基于模拟人血管内皮细胞生长因子VEGF表位的疫苗及其制备方法

摘要

基于模拟人血管内皮细胞生长因子VEGF表位的疫苗及其制备方法，利用噬菌体随机呈现技术筛选出与人鼠嵌合单克隆抗体阿瓦斯汀(Avastin)特异亲和的VEGF模拟表位，其氨基酸序列为：Asp－His－Thr－Leu－Tyr－Thr－Pro－Tyr－His－Thr－His－Pro；所述的模拟表位与VEGF的蛋白序列无同源性，在模拟表位的基础上构建在体内能够诱导出针对VEGF分子自身抗体的多肽表位疫苗，提供以VEGF为靶点的肿瘤治疗性疫苗开发和设计的策略VEGF是促进血管生长作用最强的分子之一，是抗血管生成治疗肿瘤的理想靶点，从而以主动免疫方式来替代或补充单抗被动免疫治疗，为克服单抗治疗缺陷打下基础。

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种基于模拟人血管内皮细胞生长因子VEGF的模拟表位及用该模拟表位构建的在体内能够诱导出针对VEGF分子自身抗体的多肽表位疫苗及其制备方法。

背景技术

1、VEGF分子及其单克隆抗体的相关研究

1.1 VEGF分子

VEGF相对分子量为34-42KD，是由分子量为17-22KD的同源二聚体通过二硫键联接而成。人类VEGF的基因结构位于染色体的6p21.3，该基因全长为28kb，编码VEGF的基因长约1.4万个碱基对，由8个外显子和7个内含子交替构成。由于VEGF mRNA的不同剪切方式可使其有5种VEGF异构体。根据氨基酸的大小命名为V EGF206(包含所有外显子及部分第7个内含子)、VEGF189(包含8个外显子)、VEGF165(缺少外显子6)、VEGF145(缺少外显子7)及VEGF121(缺少外显子6和7)，体内以VEGF165较为常见。5种VEGF的异构体都具有诱导内皮细胞增生的相对活性，其功能上的差异主要在于它们与细胞表面和细胞外基质中肝素的亲和力不同。

VEGF分子通过与血管内皮细胞表面特异性受体结合发挥生物学效应。其主要的生物学功能是促进内皮细胞增殖、促进血管生长和增加血管通透性。现已证明，VEGF与受体结合后可以迅速增加细胞内Ca²⁺水平，通过磷酸肌醇特异性磷酸脂酶C途径，使细胞内IP₃水平升高，传导细胞内信号，最终完成生物学效应。

1.2 VEGF单克隆抗体的发展现状

过去的大约30年中，由Khler和Milstein提出的单克隆抗体技术己经为一系列疾病的的体外诊断提供了契机。然而，单克隆抗体的特异性识别抗原的特性在人类疾病的免疫治疗只是在近10年中才崭露头角。目前，单克隆抗体(mAbs)在临床中被用于癌症的诊断和治疗，控制自体免疫性疾病、移植物抗宿主反应和同种异体移植排斥，以及治疗细菌感染引发的脑(脊)髓炎、心肌损伤和可逆的药物中毒等。

VEGF是促进肿瘤血管生长作用最强的分子之一，多种肿瘤都高分泌该分子；因此该分子成为抗血管生成治疗肿瘤方法中的重要靶标。阿瓦斯汀(Avastin)是一种人源化抗VEGF单克隆抗体，可与人VEGF结合，阻断VEGF与受体结合后介导的下游信号通路，从而抑制人VEGF的生物学活性，包括抑制内皮细胞促有丝分裂活性、血管通透性增加活性和促血管生成活性，达到抗肿瘤目的。

Avastin是第一个被FDA批准用于抗肿瘤血管生成治疗的单克隆抗体制剂，2004年由FDA批准用于结直肠癌及非小细胞肺癌的治疗，它的出现为抗肿瘤血管生成疗法开创了新天地。Avastin优势有：其作用靶点直接暴露于血液中，便于药物直接作用；靶点基因表达稳定，不易产生抗药性；无需考虑肿瘤组织学特性；可抑制肿瘤转移；有下游放大效应；不良反应相对小。Avastin与放、化疗联合具有协同作用：(1)可使肿瘤区血管生成正常化，组织间高压减轻，利于化疗药向肿瘤区输送；(2)放、化疗所致局部肿瘤区缺氧可促VEGF表达，帮助肿瘤细胞抵抗放、化疗的凋亡诱导机制，而联用Avastin将预防这种继发的保护效应，使治疗反应增敏。

