抗体可改善疾病的严重性，且这种免疫 作用可以有效地预防和控制医院CDAD。

为清楚起见，如果患者出现由艰难梭菌导致的症状性疾病，我们 则定义该患者患有艰难梭菌相关性疾病(CDAD)。腹泻患者粪便中艰 难梭菌毒素的存在通过最普遍认可的诊断方法检测。

艰难梭菌是大约25％的抗生素相关性腹泻的致病因素¹⁵。大多数 艰难梭菌相关性疾病发生在医院或者长期护理机构(每100,000床日 (occupied bed-days)25-60的比例)，导致在美国每年超过300,000 个病例，在许多欧洲国家估计是类似比例。其可以使住院时间延长2 周，每个病例额外费用$6,000-$10,000^{16，17，18，19，20，21}。

一旦停止使用刺激的抗生素，CDAD患者的腹泻可自然减轻，对 于一些病情轻微的患者不需要进行特别治疗^22，23。然而，对于几乎所 有出现症状的患者需要用抗生素万古霉素或甲硝唑进行标准治疗。尽 管甲硝唑目前未被FDA许可用于治疗CDAD，但是由于使用万古霉 素的较高成本及万古霉素抗性细菌的出现，因此甲硝唑被广泛用作一 线治疗药剂。由于甲硝唑有效破坏正常的肠道菌群，因此其也使患者 倾向于甲硝唑抗性肠球菌建群²⁴。口服甲硝唑(250mg，4次/天；或 者500mg，3次/天)10-14天通常是足够的。对于不能耐受口服甲硝唑、 甲硝唑治疗失败、妊娠患者及也许病情严重的那些患者给予口服盐酸 万古霉素(125mg，4次/天)10-14天。艰难梭菌结肠炎的第一次复发/ 再发可以再经10-14天口服甲硝唑或万古霉素疗程进行治疗。

用万古霉素或甲硝唑治疗CDAD通过改变正常的保护性肠道菌 群而导致恶性循环。结果，20％经治疗的首次发病患者通常再停止治 疗两周内复发CDAD^{25，26，27，28}。在CDAD的治疗方案中排除抗生素的 另一个益处是降低了对于细菌抗性的选择压力。已经明确揭示了万古 霉素和甲硝唑选择革兰氏阳性球菌，如VRE。回顾性流行病学调查 已经将肠道VRE建群与广谱抗生素如头孢菌素、氟喹诺酮类抗菌药 物与甲硝唑的应用联系起来²⁹。肠道VRE建群提供了医院内这种病 原体的贮主。许多VRE菌株是多抗性的，很少选择用于治疗危及生 命的全身感染。艰难梭菌患者，也许由于其先前的抗生素治疗，看起 来特别易受VRE建群和感染影响^30，31。对VRE建群的治疗是控制医 院感染措施的重要组成部分。因此，非常需要降低VRE在一般患者 群和在艰难梭菌患者中建群的风险的治疗方案。万古霉素和甲硝唑抗 性艰难梭菌的潜在出现呈现了应用抗生素治疗这种疾病的另一风险 因素。目前，抗生素抗性艰难梭菌的出现是偶发的，但是在接近12％ 的临床分离菌中已经报道³²。

发明概述

本发明涉及通过给予有效量的产脂肽的芽孢杆菌细菌而预防肠 道病变如抗生素相关性腹泻、艰难梭菌获得性腹泻、炎症性肠病和胃 肠道疾病。所述芽孢杆菌细菌可以作为益生菌给予，且可以组合其他 益生菌如菊糖一起给予。

使用生物化学方法、特别是API 50 CBH/L，一种优选的芽孢杆 菌被推定鉴别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。使用16S rRNA， 该优选的芽孢杆菌也被推定鉴别为枯草芽孢杆菌。使用gyrA，该优 选的芽孢杆菌被推定鉴别为解淀粉芽孢杆菌。进行gyrA分析之前， 该优选的芽孢杆菌保藏在ATCC中，且被鉴别为枯草芽孢杆菌。

本发明还涉及具有SEQ ID NO.1所示16S rRNA序列的分离的细 菌菌株，并涉及与SEQ ID NO.1具有90％、80％、70％、60％及50％ 同源性的分离的细菌菌株。

本发明还涉及具有SEQ ID NO.2所示部分gyrA序列的分离的细 菌菌株，并涉及与SEQ ID NO.2具有90％、80％、70％、60％及50％ 同源性的分离的细菌菌株。

本发明还涉及具有SEQ ID NO.3所示部分gyrA序列的分离的细 菌菌株，并涉及与SEQ ID NO.3具有90％、80％、70％、60％及50％ 同源性的分离的细菌菌株。

本发明进一步涉及被鉴别为ATCC菌株PTA-6737的芽孢杆菌菌 株。

优选的芽孢杆菌PB6由于其多方面独特的特性而可以解决一些 尚未能满足的医学需求。

附图简述

图1是芽孢杆菌PB6(1)对于产气荚膜梭菌(C.perfringens) ATCC13124(2)和艰难梭菌ATCC9689(3)的拮抗作用的图示。

图2是芽孢杆菌PB6对于艰难梭菌N API/027的拮抗作用的图 示。

图3是芽孢杆菌PB6对于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) ATCC55918的拮抗作用的图示。

图4是表面活性素(surfactin)的化学结构图示。

图5是用不同治疗方法治疗的患有CDAD的仓鼠的存活率百分 比图示。

图6是芽孢杆菌PB6的1466-bp 16S rRNA基因序列(第27-1492 位核苷酸)。

图7是芽孢杆菌PB6的1023-bp部分gyrA序列(第43-1065位核 苷酸)。

图8是得自芽孢杆菌PB6的部分gyrA序列测序的801-bp共有序 列。

图9是编码溶血素BL的PCR产物(1650-bp)的检测凝胶图；泳 道1，GeneRuler^TM质量梯(3000，2000，1500，1200-bp)；泳道2，芽孢 杆菌PB6；泳道3，大肠杆菌ATCC 25922；泳道4，蜡状芽孢杆菌ATCC 49064；泳道5，蜡状芽孢杆菌ATCC 11778。在除了泳道4和5之外 的任何泳道中均检测到相应于1650-bp PCR产物的未扩增的条带。

图10是编码非溶血性肠毒素(Nhe)的PCR产物(1437-bp)的检测 凝胶图。泳道1，GeneRuler^TM质量梯(3000，2000，1500，1200-bp)；泳 道2，芽孢杆菌PB6；泳道3，大肠杆菌ATCC 25922；泳道4，蜡状 芽孢杆菌ATCC 49064；泳道5，蜡状芽孢杆菌ATCC 11778。在任 何泳道中均检测到相应于1437-bp PCR产物的未扩增的条带。

图11是编码肠毒素K(EntK)的PCR产物(1400-bp)的检测凝胶图。 泳道1，芽孢杆菌PB6；泳道3，大肠杆菌ATCC 25922；泳道4，蜡 状芽孢杆菌ATCC 49064；泳道5，蜡状芽孢杆菌ATCC 11778；泳 道6，GeneRuler^TM质量梯(3000，2000，1500，1200-bp)；在任何泳道中 均检测到相应于1400-bp PCR产物的未扩增的条带。

图12是示出蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(1)对于产气荚膜梭 菌ATCC13124(2)和艰难梭菌ATCC9689(3)无拮抗作用的照片。

图13是示出芽孢杆菌PB6对于空肠弯曲杆菌ATCC 33291的拮 抗作用的照片。

图14是示出蜡状芽孢杆菌对于空肠弯曲杆菌ATCC 33291无拮 抗作用的照片。

优选的实施方案详述

PB6是分离自自然界且未经遗传修饰的一种专利细菌菌株。使用 核糖体分型(ribotyping)技术，这个细菌被鉴别为枯草芽孢杆菌菌株。 DNA:DNA杂交研究表明芽孢杆菌PB6菌株也许更可能是解淀粉芽 孢杆菌，关于此在下文进一步描述。

如本说明书中所用，术语预防是指一种医学或公共卫生方法，其 目的在于预防而不是治疗或治愈疾病。如本说明书中所用，术语治疗 是指一种医学或公共卫生方法，其目的是治疗或治愈疾病。如本说明 书中所用，术语协同化合物是指增强为了预防或治疗疾病或健康状况 而给予患者的芽孢杆菌细菌的预防或治疗效力的化合物。如本说明书 中所用，脂肽是指既含有脂质也含有蛋白质的分子，包括含有几个氨 基酸及一或多个脂肪酸的表面活性分子。表面活性素、伊枯草菌素 (iturin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、baillomycins、bacillopeptins、 芬枯草菌素(fengycin)和plipastatins是脂肽的几个例子。

