用于慢性肝炎病毒治疗的乙型肝炎病毒抗原分泌的抑制剂

摘要

一种药物组合物，包含有效量的化学式（Ⅰ-Ⅲ）的化合物和药用可接受载体。也提出用于治疗患者体内肝炎病毒的方法，该方法包括施用有效量的所述的化学式（Ⅰ-Ⅲ ）的化合物。

说明书

交叉引用相关申请

本申请要求2006年5月4日递交的美国临时申请号为60/797,581的申请的优先权，该申请的内容通过参考被引用到本申请中。

背景技术

乙型肝炎是世界上最流行的传染病之一。虽然几乎所有个体的感染似乎为急性传染症状，然而大约有30％的病例为慢性传染病。据目前估计，全世界有350-400百万人患有慢性乙型肝炎，每年多数由于肝癌、肝硬化和其他的病发症的进展导致500,000-1,000,000人死亡。尽管提供了有效的疫苗，免疫疗法，干扰素和抗病毒药物，乙肝仍然是一个主要的全球性的健康问题。

致病因子是乙型肝炎病毒(HBV)，一种小DNA病毒，其属于嗜肝病毒科原型成员。HBV为异常复制模式的包膜病毒，其以构建宿主细胞细胞核基因组的共价闭合环状DNA(cccDNA)复制为中心。游离型构建于初感染的部分双链环状DNA(松弛环状DNA，或cDNA)基因组的转化，其功能为作为所有HBV mRNA的模板。与大多数其他的病毒DNA的机制不同，HBV cccDNA通过1.1基因组长度单位的RNA复制(前基因组，或者pgRNA)的反转录进行复制，所述RNA复制最初转录于cccDNA模板，并且由产生子代rcDNA的病毒编码聚合酶起作用。HBV DNA的合成与其壳病毒的装配相关联，并且几乎所有壳内基因组的复制更加有效地与用于病毒装配和分泌的包膜蛋白相结合，其基因组的少数分流到细胞核中转化为cccDNA，因此增加了游离体的含量。

作为由HBV编码的唯一的酶，已被FDA批准的具有四个类核苷酸聚合酶抑制子的聚合酶，已经作为抗病毒药物研究和其他的研究的有效靶标。已在临床上鉴定诊断，聚合酶初始序列的突变赋予其与已经鉴定临床诊断的拉米夫定(lamivudine)和阿德福韦酯(adefovir)抗衡，并且优于延续三年的拉米夫定治疗，其有一血清滴度反弹，有医治70％患者的经验。虽然能够与替比夫定(telbivudine)、阿德福韦酯和拉米夫定抗衡，使其很少发生，然而，已记载，α-干扰素仍是另外一个最大的慢性乙型肝炎疗法，但是由于长期反应效果差和较弱的副作用而被禁止。因此，应用改进技术的治疗来满足医学需要，用于HBV诊疗研究的不同方法是必然的。

除作为病毒的关键结构成分，HBV包膜是疾病过程的主要因素。在慢性感染个体中，血清的HBV表面抗原(HBsAg)含量高达400μg/ml，由嗜染性细胞产生的分泌型非感染亚病毒粒子远远大于感染型(Dane)粒子。HBsAg包含乙型肝炎病毒感染中的主抗原决定簇，并且由小、中、大表面抗原构成(分别为S，M，L)。这些蛋白由作为三个分离的糖基化多肽的单一的开放读码框通过利用可替换的转录起始位点(用于L和M/S mRNAs)和启动子(用于L，M和S)获得。

虽然病毒聚合酶和HBsAg执行不同的功能，但是它们都是病毒完成其生命周期和有感染性的重要蛋白。这就是说，缺少HBsAg的HBV蛋白是完全缺陷型的，不能感染或引起感染。HBsAg用于保护病毒的核壳，启动感染周期，并且能够调节由感染细胞产生的新生病毒的形态发生和分泌。