Avastin不良反应主要是出血和胃肠穿孔，另外还有虚弱、疼痛、高血压、腹泻、白细胞减少、腹痛、头痛、恶心、呕吐、食欲缺乏、口腔炎、深部静脉血栓形成、腹内血栓、便秘、上呼吸道感染、剥脱性皮炎、呼吸困难、蛋白尿等。罕见的严重不良反应有肠梗阻、肠坏死、肠系膜静脉闭赛、吻合处溃疡、低钠血症等。Avastin用药量375mg/m²，每周1次静脉滴注共4次为1疗程，平均1疗程费用为10万人民币左右，花费高昂。

2、噬菌体表面随机呈现肽库技术

1985年，Smith报道了外源多肽在单链噬菌体表面呈现的结果，由此发展起来的噬菌体表面呈现技术近几年来得到迅速发展，成为生物学研究和应用领域中有效而重要的工具。该技术是将编码外源多肽或蛋白的基因片断插入噬菌体衣壳蛋白的基因中，从而将外源多肽或蛋白呈现于噬菌体表面。由于构成外源基因片段的脱氧核苷酸可以随机的排列组合，所以可以构建呈现不同外源多肽或蛋白的噬菌体表面呈现多肽或蛋白库，进而应用于酶底物的筛选，抗体的筛选，配体的筛选，蛋白间相互作用的研究，疾病的诊断等方面。

丝状噬菌体是一类具有丝杆状形态的噬菌体，在分类中属于丝杆噬菌体科(Inoviride)，丝状噬菌体属(Inovirus)。用于表面呈现的噬菌体为一类特异性感染大肠杆菌的噬菌体，包括M13、fd、f1、If1和Ike等，它们具有相似的结构。以M13噬菌体为例，它的核心为6000bp的环状单链DNA，含10个基因，分别编码10种不同的蛋白。其中基因VIII编码主要衣壳蛋白pVIII，基因III，VI，VII，IX分别编码次要衣壳蛋白pIII、pVI、pVII、pIX。M13噬菌体以其次要衣壳蛋白pIII仅感染具F纤毛的大肠杆菌。

丝状噬菌体自身有许多适于构建多肽库的特点。如它能够接受在衣壳蛋白中插入外源多肽，并将外源蛋白表达后呈现于病毒颗粒表面，便于被相应的受体或抗体识别。即使外源序列干扰病毒的生活周期，也能通过双基因或噬菌粒系统将多肽表达于表面，产生携带野生型和重组衣壳蛋白的嵌合噬菌体。易于扩增，重组后的噬菌体能够通过感染大肠杆菌得到扩增。对于筛选到的能够特异性结合某一靶分子的多肽噬菌体也能够再感染大肠杆菌，扩增后测序分析其核苷酸序列。噬菌体在各种洗脱条件(如低pH)下仍然很稳定，可以感染形成很高的滴度(一般达到10¹²)，这样高的滴度足以代表库中所有的克隆。

噬菌体显示技术的出现和发展为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。同时随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为：(1)含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。

从随机肽库中筛选与目的筛选物相结合的小肽，已有多篇文献成功报道，筛选的成功与否有赖于高质量肽库及高纯度的筛选物。有文献报道，将筛选方法稍做修饰，即可用复合物如全血清或其他体液从肽库中筛选与目的物结合的小肽。已有多个研究小组证实，利用多克隆血清从随机肽库中筛选出疾病专一的模拟抗原决定簇是可能的。这种方法在预先不知道抗原任何信息的情况下，从一个大的肽库中筛选出呈现特异性模拟抗原决定簇的噬菌体，这种特异性噬菌体只能与病人血清反应而不与正常血清反应。并且模拟抗原决定簇的序列是否与原始分子相似都不会影响它应用于疫苗，因而在新发现的疾病方面更有意义。Cortese实验小组进行一系列实验，成功地筛选到能够与某些疾病患者血清中抗体结合，而并不与正常对照结合地小肽。Prezzi等用感染了人丙肝病毒(HCV)的人血清做为筛选物，获得的噬菌体小肽能够与病人血清反应，而与对照血清无反应。以此类肽为抗原免疫兔获得的抗体可识别HCV蛋白。现已商品化的人乙肝病毒疫苗，包括纯化的基因工程重组人乙肝疫苗都是通过此方法而制备的。

噬菌体短肽库技术具有重要的理论意义和应用价值。在研究蛋白间的相互识别，蛋白折叠及空间构象的预测，肽与有机物间的相互作用以及酶与底物的结合，抗体与抗原的相互作用，激素与受体的结合等方面显示出巨大的应用潜力。在诸如疫苗的设计、基因定位、小分子药物的开发等领域的应用前景广阔。

3、治疗性疫苗

3.1 研究进展

近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，既用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点，涉及很多疾病，如：慢性病毒感染、过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。

治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两大类：一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生细胞免疫反应，产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。

诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法，绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展就要缓慢的多，直到近几年治疗性疫苗才看到成功的希望。同时，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着能够在体内诱导抗体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如：阻断TNF-α以治疗炎症性疾病。人源化的抗TNF-α单克隆抗体已经被证明在治疗类风湿性关节炎和Crohn’s病(节断性回肠炎)方面十分有效。目前已经有几种TNF-α的阻断剂上市，包括两种单克隆抗体(infliximab，adalimumab)和一种受体阻断剂(etanercept)，它们正在帮助成千上万的病人减轻痛苦，而且年收入达到20亿美元。所以阻断过量表达的TNF-α能够达到治疗疾病的效果。在动物试验中已经证实通过主动免疫可以特异性诱导出TNF-α的中和性抗体，而且诱导的抗体滴度足以治疗动物关节炎模型。

其他的动物试验表明可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病：针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartatereceptor-1(NMDAR1)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotro-pin HCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(GnRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。

另一类稍有不同的疫苗对安全性的要求更低一些，那就是针对上瘾药物的疫苗。在动物试验中针对可卡因和尼古丁的疫苗降低了这些药物在大脑中的水平，消除了它们的成瘾症状，试验动物在接受了免疫后对药物不再依赖。在临床I期试验中，可卡因疫苗被证明有良好的耐受性，并且可以诱导出良好的抗体反应，现在，人们正在翘首以待它的有效性结果。

2.2 诱导自身抗体的理论研究

要产生足够高的滴度的特异性抗体以治疗相关疾病，治疗性疫苗必须克服三个障碍：T细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效制剂的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别“非我”与“自我”的能力。免疫系统的这种特性通常被称为耐受或无反应性，耐受发生在B细胞和T细胞水平。一般来说，T细胞耐受更严格一些。对许多抗原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上，有三种机制导致了免疫耐受：细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导耐受和无能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但诱导耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中诱导，但也可在外周诱导。通常，对于普遍表达的丰富抗原的免疫耐受更容易阐明。

在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生抗体：当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHC II类分子的复合物。通常，B细胞不能激活TH细胞。要激活TH细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHC II类分子的复合物，激活TH细胞。激活后的TH细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHC II类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏TH细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合，或偶联在一起，就有可能绕过TH细胞耐受：自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相联的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHC II类分子的复合物，由于TH细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。

与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和TH细胞的共同作用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相联，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。实际上，利用这种策略，针对多种自身激素的抗体反应已经被诱导出来了。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于模拟人血管内皮细胞生长因子VEGF表位的疫苗及其制备方法，利用噬菌体表面随机呈现肽库技术筛选出模拟VEGF表位的12肽，在模拟表位的基础上构建在体内能够诱导出针对VEGF分子自身抗体的多肽表位疫苗，提供以VEGF为靶点的肿瘤治疗性疫苗开发和设计的策略。

为了实现上述目的，本发明利用噬菌体随机呈现技术筛选出与人鼠嵌合单克隆抗体阿瓦斯汀(Avastin)特异亲和的VEGF模拟表位，其氨基酸序列为：Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro；所述的模拟表位与VEGF的蛋白序列无同源性。

构建能够诱导针对VEGF分子产生自身抗体的疫苗，将上述的模拟表位化学偶联于蛋白载体钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)，其连接方式为：KLH-Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。

所述的人血管内皮细胞生长因子VEGF的模拟表位的制备方法，按以下步骤进行：

a)噬菌体随机呈现12肽库的筛选

首先菌体滴度的测定：

噬菌体随机呈现十二肽库(Ph.D.—12^TMPhage display peptide library)噬菌体感染宿主后，加入20mg/mL的X-gal和50mg/mL的IPTG孵育过夜；观察平板，计数蓝色噬斑并乘以该平板中噬菌体样品的稀释倍数，得到每10μl Ph.D.—12^TM噬菌体的滴度，以蓝色噬斑形成单位表示(plaque forming units，pfu)；

其次生物淘洗：

(1)接种噬菌体宿主细菌于含四环素的LB培养液中，37℃培养；

(2)以0.1mol/L的NaHCO₃为溶剂配制pH为8.6、Avastin的浓度为100μg/mL的Avastin溶液，将Avastin溶液包被ELISA板孔过夜；将过夜后的96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体，然后用含质量分数为1％ BSA的TBS溶液4℃孵育2h；再采用质量分数为0.1％的Tween 20的TBST洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体；所述TBS溶液为50mM的pH值为7.5的Tris—HCl溶液；

(3)加入200μl质量分数为0.1％的Tween 20的TBST稀释的含2 x 10¹¹pfu的Ph.D.—12^TM噬菌体溶液，室温孵育1h；倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用质量分数为0.1％的Tween20的TBST洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体；用100μL洗脱液洗脱结合的噬菌体，并加入15ml中和液；取1μL测滴度，剩余液体加入20mL处于对数生长早期的宿主培养物中，于37℃剧烈振荡培养4.5h，得到扩增的噬菌体；所述的洗脱液为含0.2mol/L的Glycine-HCl和pH值为2.2的10g/L的BSA的混合溶液；所述的中和液为pH值为9.1的1mol/L的Tris-HCl溶液；