实施例1：芽孢杆菌PB6对抗艰难梭菌AAD和CDAD的效力

检测芽孢杆菌PB6对于产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难梭菌 ATCC9689的拮抗作用。

芽孢杆菌PB6对于产气荚膜梭菌ATCC 13124和艰难梭菌 ATCC9689具有拮抗作用。在这两个菌种的平板上的条划线的交叉点 观测到清晰的环带。所述检测平板的例子在图1中示出。

芽孢杆菌PB6对于艰难梭菌N API/027具有拮抗作用。这种艰难 梭菌菌株与一些高度危险的疾病爆发相关联，且示出对于抗生素的抗 性。所述检测平板的例子在图2中示出。

为了确定芽孢杆菌PB6的二级代谢物的抗微生物作用，发酵该 细菌，并通过二乙醚提取发酵产物。分离有机层，在真空中浓缩，再 溶解于DMSO中以进行筛选。

所述提取物对于产气荚膜梭菌的最小抑制浓度(MIC)为 2.5-5μg/ml，对于艰难梭菌的最小抑制浓度为5-10μg/ml(表1)。

表1：芽孢杆菌PB6的粗提物对于产气荚膜梭菌、艰难梭菌和空 肠弯曲杆菌筛选结果

结果证实芽孢杆菌PB6在体外抑制空肠弯曲杆菌的生长。所述 检测平板的例子在图3中示出。芽孢杆菌PB6的发酵产物的醚提取 物对于空肠弯曲杆菌的MIC是25-100μg/ml。

空肠弯曲杆菌与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)极密切相关， 且因此很可能芽孢杆菌PB6对于幽门螺杆菌也具有活性。另外，在 文献中可以发现芽孢杆菌细菌(例如枯草芽孢杆菌)具有对抗幽门螺杆 菌的活性³³。

对所述粗提物的进一步研究表明具有对抗梭菌的活性的分子是 环状脂肽表面活性素(图4)。

当确定纯的表面活性素(纯化自本发明发酵产物或者购自Sigma) 对抗梭菌的活性时，发现较高的MIC。对抗产气荚膜梭菌的MIC经 证实为10-25μg/ml。显然，所述纯的活性化合物较所述粗提的发酵产 物的活性低。这可能是由于提取物中存在增强表面活性素活性的辅因 子所致。这个结论已经通过实验表明，其中将表面活性素的MIC与 组合无活性化合物的表面活性素的MIC进行对比。所述无活性的化 合物分离自本发明中用于分离表面活性素的相同提取物。这种组合的 MIC为1-10μg/ml。

实验结果表明当用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理芽孢杆菌PB6的滤 液时，其对抗梭菌的活性显著降低。由于胃蛋白酶和胰蛋白酶是在胃 和胰腺的粘膜层中产生的，因此显然经口服给予表面活性素将导致其 活性明显丧失。其中表面活性素已经在37℃与0.1N HCl一起保温30、 60和90分钟的其他实验中表明酸性条件(如在胃中的条件)导致活性 丧失(表2)。因此，给予芽孢杆菌PB6(最终以孢子形式给予)更有效地 获得表面活性素或其他脂肽的在肠道中的更有效浓度。

表2：酸性保温条件对于表面活性素对抗产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抗菌活性的影响结果

除了产生抗微生物二级代谢物之外，芽孢杆菌PB6孢子还能在 肠道中萌发，并因此可以通过竞争性排除而抑制病原体。

芽孢杆菌、特别是枯草芽孢杆菌，是最有效和有益的促进健康和 免疫刺激细菌之一。根据一些临床研究报道，摄入的芽孢杆菌的细胞 壁成分能激活几乎所有的人免疫防御系统，包括激活至少三种特异性 抗体(IgM、IgG和IgA)，这三种抗体高效对抗经常试图侵犯并感染人 免疫系统的许多有害病毒、真菌和细菌病原体。已经揭示了枯草芽孢 杆菌刺激B和T淋巴细胞及巨噬细胞。另有证据表明枯草芽孢杆菌 孢子可在体内发挥免疫调节作用。已经有关于在暴露于孢子之后噬斑 形成细胞对于T细胞依赖性抗原的应答增加以及不同的吞噬细胞功 能增强的报道^{34，35，36，37，38，39，40，41}。

在一项研究中(表3)，观测到在用不同水平的解淀粉芽孢杆菌 PB6喂食的肉食鸡比用抗生素治疗和阴性对照组中的吞噬作用增强。

由此可以推断解淀粉芽孢杆菌也具有免疫刺激作用。

表3：芽孢杆菌PB6对于雄性肉食鸡中免疫应答的影响

 

治疗吞噬作用阴性对照组6.59阳性对照组(100mg/kg杆菌肽锌)6.23PB6(10⁷CFU/T)11.82PB6(10⁸CFU/T)8.85

使用可商购的免疫测定(TECRA和Oxoid)评估芽孢杆菌PB6的滤 液中溶血性、非溶血性肠毒素和肠毒素K的存在。对相同的滤液进 一步进行针对Vero和HEp-2细胞系的细胞毒性测试。最后，使用基 于PCR的方法证实芽孢杆菌PB6中具有可能的产肠毒素能力的基因 的存在。在这两个商业免疫测定中使用HbI或Nhe肠毒素及抗体观 测到无免疫交叉反应性。使用Vero和HEp-2细胞分析也观测到无细 胞毒性。在使得可以检测已知的产毒素蜡状芽孢杆菌菌株的相同条件 下，芽孢杆菌PB6菌株不产生溶血性、非溶血性肠毒素和肠毒素K。

对芽孢杆菌PB6的体内毒性也进行了测试。因此，从发酵产物 中产生含有10¹⁰cfu/g芽孢杆菌PB6的喷雾干燥的产物。

喷雾干燥的解淀粉芽孢杆菌在Wistar大鼠中的毒性研究

设计并实施第一项研究以确定喷雾干燥的芽孢杆菌PB6产物 (10¹⁰cfu/g)在Wistar大鼠中的急性口服毒性。对共5只雄性和5只雌 性动物经口服给予5000mg/kg所述产物(于双蒸馏水中的悬浮液，使 用剂量体积为10ml/kg)。对照组由5只雄性和5只雌性动物组成，接 受10ml/kg双蒸馏水。在以5000mg/kg剂量治疗的动物中观测到无 死亡。50％接受芽孢杆菌PB6的动物较对照组更具活性。用芽孢杆 菌PB6治疗的动物无一患有腹泻。在尸检之后，在这两组动物的任 何器官中均未见病理学改变。因此，发现口服芽孢杆菌PB6产物在 Wistar大鼠中的最大无致死量(LD₀)和LD₅₀高于5000mg/kg。

结论：发现在Wistar大鼠中干燥的芽孢杆菌PB6(10¹⁰cfu/g)经口 服途径给予的最大无致死量(LD₀)和LD₅₀高于5000mg/kg。

在Wistar大鼠中重复给予28天芽孢杆菌PB6的经口毒性

设计并实施这项研究以确定在Wistar大鼠中重复给予(28天)芽孢 杆菌PB6(10¹⁰cfu/g)的口服毒性。在每组中，经口服给予6只雄性和 6只雌性动物250、500或1000mg/kg所述产物，共给予28天。对照 组也由6只雄性和6只雌性动物组成，其接受10ml/kg双蒸馏水，共 28天。在第29天，处死这些动物。

这项研究还包括也分别具有6只雄性和6只雌性动物的对照载体 组和高剂量组的两个可逆组。所述高剂量组接受药物直至第28天， 从第29天至42天不予治疗，在第43天处死。对照载体组接受10ml/kg 蒸馏水直至第28天，从第29天至42天不予治疗，在第43天处死。

结论：发现在大鼠中28天毒性试验中芽孢杆菌PB6(10¹⁰cfU/g) 的无观测到不良事件的水平(NOAEL)高于1000mg/kg。

芽孢杆菌PB6在新西兰白兔中局部刺激研究(皮肤和眼睛)

在这个研究中使用共3只新西兰白兔(任意性别)-相同动物进行 皮肤和眼睛刺激研究。在这两项研究中保持最小5天的间隔时间。使 用1g芽孢杆菌PB6(10¹⁰cfu/g)作为贴片贴敷于皮肤上进行皮肤刺激， 将100μl的10％芽孢杆菌PB6悬浮液滴入左眼中进行眼睛刺激。

在对3只兔除去毛发后，将测试的PB6贴片贴敷于背外侧部位 皮肤上。将10％ PB6悬浮液滴入3只兔的左眼中。在应用后4小时， 将所述测试贴片从动物皮肤上除去。在将测试悬浮液滴入左眼之后， 使眼睑闭合2-3秒。

