一种检测DNA的i－motif构象的光学方法

摘要

本发明公开了一种检测DNA的四链－motif构象的光学方法，包括以下步骤：1)在DNA溶液中加入等电荷量的阳离子的水溶性共轭高分子溶液；2)然后对DNA溶液进行比色法和/或荧光法检测，根据溶液颜色变化、荧光光谱或溶液紫外—可见吸收光谱来判断待检DNA，如人端粒DNA的富C序列的构象。本发明方法简单、具有较高的选择性和灵敏度，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测DNA的四链i-motif构象的光学方法。

背景技术

DNA分子的结构在不同的条件下具有不同的折叠方式。DNA分子结构的多样性对人类认识和理解各种生命现象具有关键的作用。因此，研究DNA的结构转变在生物学中具有重要的意义。

富含胞嘧啶(cytosine，C)的寡脱氧核苷酸可以在pH≤6.5的酸性条件下形成一种稳定的non-B-DNA结构，称为“i-motif”结构。这种结构与B-DNA相似但又有所不同，它是由等价的四条链形成的四聚物，两条反向平行的双链之间插入了半质子化的C-C⁺碱基对，从而以拉链的形式结合在一起，最近的碱基对之间的距离仅为3.1，比B-DNA(3.4)结构中的距离要小(K.A.Hartman，A.Rich，The Tautomeric Form of Helical Polyribocytidylic Acid.J.Am.Chem.Soc.1965，87，2033)。i-motif结构的分子构件是半质子化的C-C⁺碱基对。C-C⁺碱基对的形成最早是由Marsh等(R.E.Marsh，R.Bierstedt，E.L.Eichhorn，The crystal structure of cytosine-5-acetic acid.Acta Crystallogr.1962，15，310)于40多年前在乙酰胞嘧啶晶体中发现的，后来在聚脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸中也相继发现。对晶体常数的检测结果表明，d(CCCT)，d(CCCC)和d(TCCCCC)的寡聚脱氧核苷酸都能形成这种结构。

这种富C的可以形成i-motif结构的DNA序列在人类基因组中十分常见。例如在人类端粒DNA、骨髓基因、眼癌基因和人胰腺癌相关基因c-ki-ras的调节区中都含有富C的DNA序列。普遍认为，富C和富G的DNA参与重要的生物反应，与疾病的产生有着密切的关系。例如，人类端粒DNA形成四链结构可以阻止癌细胞端粒酶活性，破坏以RNA序列为模板合成端粒DNA，进而抑制癌细胞的无限增殖。又如，眼癌基因(retinoblastoma，Rb)编码一种核磷蛋白质，这种蛋白质可以作为肿瘤抑制因子。因而研究富含C序列的结构转变具有疾病诊断、新药研制方面具有重要的科学意义。

大部分端粒DNA以双链形式存在，除了3’端的一段富含G的序列以单链的形式存在以外。无论是单链状态还是与其互补链形成了双链，富C序列的结构都会随着环境的变化在i-motif结构和单链或双链结构之间转变。研究发现，影响结构转变的因素很多，包括阳离子的种类、浓度、pH、温度、表面活性剂、其它分子的折叠情况，以及光照射、电驱动等。检测这种转变的传统方法包括圆二色谱、核磁共振、紫外—可见吸收、荧光共振能量转移、拉曼光谱和电子能谱仪(W.Shu，D.Liu，M.Watari，C.K.Riener，T.Strunz，M.E.Welland，S.Balasubramanian，R.A.McKendry，J.Am.Chem.Soc.2005，127，17054；C.H.Kang，I.Berger，C.Lockshin，R.Radliff，R.Moyzis，A.Rich，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994，91，11636；L.Chen，L.Cai，X.H.Zhang，A.Rich，Biochemistry 1994，33，13540；K.Gehring，J.L.Leroy，M.Gue′ron，Nature 1993，363，561)等。然而这些检测方法都需要大型的仪器，而且所需时间较长。一些新的简便的方法也正在不断研究中，最近，Liu等(J.Sharma，R.Chhabra，H.Yan，Y.Liu，pH-driven conformational switch of＂i-motif＂DNA for thereversible assembly of gold nanoparticles.Chem.Commun.2007，477)报道了基于纳米金组装的比色法对i-motif结构转变的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服目前方法的不足，提供一种检测DNA四链i-motif构象的光学方法，该方法不需大型仪器，方法简单，检测快速。