(4)将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液转入离心管，4℃条件下离心10000rpm×10min；上清液转入离心管，4℃条件下10000rpm×10min再离心一次；取80％的上清液转入离心管，加入3ml的PEG8000/NaCl溶液4℃静置过夜；次日，4℃离心10000rpm×15min，倾去离心上清液；用1mL的TBS重悬沉淀，于4℃离心10000rpm×5min，沉淀残留的细胞；上清加入150ul的PEG-8000/NaCl冰浴1h，4℃离心10000rpm×15min，倾去上清，用200μL含质量分数为0.01％的NaN3的TBS重悬沉淀，离心10000rpm×1min；上清液即为扩增好的Ph.D.—12^TM噬菌体噬菌体洗脱液，1μL用于测滴度，余下的液体于4℃存放；所述的PEG8000/NaCl溶液含200mg/mL的PEG-8000和2.5M的NaCl；

(5)按照上述第(2)步再包被ELISA板，进行第二、三轮筛选；第二轮、第三轮筛选中Avastin浓度分别降至为50μg/m、20μg/mL，分别加入2 x 10¹¹pfu在第一轮、二轮筛选出的扩增好的Ph.D.—12^TM噬菌体，操作步骤按上述筛选步骤(1)-(4)进行；TBST的Tween20浓度均提高至0.5％；第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取1ul测定滴度；

(6)从第三次筛选后噬菌体滴度测定中，菌斑数<100的平板上随机挑取80个分隔良好噬菌斑进行扩增和纯化，挑取的噬菌斑培养的时间不超过18h；所述的扩增和纯化：用无菌牙签蘸取的80个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的宿主培养物中，37℃剧烈振荡培养4.5h后，12000rpm离心30s，将上清液转入新的离心管，12000rpm再离心30s，取80％的上清，即得扩增的噬菌体悬浮液；

b)特异性噬菌体筛选

在上述选出的80个克隆中利用噬菌体ELISA进一步挑选与Avastin高亲和力的克隆；

(1)以100mg/L的Avastin包被96孔酶联板，每孔200μL，同时对每个Avastin孔设立白介素15(IL-15)单抗为阴性对照，4℃孵育过夜；

(2)倾去包被液，加入封闭液4℃封闭2h；倾去封闭液，TBST清洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，除尽残余液体；将80个纯化的噬菌体按1×10⁹/孔分别加入Avastin、IL-15单抗包被孔中室温孵育2h；所述的封闭液含5mg/L的BSA和0.1mol/L的NaHCO₃的混合溶液，该封闭液的pH值为8.6的；

(3)TBST清洗6次，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的1∶5000的小鼠抗M13噬菌体抗体100μL，室温孵育1h；TBST清洗6次，邻苯二胺(O-Phenylenediamine)显色后测定A490nm处的吸光值；

(4)根据A490nm处的吸光值，筛选出42个与Avastin有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆进行序列测定；筛选方法：噬菌体与Avastin结合后A490nm吸光值大于0.5，同时与对照组A490nm吸光值的比大于3；

c)噬菌体呈现肽的序列测定

(1)噬菌体单链DNA的提取：

噬菌体克隆的扩增后，取噬菌体培养上清，用单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取，紫外定量其浓度大于100ng/μL；

(2)Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列：

以噬菌体单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为ccctc atagt tagcg taacg，在DNA自动测序仪上进行自动测序；

(3)呈现随机肽氨基酸序列的推导：

根据DNA测序结果，得出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，得出序列如下：Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。

所述的能够诱导针对VEGF分子产生自身抗体的疫苗的制备方法，采用以下步骤：

(1)化学合成如权利要求1所述的模拟表位多肽

Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro；

(2)采用戊二醛法将合成多肽表位与KLH化学偶联：将KLH融于pH值为10的硼酸盐缓冲液中震荡，加入步骤(1)合成的模拟表位多肽，缓慢滴入质量分数为0.3％的戊二醛溶液，震荡2小时，加入0.25毫升1mol/L的甘氨酸，30分钟后终止反应；分离，将偶联物在pH值为8.5的硼酸盐缓冲液中4℃透析过夜，更换缓冲液继续透析4小时以上得到纯化的偶联物；KLH与模拟表位多肽的质量比为2：3，KLH与戊二醛溶液的摩尔比为10∶3；