在除去测试PB6贴片之后1、24、48和72小时观测动物的皮肤 刺激情况并评分。在滴入PB6悬浮液之后相同的时间点，对眼睛刺 激情况进行评分。

结论：皮肤：当应用1g芽孢杆菌PB6(10¹⁰cfu/g)作为贴片时，观 测到无刺激性。

眼睛：当滴入100μl的10％芽孢杆菌PB6(10¹⁰cfu/g)悬浮液时， 观测到无刺激性。

解淀粉芽孢杆菌PB6在小鼠中的红细胞微核试验

设计并实施这项研究以检测测试物质诱导的Swiss albino小鼠染 色体或有丝分裂器的损害。经口服给予共5只雄性和5只雌性动物 2500和5000mg/kg测试物质，对照载体组由5只雄性和5只雌性小 鼠组成，其经口服接受10ml/kg双蒸馏水。阳性对照组(5只雄性+5 只雌性小鼠)经口服接受40mg/kg环磷酰胺。

在各自的时间点(对照组，2500mg/kg PB6环磷酰胺在24小时， 5000mg/kg PB6在24和48小时)通过过量的CO₂处死所述动物，切 下股骨，制作骨髓涂片，用Giemsa和May-Greunwald染色，在显微 镜下通过计数2000个不成熟的红细胞观察微核发生率。

通过计数至少200个红细胞，确定每只动物的全部(不成熟+成熟) 红细胞中不成熟红细胞的百分比。

结论：2500 & 5000mg/kg剂量的芽孢杆菌PB6(10¹⁰cfu/g)在小鼠 中不显著诱导微核化的多色红细胞。

经口服给予芽孢杆菌PB6在治疗患有CDAD的叙利亚金黄仓鼠(Golden Syrian hamster)的体内效力的确定研究设计

42只雄性叙利亚金黄仓鼠得自National Centre for Laboratory Animal Sciences，NDST(Hyderabad，India)。在治疗开始时，所述动物 为12-14周龄。在其到达实验室时，在兽医监督下对动物进行全面临 床测试，以保证其处于良好状态。使动物适应研究条件至少7天。在 试验开始时分配动物组成研究组之前再次记录体重。将动物单独圈养 在聚碳酸酯笼子中(290×22×140mm，L×W×H)。动物的房间及测 试房间的条件如下：温度，22±4℃；相对湿度，50±20％；光/暗周 期，12小时/12小时(光亮时间07:00-19:00)；通风，大约7次/小时过 滤的非再循环空气。所有动物均随意摄食Hamster Pellet Feed(NIN， Hyderabad)和Aquaguard纯净水。

将动物分为7组(A-G)。在A-E组中，通过在第0天经口服给予 10000 CFU′s的艰难梭菌ATCC 9689而诱导艰难梭菌相关性腹泻，随 后在第1天在耳后躯干部位皮下注射100mg/kg氯林肯霉素。A组动 物不再进行治疗。

B组从第2天至第6天每天经口管饲法给予动物50mg/kg万古 霉素治疗。C、D和E组从第1天只第6天分别经口管饲法给予动物 1.5×10⁸、1.5×10⁷和1.5×10⁶CFU/Kg剂量的PB6治疗，每天3次， 每次间隔4小时(第一次于9.30am给予)。在第1天，在注射氯林肯 霉素之后1小时给予第一剂PB6。在F和G组，从第1天至第6天 经口管饲法给予动物的1.5×10⁹CFU/Kg的PB6治疗，每天3次，每 次间隔4小时(第一次于9.30am给予)。第6天是进行治疗的最后一 天。每天观测两次临床症状和死亡率，直至第15天。腹泻症状评分 为轻度、中度和重度标准。在第0、7和14天记录动物体重。在第1、 2和7天使用Immunocards(Meridian life sciences)测试A-E组动物的 粪便中梭菌毒素A和B的存在情况。在第1天，在给予氯林肯霉素 之前取粪便样本。在第2和7天，在第二次与第三次给予治疗剂之间 取粪便样本。

测试制备物

根据厂商指导接种含有艰难梭菌ATCC 9689的Culti-loop (Oxoid，Basingstoke，England)，用盐水稀释肉汤以获得10000CFU/ml 溶液。将盐酸氯林肯霉素(Pharmacia，Puurs-Belgium)和万古霉素 (Neon Laboratories，Bombay，India)悬浮于双蒸馏水中，浓度分别为10 和50mg/ml。氯林肯霉素和万古霉素的剂量体积分别为10和1ml/Kg 体重。将干燥的PB6(Kemin Consumer Care，Des Moines，USA)-一种在 麦芽糖和环糊精载体中干燥的芽孢杆菌PB6发酵肉汤-悬浮于双蒸馏 水中，浓度为1.5E8、1.5E6和1.5E5 CFU/ml。剂量体积为10ml/Kg 体重。在每次给予之前制备新鲜制品。基于最后的个体体重给予氯林 肯霉素、万古霉素和PB6。在每次给予之前用力搅拌所述制品。

结果与讨论

在给予氯林肯霉素之后大约6小时，在未治疗组的3只动物及在 万古霉素治疗组的1只动物中观测到轻度腹泻。在C、D、E组，在 给予氯林肯霉素之后大约1小时接受第一剂PB6的动物中，在相同 日期无一动物示出任何腹泻迹象。在随后的两天，治疗组之间患有腹 泻的动物数目及腹泻的严重性呈现不同程度发展趋势(表4)。其中诱 导艰难梭菌相关性腹泻的所有组均示出腹泻迹象。在用万古霉素和高 剂量PB6治疗组中腹泻强度较低。在未治疗组以及在低和中等剂量 PB6治疗组，大便呈水样，且整个腹部区域均呈潮湿状态。

表4：诱导CDAD的组中第1-3天腹泻动物数目及其评分

+：轻度；++中度；+++：重度

在第3天结束时，其中诱导CDAD组的所有动物均仍存活，但 是其中一些示出严重腹泻症状。在第4天，即给予氯林肯霉素之后3 天，第一次出现动物死亡。在治疗时期结束时，即第6天，未治疗组 所有动物均死亡。万古霉素和高剂量PB6治疗组中动物存活率最高， 其中4/6的动物存活(图5)。

在第7天，在其中诱导CDAD的所有组中均观测到平均体重降 低。关于这种体重降低显然存在PB6的反向(inverse)剂量应答关联(表 5)。接受低剂量PB6的动物与接受高剂量PB6的动物相比体重丧失 平均多3倍。万古霉素治疗组体重丧失最少。其中未诱导CDAD的 两个组中平均体重随着时间的推移而略有增加。

表5：平均体重(g)和体重增长百分比(％)

*无资料，所有动物均死亡

a，b，c，d，e：在同一栏内具有不同上标的值之间具有显著性 差异(P<0.05，最小显著差异)。

在第1、2和7天检测诱导CDAD的动物的粪便样本中梭菌属毒 素A和B的存在。正如所期望的，显示高死亡率和平均体重显著降 低的实验组动物也具有高百分比的这些毒素，再次呈现与PB6的反 向剂量应答关系。

表6：其粪便中存在艰难梭菌毒素A或B的动物数目

*无数据，所有动物均死亡。

结论

设计并实施这项研究以评估芽孢杆菌PB6在氯林肯霉素诱导的 CDAD仓鼠模型中治疗CDAD的效力，所述模型是这种感染的经充 分确定及高度敏感的模型。在诱导CDAD之后未经治疗的仓鼠均发 生腹泻、体重丧失及5天内死亡。用PB6治疗产生剂量相关的应答。 应用最高剂量PB6的实验组中腹泻、体重减轻和死亡率最低。在停 止治疗时，最高剂量PB6治疗组示出在帮助仓鼠从氯林肯霉素诱导 的CDAD中存活的效力与万古霉素相同。

经口服给予芽孢杆菌PB6的有效成分评估

关于益生菌(例如菊糖)的新饮食观念在营养学家、医生、食品加 工业和消费者中逐步普及。关于益生菌食品最规范认可的解释是：益 生菌是一种选择性发酵成分，其可以特异性改变胃肠道菌群的组成成 分和活性，对宿主的健康有益。如果被分类作为食品中的益生菌成分， 则该成分必须：1)抵抗胃和小肠中食物酶的消化(水解)；2)以化学完 整形式进入结肠，随后经历部分或完全发酵；3)刺激促进健康的肠 道细菌的活性生长和/或活性。益生菌刺激的细菌生长的健康益处是 广泛的，包括对结肠癌和病原体具有积极作用、降低甘油三酯、增加 Ca和Mg的吸收、及增加排便频率和粪便重量。菊糖是一种多分散 性β(2→1)果聚糖，链长度为2-60单位。菊糖与低聚果糖的果糖分子 之间独特的连接将其与典型的碳水化合物区分开来。它们抵抗人体食 物酶的消化及在小肠中吸收，但是由结肠菌群水解与发酵，并因此分 类为益生菌膳食纤维^{42，43，44，45，46}。