现有报道阳离子的水溶性共轭高分子具有高度构象效应，其与不同构象DNA，如单链DNA、双链DNA、G-四面体之间可以形成静电复合物而具有不同光学性质(颜色和荧光特性)。具体举例来说，阳离子的水溶性共轭高分子——聚(3-3’-N，N，N-三甲基氨-1’-氧丙基)-4-甲基-2，5-噻吩盐酸盐(PMNT)本身的水溶液为黄色，强荧光，其共轭骨架呈自由卷曲状态，共轭程度和共面性较低；而PMNT/单链DNA复合物的颜色为红色，弱荧光，其共轭骨架的刚性较强，共轭程度和共面性较高；PMNT与其它构象的DNA(如双链DNA、G-四面体)静电结合的复合物的性质与纯PMNT溶液的性质相似，颜色为黄色，强荧光，其共轭骨架的共轭程度和共面性较低。本发明人经过深入而广泛的研究，惊喜得发现，阳离子的水溶性共轭高分子如PMNT可以与i-motif构象的DNA之间结合，且形成和单链或双链构象的DNA不同颜色、甚至肉眼可辨的静电复合物。因此，本发明以具有高度构象效应的阳离子的水溶性共轭高分子为传感材料，通过其与不同构象、带有负电荷的DNA之间可以形成静电复合物所具有的不同光学性质(颜色和荧光特性)采用比色和荧光法来实现i-motif构象和单链或双链构象的鉴别检测，缩短了检测的时间，简化了检测步骤。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种检测DNA的四链i-motif构象的光学方法，包括以下步骤：

1)在待检DNA溶液中加入等电荷量的阳离子的水溶性共轭高分子溶液；

2)然后对待检DNA溶液进行比色法和/或荧光法检测，根据溶液颜色变化或光谱如荧光光谱、紫外—可见吸收光谱变化来判断待检DNA的构象。

优选的，所述的阳离子的水溶性共轭高分子是PMNT，为阳离子聚噻吩衍生物。PMNT的水溶液为黄色，强荧光。

根据本发明，所说的“等电荷量”是根据DNA所带的负电荷量进行计算，DNA所带的负电荷为其摩尔数×碱基数，聚合物所带正电荷为其摩尔数。这为本领域技术人员所熟知。

若所述的待检DNA为单链，当步骤2)所述的DNA溶液颜色为红色时，待检DNA的构象是单链状态；当步骤2)中所述的DNA溶液颜色为黄色时，待检DNA的构象是四链的i-motif状态。

如所述的待检DNA为双链，更适合于实际的生物体系，当步骤2)中所述的DNA溶液颜色为红色时，待检DNA的构象是四链的i-motif状态，当步骤2)中所述的DNA溶液颜色为黄色时，待检DNA的构象是双链状态。

更佳地，本发明还可以通过对同一体系的DNA溶液进行可逆的pH调节，从而实现对待检DNA构象转变的可逆性检测。

优选的，所述的光学方法还用不能形成i-motif结构的任意序列DNA作为阴性对照。

本发明以人端粒DNA的富C序列为例来说明。由于该富C的DNA序列在不同pH的环境中快速发生构象变化并保持稳定结构，故其与阳离子的水溶性共轭高分子形成的静电复合物在不同pH的环境中具有的不同光学性质，这些光学性质可用比色法和荧光法检测，以此来判断富C的DNA序列的构象及其变化；另一方面，也可以用来检测一个未知pH值溶液的pH值。故优选的，所述的待检DNA为人端粒DNA的富含胞嘧啶序列。

本发明使用简单的光学方法，比色法和/或荧光法，不需大型仪器，甚至可以仅仅依靠肉眼判断，简化了检测步骤，缩短了检测的时间，而且具有较高的选择性和灵敏度。本发明可用于可以形成四链i-motif结构的DNA，特别是人端粒DNA等富C的DNA的构象及其变化的检测，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义；另一方面，也可以用来检测一个未知pH值溶液的pH值。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征。

图1是本发明利用阳离子的水溶性共轭高分子的构象效应和单链DNA进行单链向四链的i-motif结构之间的转变原理图。

图2是本发明利用阳离子的水溶性共轭高分子的构象效应和双链DNA进行双链向四链的i-motif结构之间的转变原理图。

图3是采用单链DNA对构象由单链向四链的i-motif结构转变进行可逆性分析的紫外—可见吸收光谱检测结果，其中样品1pH为8.0，样品2pH为5.0，样品3pH重又变为8.0，样品4pH重又变为5.0。

图4是采用双链DNA对构象由双链向四链的i-motif结构转变进行可逆性分析的荧光光谱图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的工作流程及功效，但本发明并不受其限制。

本发明各实施例拍照所用的仪器如下，其他未具体注明的药品或实验条件按照常规或以其制造厂商所建议的条件。

仪器为紫外—可见分光光度计(Hitachi U-3010，日本)，紫外—可见吸收光谱测量条件：扫描范围300—700nm，用200μL微量石英比色皿进行测量，样品体积50μL，室温。

荧光分光光度计(Hitachi F-4500，日本)，荧光光谱测量条件：氙灯激发，激发和发射狭峰宽度均为2.5nm，电压PMT 950V，响应时间2S，激发波长为392nm，发射波长扫描范围402—700nm，用3mL石英比色皿进行测量，样品体积1mL，室温。

本发明各实施例中所用的水溶性共轭高分子为阳离子聚噻吩衍生物poly[3-(3’-N，N，N-triethylamino-1’-propyloxy)-4-methyl-2，5-thiophenehydrochloride](PMNT)根据文献(H.A.Ho，M.Boissinot，M.G.Bergeron，GCorbeil，K.Dore，D.Boudreau，M.Leclerc，Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，1548)合成，其单体结构式如下：