(3)打点印迹(DotBlot)鉴定偶联物，在打点印迹中能与Avastin结合的偶联物即为人VEGF模拟表位构建的多肽疫苗。

本发明的技术效果：本发明利用已商品化的VEGF单抗Avastin为靶分子从噬菌体随即呈现肽库中筛选出与Avastin结合的肽，化学合成该肽，并与钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)进行化学偶联，成功的构建疫苗。联合弗氏佐剂免疫健康成年BALB/c小鼠，诱导出针对人VEGF的抗血清，并且该抗血清能够发挥与Avastin一致的功能，制备的模拟表位多肽能够与Avastin高亲和；构建的模拟表位多肽疫苗使用筛选出的VEGF模拟表位结合载体蛋白KLH来突破自体免疫耐受，产生针对VEGF的中和抗体；模拟表位多肽疫苗联合弗氏佐剂免疫健康成年BALB/c小鼠，可以在小鼠体内诱导出针对该表位的抗血清；该抗血清能够与VEGF结合；能够抑制血管内皮细胞增殖和迁移。从而应用主动免疫的方法来替代Avastin单抗的被动免疫治疗方式，减少了单抗副作用，减轻了病患负担；提供了以VEGF为靶点的肿瘤治疗性疫苗新的开发和设计的策略。

附图说明

图1是筛选出42个与Avastin有较高亲和力而与对照(人IL-15单抗)亲和力低的噬菌体克隆的ELISA结果：黑色框为阳性噬菌体与Avasdtin的结合结果；白色框为与人IL-15单抗的结合结果，纵坐标为490nm处的吸光值，横坐标为阳性噬菌体编号；

图2是KLH-模拟表位12肽(KLH-12P)与Avastin的Dot Blot鉴定图。

图3是ELISA检测KLH-12P抗血清与VEGF的结合图结果统计图，黑色为KLH-12P抗血清，白色为KLH抗血清，灰色为KLH-对照12P抗血清；1血清稀释100倍，2为血清稀释50倍，3为血清稀释25倍，纵坐标为490nm处吸光值。

图4是MTT法检测抗血清抑制血管内皮细胞增殖结果统计图，黑色框为KLH抗血清，白色框为KLH-对照12P抗血清、灰色框为KLH-12P抗血清，1为血清稀释100倍、2为血清稀释50倍、3为血清稀释25倍，纵坐标为490nm处吸光值。

图5抗血清抑制血管内皮细胞迁移结果统计图，1为稀释25倍KLH抗血清，2为稀释25倍的KLH-对照12P抗血清，3为稀释25倍KLH-12P抗血清，纵坐标为细胞计数；

图6是抗血清抑制血管内皮细胞迁移电镜图，6a图为稀释25倍KLH抗血清，6b图为稀释25倍KLH-对照12P抗血清，6c图为稀释25倍KLH-12P抗血清。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

依照本发明的技术方案制备的VEGF治疗性自体疫苗首先应用亲和筛选的方法利用Avastin为配体在噬菌体随机呈现12肽库(，New England)中筛选得到高亲和力的12多肽模拟表位Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro(天冬氨酸-组氨酸-苏氨酸-亮氨酸-酪氨酸-苏氨酸-脯氨酸-酪氨酸-组氨酸-苏氨酸-组氨酸-脯氨酸)，化学合成该表位以后，应用戊二醛法将其与KLH进行化学偶联，得到能够打破自体免疫耐受、产生自体抗体的疫苗。

实现本发明的肽库筛选，疫苗构建，以及免疫动物，抗体检定工作，按以下步骤完成：

3.1.噬菌体随机呈现12肽库的筛选

噬菌体随机呈现十二肽库(Ph.D.—12^TM Phage display peptide library)购自美国New England Biolabs公司，其滴度为1.5×10¹³噬斑形成单位(pfu)/mL；多样性为2.7×10⁹transformants。宿主菌为具有四环素抗性的携带有可被噬菌体感染的F’因子的大肠杆菌E.coli ER2738，可与呈现了12肽的噬菌体形成α互补。目的蛋白的DNA测序引物(-96gIIIsequencing primer)序列为：ccctcatagt tagcg taacg。

3.1.1 噬菌体滴度的测定

(1)E.coli ER2738的培养以无菌操作从ER2738大肠杆菌的甘油冻存物中挑取一接种环，接种于四环素抗性的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂15g/L，NaCl10g/L)上，37℃培养24h，待平板上可见白色透亮的菌落形成后，将基本培养平板置于4℃保存。

(2)从上述步骤(1)的平板上挑取E.coli ER2738单菌落接种于含20mg/L四环素的LB培养液中(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L)，37℃振荡培养至对数生长中期(OD600约为0.5)。

(3)将Ph.D.—12^TM噬菌体用LB培养液进行10倍连续梯度稀释，对于扩增后的噬菌体培养上清液稀释10⁸-10¹¹倍，对于未扩增的筛选洗脱液稀释10¹-10⁴倍。