益生菌刺激促进健康的肠道细菌的活性生长和/或活性的事实使 得非常感兴趣地将其与益生菌如芽孢杆菌PB6一起给予人体。

另外，解淀粉芽孢杆菌PB6不抑制肠道菌群中的“有益健康” 的细菌如乳杆菌(LactoBacillus spp.)和双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)的生长。

材料与方法

分离的PB6菌株的鉴别

分离的PB6菌株是革兰氏阳性杆菌，且具有过氧化氢酶。 Malachite Green染色证实这种微生物具有内生孢子，且是孢子形成 菌。这种微生物也是“游动孢子(swamer)”，在长期保温的基础上趋 于传播至整个琼脂表面。在与已知芽孢杆菌(Bacillus spp.)的相关性 方面，所述分离的芽孢杆菌菌株具有92.0％ ID。基于API生物化学 指标，推定芽孢杆菌PB6菌株为枯草芽孢杆菌。因此所述芽孢杆菌 PB6菌株以保藏号ATCC-PTA 6737保藏，在此命名为枯草芽孢杆菌。 于2002年11月27日申请的美国专利申请系列No.10/306,365在此 并入作参考。

16rRNA基因测序

完善并排列对比几乎完整的芽孢杆菌PB6菌株的16rRNA序列 (SEQ ID NO.1，图6)。

GyrA测序

通过两个不同组获得的PB6的部分gyrA序列示于图7(SEQ ID No.2)和图8(SEQ ID NO.3)。

DNA：DNA杂交

根据Ezaki等所述方法⁴⁷加以修改的方法，在严格条件(在40℃) 下进行杂交。DNA同源百分比是最少4次杂交的平均值。括号中的 数字是倒数值之间的差异。使用这种技术，平均标准误差为14单位 ⁴⁸。结果示于表7。

表7：DNA同源百分比％

发现芽孢杆菌PB6、LMG 9814^T与LMG 22478^T之间的DNA同 源百分比高于70％，这是通常公认物种划分(species delineation)的界 限⁴⁹。

从这些结果中看出B.velezensis和解淀粉芽孢杆菌属于相同基因 种，因此是主观异名，由此根据命名法则42，最老的法定名称应加 以保留，即解淀粉芽孢杆菌；芽孢杆菌PB6(ATCC-PTA 6737)可以 被更准确地分类为解淀粉芽孢杆菌菌种。

诵讨划线测定(streak-line assay)检测解淀粉芽孢杆菌的拮抗性质

将解淀粉芽孢杆菌PB6直线接种于胰蛋白胨大豆血平板(Oxoid， Belgium)上，在有氧条件下在37℃保温24小时后，将不同的指示菌 株垂直接种于所述芽孢杆菌PB6培养物。使用Anaerogen Pak(Oxoid， Belgium)于厌氧条件下保温接种梭菌种的平板。在37℃保温过夜后， 通过划线交叉处周围透明带的出现而评估拮抗作用，表示一种生物体 对另一种生物体的抑制作用。

芽孢杆菌PB6的二级代谢物的提取与抗微生物筛选

将芽孢杆菌PB6在补加了5％绵羊血液(Oxoid，Belgium)的胰蛋白 胨大豆琼脂平板上在37℃生长24小时。这个培养物用于接种补加了 0.6％酵母提取物(Oxoid，Belgium)的100ml胰蛋白酶大豆肉汤中。在 摇床(100rpm)中在37℃保温24小时之后，将该肉汤与等量的二乙醚 (Acros，Belgium)混合(3次)。在提取代谢物之后，将两层分离，收集 乙醚部分并在4000rpm离心5分钟。

之后，使用旋转蒸发器真空除去所述溶剂。称重剩余物并将其溶 解于二甲亚砜(Acros，Belgium)中，获得终浓度为10000μg/ml粗提物。 在1/11比率的DMSO/水混合物中制成进一步的稀释液(500、250、100、 50、25和10μg/ml)。最后，将25μl每种稀释液用移液管移至微滴定 平板(Labsystems，Finland)的孔中。

细菌菌株产气荚膜梭菌ATCC13124(C 1600L，Oxoid，Belgium)和 艰难梭菌ATCC9689(C1610L，Oxoid，Belgium)以冻干的culti-loops 形式购买，根据厂商指导进行培养。从这两个菌株培养物中，在厌氧 基础肉汤(Oxoid，Belgium)中制备McFarland标准(A_625nm＝0.100)。将 250μl这种标准加入10ml新鲜厌氧基础肉汤中，将225μl这种培养物 经移液管移至所述孔中。在每个孔中获得最终细胞密度为5×10⁵cfu/ml。使用在密封塑料袋中的Anaerogen Compact(Oxoid，Belgium) 将该微滴定平板在厌氧条件下保温18小时(产气荚膜梭菌)和48小时 (艰难梭菌)。在保温之前和之后，使用Bioscreen C分析仪(Labsystems， Finland)测量每个孔的光密度(OD)。白光(Wide Band)用于测量OD。 一式两份进行检测，培养基对照，培养基加接种体(阴性对照组)和阳 性对照组也同样；测试混合物组中包括三种浓度(0.1、0.5和1.0μg/ml) 的万古霉素(Fluka，Belgium)。最小抑制浓度(MIC)是其中无生长出现 或检测到OD不增加的最低浓度。

辅因子对于表面活性素的增强作用的确定

通过制备TLC(Kieselgel 60，20×20cm，2mm层厚)分离解淀粉芽 孢杆菌PB6发酵产物的乙醚提取物。使用的洗脱液是己烷/丙酮 (30/70)。在Rf 0-0.33带中分离表面活性素。分离自这个带的表面活 性素对抗产气荚膜梭菌的MIC为10-25μg/ml。在另一个带(Rf 0.33-0.76)中，发现对抗产气荚膜梭菌无活性的一或多种产物(MIC> 100μg/ml)。当检测这两个带的产物组合时(每种提取物的最终浓度为 10μg/ml)，产气荚膜梭菌无生长。当组合这些对自身无反应性的产物 时，表面活性素的MIC降低至低于10μg/ml。

酸性处理对于表面活性素的抗微生物活性的作用的确定

制备750μg/ml表面活性素(Sigma)于乙腈/0.1N HCl(1/1；v/v)中 的溶液。将0.5ml这种溶液在37℃保温30、60或90分钟，之后加 入0.25ml的0.1N NaHCO₃溶液，使用旋转振荡混合器混合该混合物。 对所有溶液筛选其对抗产气荚膜梭菌的活性。

芽孢杆菌PB6产生肠毒素的确定

细菌菌株与培养条件：将芽孢杆菌PB6在补加了0.6％酵母提取 物(Oxoid Limited，England)的100ml胰蛋白酶大豆肉汤(Becton Dickenson and Company，Cockeysville，MD)(TSBYE)中生长，并在37 ℃在摇床(100rpm)中保温。将一种产生毒素的菌株蜡状芽孢杆菌 ATCC 11778也在摇床中在37℃于TSBYE中生长。相似地，将不产 生毒素的菌株蜡状芽孢杆菌ATCC 49064和大肠杆菌ATCC 25922也 在有氧条件下在37℃于TSBYE中生长。这项研究中使用的所有细菌 菌株均每周一次移至新鲜TSBYE中，然后在冰箱中保持在4℃培养。 将新鲜生长的菌株再悬浮于40％甘油中，在-80℃冰箱中长期贮存。

肠毒素产生：将1-ml过夜测试培养物接种于补加了1％葡萄糖的 50ml脑心浸液(BHI)(BHIG)中，在32℃于摇床(100rpm)中保温6小 时³¹。在5000×离心10分钟以沉淀细菌细胞，收集上清进行Vero细 胞的细胞毒性研究³¹。然后使用直至80％饱和的硫酸铵溶液(561g/L) 使上清中的蛋白质浓缩10倍³³。在10000×g离心20分钟之后，轻 轻倒出上清，将蛋白质沉淀再悬浮于2.5ml磷酸盐缓冲液(20mM； pH 6.8)中。剩余的硫酸铵通过用相同缓冲液在4℃透析6小时而除去。 使用磷酸盐缓冲液(20mM；pH 6.8)将透析的蛋白质溶液的终体积调 节为初始体积(5ml)的十分之一³¹。