慢性感染HBV的患者通常能够用可检测量的病毒壳体(HBc)的特异性循环抗体来鉴定，如果是HBsAg抗体通常为很少的任意可检测量。有证据表明慢性携带者确实产生HBsAg抗体，但是这些抗体与循环的HBsAg复合，其可在毫克/毫升量的慢性携带者的循环中产生。

减少HBsAg循环量的数量可使任意HBsAg抗体的产生增加，并且该抗体能够排除感染。然而，即使是不含HBsAg的核壳体能够表达或分泌到循环中，可能导致细胞死亡，但是会需要高含量的HBc抗体快速与其复合，并且导致HBc被清除。

慢性鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的研究已经表明，感染型肝细胞培养物中产生的亚病毒粒子具有反式激活病毒基因组复制的功能。除此之外，HBV生物学长久以来的宗旨是抑制病毒特异性免疫应答的表面抗原循环功能。在慢性旱獭类肝炎病毒(WHV)感染中，通过克拉夫定诊疗减少抗原将会产生免疫正效应，表明循环抗原可能确实抑制免疫效应。此外，病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的缺乏慢性WHV和HBV感染的重要标志，可能是由于通过感染性肝细胞中L和M的细胞内表达抑制MHCI产生。目前存在的FDA-批准的诊疗方法不能明显地影响血清内的HBsAg水平。

发明内容

本发明涉及一种药物组合物，包含选自化学式I、II、III及其混合物的有效量的化合物：

其中

R₁-R₆是独立的苯基或杂环，其中每一苯基或杂环可被利用至少一个选自以下群组的取代基独立地随意取代：(C_1-7)烷基、(C_2-6)烯基、(C_2-6)炔基、(C_2-7)烷酰基、(C_2-7)芳胺基、(C_3-12)环烷基、(C_1-7)酰基、芳基、卤素、OR_a、三氟甲氧基、三氟甲基、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、CO₂R_a、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b、P(＝O)(OR_a)(R_a)和杂环，其中(C_1-7)烷基或(C_3-12)环烷基被利用1-5芳基、杂环、ORa、卤素、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、CO₂R_a、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b或P(＝O)(OR_a)(R_a)各自独立随意取代；

X₁-X₆是独立的键或饱和或不饱和亚烃基；

R_a和R_b分别代表H、(C_1-7)烷基、(C_3-12)环烷基、(C_2-7)烷酰基、(C_2-7)芳胺基、或芳基、或R_a和R_b和与其连接的氮原子一起形成杂环；

m为0、1或2；

n为0、1、2、3或4；

或选自以下群组的所述化合物的衍生物：N-氧化衍生物、前药衍生物、保护的衍生物、异构体、和所述化合物异构体的混合物；或所述化合物或所述衍生物的药用可接受盐或溶剂化物；及

(b)药用可接受的载体。

也提供化学式IV、V或VI的化合物：

其中

R₇和R₈是独立的苯基或者杂环，其中每一苯基或杂环由独立选自以下群组中的至少一个取代基独立随意取代：(C_1-7)烷基、(C_2-6)烯基、(C_2-6)炔基、(C_2-7)烷酰基、(C_2-7)芳胺基、(C_3-12)环烷基、(C_1-7)酰基、芳基、卤素、OR_a、三氟甲氧基、三氟甲基、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、CO₂R_a、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b、P(＝O)(OR_a)(R_a)和杂环，其中(C_1-7)烷基或(C_3-12)环烷基被利用1-5芳基、杂环、ORa、卤素、NO₂、NR_aR_b、氰基、CONR_aR_b、CO₂R_a、SO_mR_a、S(O)_mNR_aR_b或P(＝O)(OR_a)(R_a)各自独立随意取代；

X₇-X₈为独立的键或饱和或不饱和的亚烃基；

R_a和R_b分别代表H、(C_1-7)烷基、(C_3-12)环烷基、(C_2-7)烷酰基、(C_2-7)芳胺基、或芳基、或R_a和R_b和与其连接的氮原子一起形成杂环；

m为0、1或2；

n为0、1、2、3或4；或

选自以下群组的所述化合物的衍生物：N-氧化衍生物、前药衍生物、保护的衍生物、异构体、和所述化合物异构体的混合物；或所述化合物或所述衍生物的药用可接受盐或溶剂化物；