(4)稀释后的Ph.D.—12^TM噬菌体样品取10μl，分别加入到步骤(2)培养好200μl的细菌培养液中，快速混匀，室温孵育1-5min。

(5)各感染噬菌体的细菌分别移入45℃预温、含有顶层琼脂3—5ml的培养管中(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaGl10g/L，MgCl₂·6H₂O1g/L，琼脂糖7g/L)，加入40μL 20mg/mL的X-gal和16μL 50mg/mL的IPTG，充分混匀，然后迅速倒入预温的LB平板，倾斜使顶层琼脂均匀分布。

(6)将平板放置5min，使温度降低，然后反转平板，37℃孵育过夜。

观察平板，计数蓝色噬斑并乘以该平板中噬菌体样品的稀释倍数，得到每10μl Ph.D.—12^TM噬菌体的滴度，以蓝色噬斑形成单位表示(plaque forming units，pfu)。

3.1.2.生物淘洗

(1)预先接种ER2738于10mL(测滴度用)和20mL(扩增噬菌体用)的含四环素的LB培养液中，37℃培养。

(2)在96孔板中加入200μL 100μg/mL Avastin溶液(0.1mol/L NaHCO₃，pH8.6稀释)，置于密闭的湿盒中轻轻摇动，4℃孵育过夜。

(3)将(2)中的96孔板取出，倾去液体，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(4)加入200μL的质量分数为1％的BSA-TBS封闭液，4℃孵育2h，所述TBS溶液为50mM的pH值为7.5的Tris—HCl溶液；

(5)TBST(TBS+0.1％Tween 20)洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(6)加入200μLTBST(TBS+0.1％Tween 20)稀释的含2 x 10¹¹pfu的Ph.D.—12^TM噬菌体溶液，室温孵育1h。

(7)倾去液体，去除未结合的噬菌体，TBST(TBS+0.1％Tween 20)洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(8)用100μL洗脱液(0.2mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，10g/L BSA)洗脱结合的噬菌体，并迅速加入15毫升中和液(1mol/L Tris-HCl，pH9.1)；取1μL测滴度，剩余的中和后的洗脱液加入20mL处于对数生长早期的R2738培养物中，于37℃剧烈振荡培养4.5h，进行扩增。

(9)将(8)中扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4℃，10000rpm离心10min。将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次，取80％的离心上清入新的离心管。

(10)在离心管中加入3毫升PEG8000/NaCl(200mg/mL PEG-8000，2.5MNaCl)，于4℃静置过夜。

(11)次日取出PEG8000/NaCl沉淀好的液体，4℃条件下离心10000rpm×15min，小心的倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清。

(12)用1mLTBS重悬离心沉淀，将重悬液转入小离心管中，4℃条件下离心10000rpm×5min，将残留的细胞沉淀。

(13)将离心上清移入新的小离心管中，加入150ul的PEG8000/NaCl冰浴1h。4℃条件下离心10000rpm×15min，小心的倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清。

(14)用200μL含质量分数为0.01％的NaN₃的TBS重悬沉淀，离心10000rpm×1min以沉淀分离。将上清液移入新的离心管，即为扩增好的噬菌体，1μL用于测滴度，余下的液体于4℃存放。

(15)用200μL Avastin溶液新包被96孔板一孔，用于下一轮筛选，为了提高筛选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，Avastin的浓度分别降至50μg/mL、20μg/mL。

(16)观察步骤14中测滴度的结果，计数蓝斑的数量以确定噬菌体的滴度，该噬菌体用于第二轮的筛选。在第二轮的筛选中，加入的噬菌体量为2x10¹¹pfu，体积根据步骤14所测定的滴度计算。

(17)进行第二轮筛选，重复步骤2-15，并将TBST中Tween20的浓度提高至0.5％。

(18)用200μL目的蛋白溶液，浓度新包被96孔板一孔，用于第三轮筛选。重复步骤2-8，TBST中Tween的浓度为0.5％，第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取1μL进行滴度测定，剩余存放于4℃。从滴度测定中，菌斑数<100的平板上随机挑取80个分隔良好噬菌斑按下列方法进行扩增和纯化，此时应注意挑取的噬菌斑培养的时间不能超过18h。经过三轮筛选，特异性噬菌体进一步被富集，得到的噬菌体滴度逐步升高。如表1所示。

表1：噬菌体筛选滴度测定结果

 

筛选次数平均滴度第一轮1.5×10⁹pfu第二轮4.3×10⁹pfu第三轮1.1×10¹⁰pfu

(19)阳性噬菌体的扩增，将ER2738的过夜培养物用LB培养液进行1∶100稀释，1mL/管分装于50mL的培养管中。

(20)将用无菌牙签蘸取的80个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入上述(19)培养管中，37℃剧烈振荡培养4.5h进行扩增。

(21)将扩增好的噬菌体液体倒入离心管，瞬间离心30s(12000rpm)。将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次。取80％的上清，即为扩增的噬菌体液体。4℃下可存放几周，若要长时间保存，可加入终浓度为50％的无菌甘油存放于-20℃。