催吐毒素产生：将1ml过夜测试培养物接种于补加1％葡萄糖的 50ml脑心浸液(BHI)(BHIG)中，在摇床(250rpm)中在32℃保温6小 时。在4℃在2000×g离心10分钟以沉淀细菌细胞³¹。收集上清，然 后在121℃高温灭菌15分钟以除去不耐热的肠毒素²⁰。收集可能具有 热稳定性催吐毒素的热处理滤液，进行HEp-2细胞空泡形成测定²⁰。

Vero和HEp-2细胞的制备：将非洲绿猴肾细胞(Vero)或HEp-2(人 喉癌细胞)作为单层培养物维持在具有Earle′s修改的盐(MEM)的30 ml培养基199中，其含有2mM L-谷氨酰胺、10mM碳酸氢钠、1％ 非必需氨基酸、100UI/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和3ml胎牛血 清(10％)。基于极限必需培养基(Gibco)制备无亮氨酸培养基(MEM)， 其还含有1.8mM CaCl₂、0.4mM MgCl₂、5.0mM KCl、0.12M NaCl、 3.2mM NaH₂PO₄及20mM Hepes(pH7.7)。将Vero或HEp-2细胞在 MEM中在5％ CO₂及37℃条件下保温。Vero或HEp-2细胞的汇合的 单层培养物通过弃去培养基之后用5ml PBS(pH7.7)洗涤进行传代培 养。然后通过加入2ml胰蛋白酶溶液(0.25％胰蛋白酶；0.025％ EDTA) 而将Vero或HEp-2细胞从培养瓶中分离出。释放出的Vero或HEp-2 细胞的水平经显微镜确定，之后加入MEM培养基(8ml)以防止胰蛋 白酶的进一步作用。然后将5-ml等份新鲜经胰蛋白酶消化的Vero或 HEp-2细胞移至含有15ml MEM的新培养瓶中，在5％ CO₂及37℃ 条件下保温。

芽孢杆菌腹泻肠毒素(BDE)可视免疫测定

在检测样本BDE之前，将检测试剂盒(TECRA International Pte Ltd，Chatswood，NSW，Australia)的所有成分均保持在20-25℃。根据厂 商指导，将含有特异于BDE的高亲和性抗体的微滴定平板的孔用试 剂盒中提供的洗涤溶液预浸，在20-25℃静置10分钟。将所述孔倒空， 之后加入含有200μl检测样本和对照样本(阳性和阴性对照)的等份溶 液移至各个孔中。将所述孔在37℃保温2小时。将所述孔洗涤4次， 之后向每个孔中加入200μl结合物等份，在25℃保温1小时。将每个 孔洗涤5次，之后向每个孔中加入200μl底物并在25℃保温30分钟。 30分钟后，将每个孔的生色情况与检测试剂盒中提供的TECRA色卡 进行对比。

Oxoid蜡状芽孢杆菌肠毒素反向被动乳胶凝集法(BCET-RPLA)：

该测试是通过反向被动乳胶凝集法(RPLA)(Unipath，Basingstoke， UK)检测蜡状芽孢杆菌的腹泻肠毒素。将聚苯乙烯乳胶颗粒用经蜡状 芽孢杆菌腹泻肠毒素免疫的兔的纯化的抗血清敏化。试剂盒还提供了 阳性(肠毒素)和阴性(无特异性蜡状芽孢杆菌抗肠毒素的乳胶颗粒)对 照。将含有25μl稀释液和检测或对照(阳性和阴性)样本的等份连续分 配进2个不同系列的V形孔微滴定平板中。然后将含有25μl敏化的 乳胶颗粒和乳胶对照物的溶液分别分配进第一个和第二个系列V形 孔微滴定平板中。在25℃保温20-24小时后，检测每个孔的凝集情况。

细胞毒性测量：将新鲜胰蛋白酶消化的Vero细胞再悬浮于30ml 无亮氨酸的培养基(MEM)中。将1ml Vero细胞悬浮液移至24孔平板 的每个孔中(～5×10⁴个细胞/孔)。细胞用1ml无亮氨酸的MEM洗涤 一次，并在37℃在5％ CO₂下保温2小时。2小时后，除去生长培养 基，每个孔用1ml无亮氨酸的MEM洗涤一次。向每个孔中加入1-ml 预热(37℃)的无亮氨酸MEM，随后立即加入50μl解淀粉芽孢杆菌 PB6、蜡状芽孢杆菌ATCC 11778、蜡状芽孢杆菌ATCC 49064和大 肠杆菌ATCC 25922的上清或滤液。将接种的孔在37℃在5％ CO₂下 保温2小时。保温2小时后，将经上清或滤液处理的Vero细胞用1ml 预热(37℃)的无亮氨酸MEM洗涤一次。向每个孔中加入300μl含有 放射性标记的同位素的溶液(16μl ¹⁴C-亮氨酸于8ml无亮氨酸MEM 中)(Perkin Elmer Asia，Singapore)。将¹⁴C-亮氨酸标记的Vero细胞在 37℃且无CO₂的条件下保温1小时，之后弃去生长培养基。随后，向 含有¹⁴C-亮氨酸标记的Vero细胞的每个孔中加入1ml含有5％三氯乙 酸的等份溶液，之后在25℃保温10分钟。在保温10分钟后，每个 孔中的内容物用1ml的5％三氯乙酸溶液洗涤两次。然后向每个孔中 加入300μl的0.1M KOH，在25℃再保温10分钟。在保温10分钟后， 向每个孔中加入2ml闪烁液。最后，将每个孔中的所有内容物均移至 闪烁试管中。将所有闪烁试管振荡1分钟，之后进行放射性计数。使 用如下公式计算Vero细胞吸收的¹⁴C亮氨酸的抑制百分比。

¹⁴C亮氨酸吸收的抑制百分比＝[(未加入毒素的Vero细胞的cpm-检测样本的cpm)]/[未加入毒素的Vero细胞的cpm]×100％。用于计 算Vero细胞吸收¹⁴C亮氨酸的抑制百分比的cpm需要从背景计数值 (～30-60cpm)中减去。如果在浓缩10倍之后，¹⁴C亮氨酸吸收的抑制 百分比低于20％，则认为无毒素存在。每个试验均一式两份进行。结 果示于表8和9。

表8：细菌滤液对Vero和HEp-2细胞系的作用

^a“-”表示无细胞毒性作用或者未观测到空泡存在

^b“+”表示已经发生Vero细胞破坏或者在HEp-2细胞中空泡形 成。

表9：14C-亮氨酸同位素吸收的抑制百分比％

^a如果在10倍浓缩之后，¹⁴C亮氨酸吸收的抑制百分比小于20％， 则认为检测菌株的毒素是阴性的(SCAN报道)。

^b检测微生物

^c阴性和阳性对照物

^d不产生毒素的菌株。

HEp-2细胞空泡形成测定：将25μl含有来自测试培养物和对照 培养物的溶液在0.15M NaCl溶液中连续稀释(2倍)，交叉分配于96 孔组织培养平板(Gibco Ltd，Uxbridge，UK)的孔中。向每个孔中加入 100μl新鲜的经胰蛋白酶消化的HEp-2细胞，在37℃保温24小时。 一式两份进行所有空泡形成测定。在第6小时和第24小时间隔经显 微镜检测HEp-2细胞中空泡的形成。

基于PCR的方法：确定非溶血性肠毒素(NheB-nheC)^25，26、溶血 素BL(HblD-hblA)^10，11及肠毒素K(EntK)^27，28的PCR引物。NheB-nheC 引物的序列是5′-CGGTTCATC-TGTTGCGACAGC-3′和 3′-GTCCTCGTGTTCGTCTTC-AGC-5′。HblD-hblA的引物序列是 5′CGCT-CAAGAACAAAAAGTAGG3′和3′TCCCTAATGT- CTAAATGTTCCTC 5′。EntK的正向和反向引物的序列分别是 5′GAATTACGTTGGCGAATC3′和3′CGGG-CGGATGGGA5′。将含有 解淀粉芽孢杆菌PB6和产毒素的菌株蜡状芽孢杆菌ATCC 11778和 蜡状芽孢杆菌ATCC 49064的DNA的样本PCR管和阳性对照管置于 Perkin-Elmer热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)中，起始温度设定点为90℃。热循环的条件为1 次94℃、2分钟循环，随后是38次94℃、15秒和70℃、3分钟的循 环。在扩增后，最后在72℃、7分钟进行延伸。需要3小时完成PCR 扩增步骤。然后将等份(15μl)的每种反应产物和15μl DNA标准梯 (500、1031、2000和3000碱基对)在含有0.1μg/ml溴化乙啶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的2％琼脂糖凝胶(Life Technologies Inc.， Gaithersburg，MD)上在180伏电泳1小时。在电泳之后，使用紫外 线透射仪(波长-302nm)(UVP Model White/2 UV；UVP Inc.，Upland， CA)观测所有凝胶，然后使用Polaroid MP-4照相机(Polaroid Corp.， Cambridge，MA)拍照(见图9、图10和图11)。