本发明实施例中所用的各种DNA序列(购自上海生物工程技术有限公司)如表1所示，所用各种溶液成分如表2所示。

表1 寡聚核苷酸碱基组成表

其中，C-probe同人端粒DNA的富C序列，c-probe为其互补序列(富G序列)，nc-probe为一不能形成i-motif结构的任意DNA序列。

表2 所用各种溶液成分表

实施例1

取2.5μL浓度为100μM的C-probe溶液加入到2.5μL pH值分别为5.0，6.8，7.0，8.5的溶液中，室温反应10分钟，然后向其中加入等电荷量的PMNT溶液(1mM的PMNT溶液5μL)，观察溶液颜色变化，然后进行紫外—可见吸收光谱的测量。同时取任意序列nc-probe溶液进行阴性对照实验。

结果显示，在用特异性的C-probe进行检测时，在pH 5.0的溶液中颜色为黄色，而在其它三种溶液中，颜色为橙—红色。这是由于在pH 5.0的弱酸性环境中，DNA的残基C被质子化形成了半质子化的C-C⁺碱基对，从而形成了稳定的i-motif结构，其与带有正电荷的PMNT静电结合时，颜色变为黄色。在pH大于或等于6.8的中性偏碱性环境中，残基C不能被质子化，因此不能形成i-motif结构，而是以自由卷曲的单链状态存在，加入PMNT后，颜色为红色。

在用任意序列nc-probe溶液进行实验时，四种pH值的溶液体系颜色皆为红色。这是由于任意序列DNA的负电荷与PMNT的正电荷发生静电吸附，这种吸附作用无序列特异性，因此，与没有形成i-motif结构的结果一致，均为红色。

实施例2

取2.5μL浓度为100μM的C-probe溶液加入到2.5μL用HCl和NaOH调节了pH值的溶液中，pH值分别为1、3、5、7、9、11、13，室温反应10分钟，然后向其中加入等电荷的PMNT溶液(1mM的PMNT溶液5μL)，观察溶液颜色变化，以考察在强酸或强碱环境中对结构转变检测的影响。

结果显示，在pH为1、3和5等pH小于6.5的环境中，由于可以形成i-motif结构，溶液颜色为黄色，而在pH为7、9、11和13等pH大于6.5的环境中，由于不能形成i-motif结构，溶液颜色为红色。表明对富C的DNA构象变化的检测，同样可以在酸性或碱性更强的环境中进行。

实施例3

按照实施例1中的条件进行实验，分析本发明方法对构象转变检测的可逆性。首先在pH 8.0的溶液中加入特异性探针C-probe溶液(样品1)。由于不能形成四链结构，加入共轭高分子后颜色为红色。然后向其中加入一定量的强酸溶液(1M HCl)，使体系转变为pH 5.0，体系为弱酸性(样品2)，DNA形成四链的i-motfi结构，颜色变为黄色。待颜色稳定后，加入1M NaOH使溶液pH重新变为8.0(样品3)，颜色重新变为红色，然后按照上面的方法，使溶液pH重新变为5.0(样品4)，重复实验，最后检测各溶液的紫外—可见吸收光谱图。

结果见图3。当体系pH为酸性时，溶液颜色为黄色，对应的紫外—可见吸收峰的比值(A390nm/A520nm)较高(样品2和4)。而当体系pH为碱性时，溶液颜色为红色，对应的紫外—可见吸收峰的比值较低(样品1和3)。

实施例4

各取2.5μL浓度为100μM的C-probe和c-probe溶液混合加入到5μLpH分别为5.0，6.8，7.0和8.5的不同pH值的缓冲溶液中，室温反应10分钟形成双链DNA，然后向其中加入等电荷量的PMNT溶液(1mM的PMNT溶液5μL)，观察溶液颜色变化。

结果显示，在pH大于6.5(pH为6.8，7.0和8.5)的弱碱性环境中，双链DNA可以很好的杂交形成双螺旋结构，与PMNT结合后，溶液颜色为黄色。而在pH小于6.5(pH为5.0)的环境中，由于C-probe可以形成i-motif结构，从而使其互补序列游离出来，以单链的形式存在，与PMNT结合后，溶液的颜色呈现橙—红色。

实施例5

各取2.5μL浓度为100μM的C-probe和c-probe溶液混合加入到5μLpH为5.0的缓冲溶液中，室温反应10分钟形成双链DNA，参照实施例3进行实验，检测双链DNA的四链i-motif结构向双链之间转变的可逆性研究。

结果见图4。在pH 5.0的弱酸性环境中，由于i-motif结构的形成，双链DNA与PMNT结合后，溶液颜色呈橙红色，荧光被猝灭(图中a、c所示)。而在pH 8.0的弱碱性环境中，由于DNA双螺旋的形成，与PMNT结合后溶液颜色为黄色，荧光很强(图中b、d所示)。