3.1.3.噬菌体特异性筛选(噬菌体ELISA)

在这挑选出的80个克隆中利用噬菌体ELISA进一步挑选与Avastin高亲和力的克隆。

(1)以100mg/LAvastin(0.1mol/L NaHCO₃，pH8.6稀释)包被96孔酶联板，每孔200μL，同时对每个Avastin孔设立人白介素15(IL-15)单抗为阴性对照，4℃孵育过夜。

(2)倾去包被液，加入封闭液(5mg/L BSA，0.1mol/L NaHCO₃，pH 8.6)，4℃封闭2h。

(3)倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻轻扣除尽残余液体。

(4)将80个纯化的噬菌体(1×10⁹/孔)分别加入步骤1设立的包被孔。

(5)TBST洗6次，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗M13噬菌体抗体(1∶5000稀释)100μL，室温孵育1h.

(6)TBST洗6次，邻苯二胺(O-Phenylenediamine)显色后测定A490nm处的吸光值.

根据80个克隆的ELISA结果，以OD值大于0.5，目的OD值与对照OD值之比大于3为基准，筛选出42个与Avastin有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆，结果如图1所示。

3.1.4.对筛选出42个与Avastin有较高亲和力的噬菌体呈现肽的序列测定

(1)噬菌体单链DNA的提取

噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清。用华舜公司生产的单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取，按操作说明书进行操作：在含有单个噬菌体克隆的LB培养液中加入沉淀液，高速离心后得到噬菌体颗粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌体外壳蛋白，经过树脂纯化，洗脱得到噬菌体单链DNA，紫外定量其浓度大于100ng/μL。

(2)Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列

以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为5’—CCCTCATAGTTAGCGTAACG—3’，在ABI 310 DNA自动测序仪上进行自动测序。

(3)呈现随机肽氨基酸序列的推导及氨基酸同源性分析

根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，得出序列如下：

Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro

3.2.疫苗的构建

3.2.1.表位的化学合成

按照上述的多肽表位氨基酸序列结果，采用固相合成法合成以上多肽，合成工作由西安华辰生物科技公司完成，纯度为98％以上。

3.2.2.多肽的化学偶联

采用戊二醛法进行多肽与蛋白载体KLH的化学偶联。

10mg钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)融于2ml pH10的硼酸盐缓冲液中，温和震荡，加入15mg十二肽，缓慢滴入1ml0.3％戊二醛溶液，震荡2小时(溶液变为黄色)，加入1mol/L的甘氨酸作用30分钟终止反应。将反应物在pH8.5的硼酸盐缓冲液中4℃透析过夜，更换缓冲液继续透析4小时以上即可。

3.2.3.构建疫苗的鉴定

以DOT Blot来确定偶联效果：

(1)将偶联的疫苗，以及KLH以相同量(约3μg)仔细点在硝酸纤维素膜(NC膜)上。

(2)以2％ BSA-TBS(pH7.5)封闭NC膜2小时以上。

(3)TBST(0.5％Tween20)洗涤NC膜3次，每次10分钟。

(4)加入TBST稀释的Avastin(4μg/ml)，室温轻摇孵育1小时。

(5)以同样方法洗去未结合的Avastin。

(6)加入TBST稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的抗人二抗，室温孵育30分钟。

(7)TBST洗去二抗，再以TBS洗去Tween 20，以碱性磷酸酶底物显色剂(sigma)避光显色。

结果如图2所示，KLH-模拟表位12肽(KLH-12P)与Avastin特异性结合，sigma显色表现抗原抗体结合，如图2所示的圆形斑块，而对照12肽(KLH-对照12肽)，KLH均不能成功与Avastin结合，sigma显色没有表现抗原抗体结合(在图2中没有任何颜色反应)，即不能模拟VEGF的表位，说明疫苗偶联模拟表位成功。

3.3.动物免疫

3.3.1 实验动物

BALB/c小鼠，4周龄，购自第四军医大学实验动物中心。随机分为4组，每组6只。

3.3.2 实验材料

弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂均购自北京鼎国生物制品公司。上述制备的候选疫苗KLH-12P、KLH-对照12P及对照蛋白KLH。

3.3.3免疫程序

(1)将小鼠随机分为2组，每组6只。

(2)分别将疫苗蛋白及载体蛋白对照与弗氏佐剂混匀，并使之完全乳化。

(3)每两周背部皮下多点注射免疫小鼠一次。每次每只免疫剂量为50μg蛋白。

(4)共免疫四次，首次为弗氏完全佐剂乳化，后两次为不完全佐剂的乳化，最后一次不加佐剂，进行腹腔注射。

(5)末次免疫后10日，眼球取血，并分离血清。

3.4.抗血清鉴定

3.4.1.ELISA测定抗血清与VEGF的结合

3.4.1.1.材料与试剂

96孔酶联板(Costar)，NaHCO₃ pH8.6，KLH-12P，VEGF(sigma)，HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人，及抗小鼠二抗(武汉中山生物制品公司)，ABTS(2，2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐，sigma)。