实施例2：通讨微量肉汤稀释法确定不同益生菌和解淀粉芽孢杆菌PB6的代谢物对抗产气荚膜梭菌和艰难梭菌的抗微生物性质

在这项研究中，我们研究了芽孢杆菌PB6及如下4种可商购的 益生菌的代谢物的抗梭菌性质：(Sanofi-synthelabo)、 (Biodiphar)、Bioplus 2B(Miavit GmbH)和Biosporinum (Dniprofarm)。利用分离自不同益生菌的菌种设置小规模发酵。使用 微量肉汤稀释法针对产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难梭菌 ATCC9689筛选含有所述代谢物的发酵肉汤的乙醚提取物。芽孢杆菌 PB6的代谢物示出显著的抗梭菌性质。最小抑制浓度介于2.5与 5.0μg/ml之间(对于产气荚膜梭菌)及5.0与10.0μg/ml之间(对于艰难 梭菌)。Bioplus 2B和Biosporinum发酵肉 汤的乙醚提取物对于这两种梭菌菌种不具有任何显著的抗菌活性。

尽管梭菌属菌种在自然界普遍存在，但其原则上的生境是土壤及 许多动物和人体的肠道。土壤样本中产气荚膜梭菌、包括其孢子的广 泛存在几乎保证了这种生物体在暴露于灰尘污染、包括许多食品的表 面上的频繁存在⁵⁰。产气荚膜梭菌也是最常分离自除了粪便之外的人 临床样本的菌种。在许多临床状况中遭遇这种菌种，包括简单的伤口 污染至创伤性肌坏死、腹内败血症、血管内溶血、吸入性肺炎、坏死 性肺炎等⁵¹。

艰难梭菌是导致抗生素相关性腹泻(AAD)的主要原因，也是最常 鉴别的导致医院获得性腹泻的原因。在艰难梭菌相关性疾病(CDAD) 中，最初的起始事件包括抗生素治疗期间保护性肠道菌群的破坏。由 于抗生素的水平下降低于抑制浓度，医院病原体如艰难梭菌能生长。 通过粪-口途径发生建群，摄入的孢子幸免于胃酸屏障而存活，开始 在结肠中萌发^52，53。产毒素的以及不产毒素的分离株能形成孢子，并 存在于医院环境中。结果，任一类型孢子均可感染结肠，并且由于缺 乏正常菌群的竞争而可利用可获得的营养物。所述生物体是否附着于 结肠壁还不清楚，但是很可能所述生物体遍及肠腔而生长。随着细胞 生长和溶解，产毒素的菌株产生并释放毒素A和/或B。这种活性与 炎症应答一起产生导致艰难梭菌相关性腹泻和结肠炎的组织病理学 事件^54，55，56。

“益生菌”通常被公认解释为“活的微生物”饲料或食品补剂， 其通过改善其肠道微生物平衡而有益地影响宿主。但是益生菌怎样工 作？益生菌对肠道生态系统的作用以一些有益的方式影响消费者。已 经提出了由益生菌引起的肠道环境改变带来的许多潜在益处，包括： 增加对感染性疾病、特别是肠道感染性疾病的抗性，减少腹泻的持续 时间、降低血压、减低血清胆固醇浓度、降低变态反应等⁵⁷。

建立了本文中描述的对比研究，以对比不同益生菌发酵提取物对 于梭菌属菌种的抗微生物性质。

方法和材料

将芽孢杆菌PB6与分离自(Sanofi-synthelabo)的蜡状 芽孢杆菌菌株在补加了5％绵羊血(Oxoid，Belgium)的胰蛋白胨大豆琼 脂平板上在37℃生长24小时。供给的益生菌Bioplus 2B含有两种 不同的菌种：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DSM5749和枯 草芽孢杆菌DSM5750。将这两个菌种也在补加了5％绵羊血(Oxoid， Belgium)的胰蛋白胨大豆琼脂平板上在37℃生长24小时。将这些培 养物的混合物用于接种补加了0.6％酵母提取物(Oxoid，Belgium)的 100ml胰蛋白酶大豆肉汤。Biosporinum也含有两个菌种，即地衣芽 孢杆菌和枯草芽孢杆菌。这个产物作为于玻璃瓶中的冻干培养物销 售。将一个瓶中的内容物再悬浮于肉汤中，将此混合物用于接种具有 0.6％酵母提取物(Oxoid，Belgium)的100ml胰蛋白酶大豆肉汤。在所 有益生菌均在摇床(100rpm)中在37℃保温24小时后，将所述肉汤与 等量的二乙醚(Acros，Belgium)混合(3次)。在提取代谢物之后，分离 这两层，并收集乙醚部分，在4000rpm离心5分钟。

此后，使用旋转式蒸发器真空除去溶剂。称重剩余物，并将其溶 解于二甲亚砜(Acros，Belgium)中，获得终浓度为10000μg/ml的粗提 物。在1/12的DMSO/水混合物中进一步稀释(500、250、100、50、 25和10μg/ml)。最后，将25μl每种稀释液经移液管移至微滴定平板 (Labsystems，Finland)的孔中。将(Biodiphar)中使用的 Saccharomyces boulardii在Sabouraud葡萄糖琼脂(Oxoid，Belgium)上 在37℃生长48小时。这个培养物用于接种100ml Sabouraud液体培 养基(Oxoid，Belgium)。在摇床(100rpm)中在37℃保温2天后，进行 相同程序提取代谢物。

细菌菌株产气荚膜梭菌ATCC13124(C 1600L，Oxoid，Belgium) 和艰难梭菌ATCC9689(C161OL，Oxoid，Belgium)以冻干的形式购 买，根据厂商指导进行培养。从这两个培养物中，在厌氧性基础肉汤 (Oxoid，Belgium)中制备McFarland标准物(A_625nm＝0.100)。将250μl 这种标准加入10ml新鲜厌氧性基础肉汤中，将225μl这种中间物经 移液管移至平板孔中。每个孔中最终细胞密度为5×10⁵cfu/ml。使用 于密封的塑料袋中的Anaerogen Compact(Oxoid，Belgium)，将此微滴 定平板在厌氧条件下保温18小时(产气荚膜梭菌)和48小时(艰难梭 菌)。在保温之前和之后，使用Bioscreen C分析仪(Labsystems，Finland) 测量每个孔的光密度(OD)。白光(Wide Band)用于测量OD。一式两份 进行检测，培养基对照，培养基加接种体(阴性对照组)和阳性对照组 也同样；测试组中包括三种浓度(0.1、0.5和1.0μg/ml)的万古霉素 (Fluka，Belgium)。最小抑制浓度(MIC)是其中无生长出现或检测到OD 不增加的最低浓度。

结果和讨论

在阴性对照孔中针对这两个菌种均观测到OD显著增加。在含有 1.0和0.5μg/ml万古霉素的孔中未出现生长，0.1μg/ml万古霉素不抑 制产气荚膜梭菌生长。在含有1和2.5μg/ml PB6提取物的孔中，出现 产气荚膜梭菌正常生长。从5μg/ml开始，可以观测到产气荚膜梭菌 不生长。PB6发酵粗提物对于产气荚膜梭菌的MIC介于2.5与 5.0μg/ml之间。对于艰难梭菌，在阴性对照孔中也观测到OB显著增 加。在含有1.0和0.5μg/ml万古霉素的孔中未出现生长，0.1μg/ml万 古霉素不抑制生长，在含有1、2.5和5μg/ml PB6粗提物的孔中，出 现艰难梭菌正常生长。从10μg/ml开始，可以检测到无生长。PB6代 谢物的乙醚提取物对于艰难梭菌的MIC介于5.0与10μg/ml之间。 (蜡状芽孢杆菌)、(S.boulardii)、Bioplus 2B(地 衣芽孢杆菌DSM5749和枯草芽孢杆菌DSM5750)及Biosporinum(地 衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的乙醚提取物在所有测试浓度均不具有 任何显著的抗菌活性。对于测试的两种梭菌菌种，MIC均高于 50μg/ml。这些结果示于表10。