当R₇是甲基、p-MeOC₆H₄或p-BrC₆H₄，R₈是未取代的苯基，并且X₇和X₈分别为单键时；或者当R₇是未取代的苯基，R₈是未取代的苯基、甲基、p-MeOC₆H₄或p-BrC₆H₄，并且X₇和X₈分别为单键时，所述化合物是化学式VI的化合物；及

当R₇是H，R₈是未取代的苯基、甲基、p-MeOC₆H₄或p-BrC₆H₄，并且X₇和X₈分别为单键时；或者当R₇是p-ClC₆H₄，R₈是未取代的苯基，并且X₇和X₈分别为单键时；或者当R₇是未取代的苯基，R₈是p-ClC₆H₄，并且X₇和X₈分别为单键时，所述的化合物是化学式IV或VI的化合物。

用于治疗患者的肝炎病毒的方法，按患者需要量，给患者施用有效量的化学式I-III的化合物。在一个实施例中，所述方法包括给患者施用化学式I-III的有效量的化合物，所述化合物减少所述患者的乙型肝炎表面抗原的血清浓度水平。

附图说明

图1是高通量筛选模式的示意图。括号中的数字表示在相应步骤中选择得到的化合物数；

图2a-b描述分别通过HBsAg ELISA和MTT检测测定HepDE19细胞中的EC₅₀和CC₅₀。所有的数据点为复制孔中的平均数。通过XLfit 4.0软件获得最合适的曲线和计算，如果有必要特殊处理，去除产生的R²超过0.5的值。化合物的浓度用以10为底的对数值表示，为(从左到右)0.0158、0.05、0.158、0.5、1.58、5.0、15.8、50.0μM。抑制分泌的百分数和活性损失的百分数对比只加DMSO测定，得到0％的抑制率和0％的活性损失率；

图3a-d表明通过二次筛选测定HBF-0259的活性。(A)处理HepG2.2.15细胞，Westernblotting分析细胞培养上清中的L、M、AGP和α1-抗胰蛋白酶。Western杂交检测整个HepG2.2.15细胞裂解液中的L、M和肌动蛋白。(B)如(A)中只加HBF-0259或DMSO处理所得HepG2.2.15的培养物上清液，在非变性状态下，通过dot blot EIA分析其中所有的HBsAg。(C)ELISA捕获分泌型HBeAg检测只加指定量的HBF-0259、1mM DTT或DMSO处理2.2.15细胞的培养物上清。规范读取计算只加DMSO的样品的抑制分泌百分率，分泌率为100％，或抑制率为0％。(D)通过HBF-0259延时培养，或只加DMSO，分析对HepG2.2.15细胞分泌L、M、AGP的影响。上清液从第三天起每三天收集一次，一直到24天。应用如(B)中的Western blotting分析样品；

图4表明HBF-0259处理对胞内HBV DNA合成和包含分泌型HBV DNA粒子的影响。用HBF-0259或DMSO激活处理HepDE19细胞，然后连续培养6天之后，再用四环素处理7天。为细胞内核相关的DNA(顶部条带)、分泌的粒子(粒子检测，中部条带)和所有细胞外病毒DNA(底部条带)收集和处理单细胞层和培养上清液；

图5a-b表示HBF-0259对S型和M型外源表达分泌的抑制。(A)HepG2细胞与编码S-HA的质粒pNI2.SHA转染，并且用指定的4μM HBF-0259或DMSO处理48h。收集培养上清和单层细胞，Western blotting分析S-HA。p24和gp27分别代表非糖基化和糖基化S-HA，其通过SDS-PPAGE分离与预期一致。(B)HepG2细胞与编码M-HA的质粒pTRE-MSHA转染，如(A)中的方式进行处理，使用适当的抗体(Ab)，Westernblotting分析M-HA或preS2。p30、gp33和gp36代表非糖基化、单糖基化和双糖基化M-HA(EC，细胞外；IC，细胞内)；