3.4.1.2.实验方法

(1)以VEGF蛋白包被ELISA板(0.1MNaHCO₃ pH8.6)，包被的蛋白量为50ng/孔，4℃过夜。

(2)次日，弃去孔内溶液，使用1％BSA-TBS，4℃封闭2h。

(3)充分洗涤(3min/次，共6次)后，按照血清含量1％、2％、4％的梯度加入KLH-12P免疫的抗血清，室温振荡孵育2h，同样梯度加入的KLH-对照12P免疫的抗血清、KLH免疫的抗血清做为阴性对照。

(4)充分洗涤后(3min/次，共6次)，加入HRP标记羊抗小鼠二抗，室温振荡孵育1h。

(5)充分洗涤后(3min/次，共6次)，于各个孔中加入OPD显色液，反应5min后，以1M的硫酸终止反应，ELISA读数仪490nm处读数。

结果如图3所示，KLH-12P抗血清在稀释25倍后与VEGF结合最好，在490nm处吸光值最大，而KLH-对照12P抗血清、KLH抗血清在稀释25倍、50倍、100倍时与VEGF的结合基本不变，在490nm处吸光值基本一致。

3.4.2.抗血清抑制血管内皮细胞增殖的作用

3.4.2.1.材料与试剂

(1)细胞

血管内皮细胞(EVC)均在RPMI1640培养基(GIBCO Co)中培养。培养基中含有10％小牛血清(杭州四季青生物制品厂)和100U·ml-1的青霉素、链霉素。

(2)抗血清

抗血清为动物免疫实验中收集的抗血清，KLH免疫、KLH-对照12肽免疫为阴性对照抗血清。

(3)试剂：

MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)、1640培养液、VEGF。

3.4.2.2.实验方法

(1)接种细胞：用0.25％的胰酶消化单层培养的血管内皮细胞，用1640培养液配制成单个细胞悬液，以每孔104细胞数接种于96孔培养板中。

(2)培养12小时后换液，为含5ng/ml VEGF的1640培养液，再分为三组分别加入Anti-KLH血清、Anti-KLH-对照多肽血清、Anti-KLH-12P血清，血清为三个梯度即1％、2％、4％，继续培养。

(3)继续培养血管内皮细胞72小时，然后每孔加入MTT溶液20ul，培养4小时，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150ulDMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟。

(4)酶标仪490nm处读值。

结果如图4所示，1％及2％的KLH抗血清、KLH-对照12P抗血清、KLH-12P抗血清抑制血管内皮细胞的作用均不明显，4％的KLH抗血清、KLH-对照12P抗血清仍不能抑制血管内皮细胞增殖，而4％的KLH-12P抗血清能抑制血管内皮细胞增殖。

3.4.3.抗血清抑制血管内皮细胞迁移的作用

3.4.3.1.材料与试剂

(1)细胞与细胞培养及抗血清如3.4.2.1.所述相同

(2)试剂Mili-Cell，1640培养液，2％多聚甲醛，VEGF。

3.4.3.1.方法与步骤

(1)1640培养液配制1×106/ml血管内皮细胞悬液，分为三组，分别含4％Anti-KLH-12P血清、4％Anti-KLH血清、4％KLH-对照多肽抗血清。

(2)分别接种200ul上述细胞悬液于Mili-Cell上腔，下腔均加入600ul含5ng/ml的VEGF的1640培养液，37℃，5％二氧化碳条件下培养24小时。

(3)将MILICELL上腔取出，用2％多聚甲醛固定10分钟，用棉签轻轻拭去膜上未迁移细胞，随后用结晶紫染色5分钟，纯水漂洗后室温干燥。

(4)取下滤膜置于载玻片上，显微镜下观察，随机计数5个不重复200×的细胞数，计算平均值。

结果如图5、图6所示，4％的KLH抗血清、KLH-对照12P抗血清不能抑制血管内皮细胞迁移，镜下(200×)观察及细胞计数均未发生明显变化，而4％的KLH-12P抗血清能抑制血管内皮细胞迁移，镜下(200×)观察及细胞计数均发现细胞数量明显减少。

以KLH-Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro免疫BALB/c小鼠，获得抗血清，经ELISA检测可以与VEGF特异性结合，滴度可达到1∶6000，稀释25倍的KLH-Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro(KLH-12P)抗血清能抑制血管内皮细胞增殖和迁移。综上所述，基于模拟人血管内皮细胞生长因子VEGF表位的疫苗(KLH-12P)能够应用于人体的VEGF自体疫苗，从而以主动免疫方式来替代或补充单抗被动免疫治疗，为克服单抗治疗缺陷打下基础。