表10：针对产气荚膜梭菌和艰难梭菌筛选所述粗提物的结果

结论

我们研究了B.PB6、(蜡状芽孢杆菌)、(S. boulardii)、Bioplus 2B(地衣芽孢杆菌DSM5749和枯草芽孢杆菌 DSM5750)及Biosporinum(地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)的乙醚提取 物的抗梭菌性质。使用这些菌种进行实验室规模发酵，使用微量肉汤 稀释法技术针对产气荚膜梭菌ATCC 13124和艰难梭菌ATCC9689 筛选乙醚提取物。芽孢杆菌PB6的代谢物具有强抗梭菌性质，MIC 介于2.5至5.0μg/ml之间(产气荚膜梭菌)及5.0至10.0μg/ml之间(艰 难梭菌)。发酵的Bioplus 2B和Biosporinum 的乙醚提取物不具有任何显著对抗产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难 梭菌ATCC9689的作用。

实施例3：芽孢杆菌PB6对抗IBD的效力

已知表面活性素抑制胞浆型PLA2的活性，这是主要参与许多炎 症进程的一种酶⁵⁸。炎症进程的抑制使得产生表面活性素的益生菌非 常感兴趣用于治疗炎症疾病，如炎症性肠病(IBD)。

炎症性肠病是指导致肠道炎症的两种慢性疾病：溃疡性结肠炎 (UC)和Crohn′s病(CD)。尽管所述疾病具有一些共同的特点，但是其 具有一些重要的差异。

CD是一种肠壁的慢性炎症，典型影响肠壁的整个厚度。其最常 见发生在小肠的最低部分(回肠)和大肠，但是其也可以发生在从口腔 至肛门的消化道的任何部分及肛门周围的皮肤。

在近十年中，CD在西方和发展中国家已经成为更普遍的疾病。 其在男性和女性中几乎相同发生，在犹太人中更多见。大多数病例在 30岁之前发生；大多数在14-24岁之间开始。在每个人中，该疾病影 响肠道的特定部位，有时在受影响区域之间存在正常的区域(跳跃区 域)。在大约35％的CD患者中，仅回肠受侵袭。在大约20％的患者 中，仅大肠受侵袭。在大约45％的患者中，回肠和大肠均受侵袭。

CD的病因尚未知。已经针对三种主要的可能性进行研究：免疫 系统功能障碍、感染和饮食。

CD的最常见的早期症状是慢性腹泻、腹痛、发热、食欲下降及 体重降低。CD患者的症状有所不同，但是具有如下四种共有模式：

·伴有右下腹部疼痛和压痛的炎症；

·复发急性肠梗阻，导致肠壁的严重疼痛痉挛、腹部肿胀、便秘 和呕吐；

·炎症和慢性部分肠梗阻，导致营养不良和长期虚弱；

·异常瘘管和脓肿，通常导致发热、腹部疼痛性肿块和严重体重 降低。

UC是大肠发炎及溃疡的一种慢性疾病，导致血便、腹部绞痛和 发热。该疾病可以在任何年龄发生，但是通常在15-30岁之间发生。

与CD不同，UC通常不影响肠壁的全层，且不影响小肠。该疾 病通常在直肠或乙状结肠发生，最后传播至部分或全部大肠。在一些 患者中，大多数大肠在早期即被侵袭。

大约10％看起来具有UC的患者仅发作一次。然而，一部分这种 患者实际上患有未检测到的感染而不是真正的UC。对于大多数患者， UC是一种慢性疾病，其随着时间的推移而变大和变小。UC的病因 仍未知。认为遗传和肠道中过度活性的免疫应答是主要的致病因素。

经口服给予芽孢杆菌PB6在治疗大鼠TNBS诱导的结肠炎(人结肠炎模型)中的体内效力的确定

在这个实验中，研究了PB6在治疗经直肠给予2，4，5-三硝基苯磺 酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎中的效力。

研究设计

进行两个连续试验。雄性Wistar大鼠得自National Centre for Laboratory Animal Sciences(Hyderabad，India)(试验1)或者得自 Department of Animal Medicine，TANUVAS(Chennai，India)(试验2)。 在开始治疗时，实验动物为10-12周龄。在到达实验室时，在兽医的 监督下对动物进行完整临床测试，以保证这些动物处于良好状态。使 这些动物适应研究条件至少7天。每个试验随机选取动物分组。将每 组动物圈养在聚碳酸酯笼子(421×290×190mm，L×W×H)中。动 物的房间和试验室条件如下：温度，22±3℃；相对湿度，50±20％； 光/暗周期，12小时/12小时(光亮时间07.00-19.00)；通风，大约7次 /小时过滤的非再循环空气。AU动物自由摄食(除了在给予TNBS之 前空腹过夜之外)来自National Institute of Nutrition(NIN，Hyderabad， India)的大鼠颗粒状饲料，随意饮用Aquaguard纯净水。在这两个试 验中，诱导结肠炎这一天设为第1天。在过夜空腹之后，在距离肛门 8cm处经直肠内给予一次100mg/Kg体重的TNBS诱导结肠炎。结肠 炎阴性对照组在第1天经直肠内给予盐水(每个动物给予一次0.5ml)。 在第1天开始经口服给予结肠炎阴性和结肠炎阳性对照组10ml/kg 蒸馏水，3次/天，间隔4小时给予，直至并包括第7天。在第一个试 验中，在第1天开始对TNBS诱导的结肠炎组用PB6(分别用1.5 10⁸CFU/Kg或者1.510⁹CFU/Kg)治疗，3次/天，间隔4小时给予，直至 并包括第7天；在第1天开始用美沙拉嗪(mesalazine)(250mg/Kg/ 天)治疗，直至并包括第7天；或者在第1天用infliximab(3mg/Kg) 治疗一次。第二个试验部分重复第一个试验的PB6(1.5 10⁸CFU/Kg)、 美沙拉嗪和infliximab治疗，且包括另外在第1天开始用S.boulardii (1.5 10⁸CFU/Kg)治疗，3次/天，间隔4小时给予，直至并包括第7 天。第一次或唯一的一次治疗(在infliximab情况中)在给予TNBS之 后2(蒸馏水、PB6、S.boulardii和美沙拉嗪)小时或3(infliximab)小时 内给予。除了经静脉内注射的infliximab⁵⁹之外，所有治疗均管饲给 予。每天观测两次临床迹象和死亡率。在第1、4和7天记录动物的 体重。在第8天，处死动物，切下长度为5cm的结肠节段(距离肛门 10-5cm)。将这些节段纵向剖开。用盐水洗涤以除去内容物，使用如 下分值对大体形态评分：0，无溃疡或炎症；1，无溃疡，仅局部充血； 2，溃疡，无充血；3，仅一个部位溃疡和炎症；4，两或多个部位溃 疡和炎症；5，大于2cm的溃疡。记录每个5cm结肠节段的重量以评 定炎症诱导的水肿。

测试制备物

将于水中的5％(w/v)TNBS(Sigma-aldrich，St Louis，USA)用50％ 乙醇稀释为2.5％溶液。给予体积为4ml/Kg体重。将干燥的PB6 (Kemin Health，Des Moines，USA)-在麦芽糖-和环糊精载体上干燥的 芽孢杆菌PB6发酵肉汤-悬浮于蒸馏水中，浓度为1.5X10⁷和1.5X10⁸CFU/ml。剂量体积为10ml/Kg体重。将Saccharomyces boulardii Biodiphar，Brussel，Belgium)悬浮于蒸馏水中，浓度为1.5 10⁷CFU/ml。剂量体积为10ml/Kg体重。将Mesalazine(Sun Pharmaceutical Ind.Ltd，Mumbai，India)片剂使用研钵和研杵研成粉 末，于蒸馏水中制备含有25mg/ml的5-氨基水杨酸的溶液。给予体 积为10ml/Kg体重。首先将(Infliximab)(Centocor B.V.， Leiden，The Netherlands)用10ml注射用水重建，用盐水进一步稀释为 2mg/ml浓度。给予体积为1.5ml/Kg体重。基于最后的个体体重给予 所有体重依赖性剂量。在每次给予之前制备新鲜的制品。在每次给予 之前用力搅拌所述制品。

结果与讨论

在第一个试验中，一只用Infliximab治疗的大鼠在第2天死亡。， 因为第一次注射的药物溶液渗出，这只动物在第1天给予二次注射。 在用TNBS诱导结肠炎之后，一些动物示出轻度腹泻症状。从第1天 开始直至并包括第7天在不同的治疗组中记录的腹泻次数(及受侵袭 的动物数目)如下：在第一个试验中，对于结肠炎阴性对照组、结肠 炎阳性对照组、PB6 3×1.5 10⁸CFU/Kg/天、PB6 3×1.5 10⁹CFU/Kg/ 天、美沙拉嗪250mg/Kg/天及一次infliximab 3mg/Kg分别为0、22(2)、 4(1)、0、0和8(1)；在第二个试验中，对于结肠炎阴性对照组、结 肠炎阳性对照组、PB6 3×1.5 10⁸CFU/Kg/天、S.boulardii 3×1.5 10⁸CFU/Kg/天、美沙拉嗪250mg/Kg/天及一次infliximab 3mg/Kg分别 为0、42(4)、10(1)、34(3)、12(1)和24(2)。结肠炎阳性对照组示出 伴随结肠炎的体重明显降低。在试验1中，这种体重降低高于在试验 2中体重降低，这也许与在诱导结肠炎时年龄和生长速度的差异相关。 在试验1中结肠炎阴性对照组通常在开始时体重较低，在整个试验期 间体重增长百分比较高，可能提示这些动物较试验2中的那些动物略 年幼。虽然在试验1中的常规治疗均显著抑制结肠炎对体重增加的负 作用，但是在试验2中这种结果仅在用PB6治疗组中出现(表11)。

表11：平均体重(g)及平均体重增长百分比(％)及其标准差

*与阳性对照组显著不同(Dunnett，P<0.05)。

在试验1中对动物结肠炎的更大的影响可能为由任何治疗导致 的改善留出了更多空间。PB6和美沙拉嗪总是导致结肠节段的重量和 结肠壁大体形态评分与结肠炎阳性对照组明显不同(表12)。

表12：结肠壁的平均大体形态评分及5cm结肠节段的平均净重

*与阳性对照组显著不同(Dunnett，P<0.05)。

用PB6和Mesacol治疗的TNBS诱导的结肠炎大鼠的结肠壁的 健康状况经肉眼观测与无结肠炎的大鼠相同。在试验2中美沙拉嗪治 疗效力略差(原因未知)，导致一些溃疡出现。对纵向剖开的结肠节段 进行肉眼观察明显示出在阳性对照组、S.boulardii和infliximab治疗 组中存在溃疡和坏死组织区域，在PB6治疗组和试验1的美沙拉嗪 组中则不存在这些状况。在试验1中，用infliximab治疗的一只大鼠 的大体形态学评分为1，结肠节段重量为0.402g。这些数据提示在这 个特定动物中，infliximab治疗是成功的，或者未诱导结肠炎。在治 疗结束时，这两个试验中用infliximab治疗的大鼠的平均体重增长和 结肠节段重量均介于结肠炎阴性对照组和结肠炎阳性对照组之间。这 个结果可能提示尽管在这些试验中无统计学意义，但是仍表示 infliximab的一些作用。在一个相似的试验中，其中在用TNBS诱导 结肠炎之前2天，经静脉内给予大鼠3mg/Kg相同剂量的infliximab， 示出对于结肠的大体形态学具有一些作用，但是对于使水肿水平降低 至低于结肠炎阳性对照组水平无作用¹⁹。在用PB6治疗的大鼠的结肠 节段中，无溃疡出现。在大多数这些节段中仅观测到充血。PB6明显 削弱经直肠内给予TNBS诱导的大鼠结肠炎症。在先前的试验中观测 到的在诱导后7天用3×1.510⁹CFU/Kg/天治疗的效力在试验1中证 实²⁰。虽然在先前试验中在诱导后7天用PB6 3×8 10⁷CFU/Kg/天治 疗经推断是无效的，但是在这两个试验中用增加至3×1.5⁸CFU/Kg/ 天的剂量治疗足以使炎症降低至与结肠炎阴性对照组的结果不再有 统计学差别的程度。

结论

设计并实施这项研究以证实和论证在先前的试验中观测到的芽 孢杆菌PB6对抗2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎的效 力，并将其效力与S.boulardii(益生菌)、美沙拉嗪和infliximab(标准 药物)的效力进行对比。这个大鼠模型是经充分确立的，可靠且广泛 用于测试治疗IBD的药物的效力。在诱导结肠炎之后不经任何治疗， 一些大鼠示出轻度腹泻症状，在剩余的试验期间平均体重降低。其结 肠的肠壁的大体形态学的特征在于炎症、溃疡，甚至坏死。用3×1.5 10⁸CFU/Kg/天或者3×1.5 10⁹CFU/Kg/天PB6治疗7天，使得结肠壁 恢复与阴性对照组及用标准药物美沙拉嗪(一种抗炎药物)治疗组在 统计学上相同的健康状态。

实施例4：PB6的代谢物的抗微生物性质方法与材料

针对不同的指示菌株例如产气荚膜梭菌ATCCl 3124、艰难梭菌 ATCC9689和空肠弯曲杆菌ATCC 33291测试分离自Bactisubtil (Sanofi-synthelabo)的芽孢杆菌PB6和蜡状芽孢杆菌的拮抗作用。

将蜡状芽孢杆菌和芽孢杆菌PB6均悬浮于5ml无菌盐水中。使 用棉药签将所述益生菌悬浮液在胰蛋白胨大豆琼脂平板(Oxoid， Belgium)上划一条线，并将该平板在37℃在有氧条件下保温24小时。

此后，用药签将不同的指示菌株的悬浮液垂直接种这两个芽孢杆 菌培养物，在有氧条件下保温24小时。使用Anaerogen Pak(Oxoid， Belgium)，将用产气荚膜梭菌接种的平板保温24小时，用艰难梭菌 接种的平板在厌氧条件下保温48小时。48小时的空肠弯曲杆菌 ATCC33291培养悬浮液用于做与所述益生菌培养物垂直的四条划线。 用菌种接种的平板在微有氧(micro-aerobic)条件(CampyGen，Oxoid) 下在37℃保温48小时。所做划线必须彼此不接触。在37℃保温之后， 通过所做划线汇合处周围的透明带的出现评估拮抗作用，所述透明带 的出现表示一种生物体对另一种生物体的抑制作用。

结果与讨论

PB6对于产气荚膜梭菌ATCC 13124和艰难梭菌ATCC9689具有 拮抗作用。在这两个菌种的平板上所做划线的交叉点均可观测到透明 带。因为这个菌种的溶血特性，使得对于产气荚膜梭菌的拮抗作用更 明显。如图1所示。尽管在这个图片中不太清楚，但是在PB6与艰 难梭菌培养物的交叉点处仍注意到明显的透明带。

蜡状芽孢杆菌(Bactisubtil)对于产气荚膜梭菌ATCC13124和艰难 梭菌ATCC9689无拮抗作用。在这个平板上的划线交叉点处未观测 到透明带。这个检测平板的例子如图12所示。

芽孢杆菌PB6对于空肠弯曲杆菌ATCC 33291具有拮抗作用。 在这个平板的划线交叉点处可观测到透明带。这个检测平板的例子如 图13所示。

蜡状芽孢杆菌(Bactisubtil)对于空肠弯曲杆菌无拮抗作用，如图 14所示。

结论

分离自自然界的芽孢杆菌PB6对于产气荚膜梭菌ATCC13124、 艰难梭菌ATCC9689和空肠弯曲杆菌ATCC 33291显然具有拮抗性 质。相反，对于测试的其它人病原菌观测到无作用。蜡状芽孢杆菌 (Bactisubtil)未示出对于产气荚膜梭菌ATCC 13124、艰难梭菌 ATCC9689及其它测试的微生物的任何拮抗作用。

PB6菌株的活细胞于2005年5月27日保藏在位于美国弗吉尼亚 州马纳萨斯市大学道10801的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，指 定保藏号为PTA-6737。根据37 C.F.R.1.801-1.809保藏。

前文的描述和图表包括例证的本发明实施方案。前述实施方案和 方法基于本领域技术人员的能力、经验和优选性可以变化。以一定顺 序列出的方法步骤并非限制本发明方法步骤的顺序。前文的描述和图 表仅是解释和例证了本发明，除了权利要求书范围内的限制之外，本 发明非限于这种限制。本领域技术人员在不偏离本发明范围的前提下 可以对本发明进行修改和变化。

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⁵⁸Kim，K.et al.Suppression of inflammatory responses by surfactin，a selective inhibitor of platelet cytosolic phospholipase A₂.Biochem.Pharmacol.1998；55：975-985.

序列表

<110>凯敏工业公司(Kemin Industries，Inc.)

<120>芽孢杆菌PB6在预防或治疗胃肠道疾病及免疫相关疾病中的用途

<130>4532670/76360

<140>11/605736

<141>2006-11-28

<150>US 60/740,518

<151>2005-11-29

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1448

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>1

<210>2

<211>1016

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>2

<210>3

<211>801

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>3