图6a-d表示HBF-0259的抗病毒图谱。(A)于96微孔板中，使用指定量MOI的BVDV感染MDBK细胞，加HBF-0259或DMSO处理。活力百分率为四倍样品的平均值。通过DMSO处理使其非感染平均值控制在100％，计算活力百分率。(B)接种MDBK细胞于6孔板中，在覆有半固体膜，加有HBF-0259或DMSO下，用总含量大约为100PFU/ml的BVDV感染。结晶紫染色使噬斑可见。(C)培养平皿中，用指定量的MOI感染Vero细胞，并且如(A)中的方式进行处理。(D)用总含量大约为100PFU的HSV1感染Vero细胞，并且如(B)中方式进行处理；

图7是HBF-0259对初生态SAR分析所得结果表。R₁和R₂表示如图2a所示的取代基团。R表示中心基团四氢-四唑-嘧啶(NA，没有活性。UD，没有检测出毒性。ND，没有测定)。

具体实施方案

本发明涉及一种组合物和治疗患者的肝炎病毒的方法。

对本发明的整体描述如上所使用的下述术语，除非有特别指定，都应按下面的意思理解：

“患者”指包括人类在内的哺乳动物。

“有效量”指有效治疗肝炎病毒并能产生预期治疗效果的本发明化合物的量。

“治疗”或“治疗处理”或“处理”指减缓、消除、抑制、改善、改变，或者阻止疾病或病灶，例如通过施用本发明的化合物。

“烷基”指可为大约含1至10个碳原子的支链或直链的脂肪族烃类基团。优选的烷基是含有约1至3个碳原子的低“链烷基”；更优选的是甲基。支链指一个或多个与线性烷基主链相连的诸如甲基、乙基或丙基的低烷基基团。所述烷基基团可被烷氧基、卤素、羧基、羟基或R_eR_fN-(其中R_e和R_f是独立的氢或烷基，或者R_e和R_f与跟它们连接的氮原子一起形成氮杂环)随意取代；更优选可被氟取代。烷基的例子包括甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、三氟甲基、乙基，n-丙基，异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。

“环烷基”指含有大约3到7个碳原子的非芳香单环系。优选的单环烷基包括环戊基、环己基和环庚基；更为优选为环己基、环戊基。

“芳基”指含有大约6到10个碳原子的芳香碳环基。芳香基的例子包括苯基、萘基，或者由一个或多个相同或不同的芳基取代基取代的苯基或萘基，所述“芳基取代基”包括氢、羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或者Y₁Y₂NCO-，其中Y₁和Y₂为独立的氢或烷基。

“杂环”是具有由1、2、3或4个杂原子构成的4-(4)、5-(5)、6-(6)或7-(7)元饱和或不饱含杂环，所述杂原子选自氧、硫醇、亚硫酰基、磺酰基和氮组成的群组，所述环可随意融合苯环。杂环包括“杂芳基”，其由大约5到10元芳香单环基或双环基烃环系构成，其单环系中大约有一到三个原子，双环系中大约有一到四个原子，该原子是除了碳原子的元素，例如是氮、氧或硫。该“杂芳基”也可以被一个或多个上面提到的“芳香基取代基”取代。典型的杂芳基基团包括取代的吡嗪基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、异唑基、异噻唑基、氧氮茂基、噻唑基、吡唑基、呋吖基(furazanyl)、吡咯基、咪唑并〔2，1-b〕噻唑基、苯并呋吖基(benzofurzanyl)、吲哚基、氮杂吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、氨基喹啉、咪唑基和异氨基喹啉。

“酰基”指H-CO-或在先前提到的烷基基团的烷基-CO-基团。优选的酰基为低链烷基。典型的酰基基团包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、2-甲基丙酰基、丁酰基和己酰基。

“烷氧基”指先前在烷基基团提到的烷基-O基团。优选的烷氧基为含有大约1到3个碳原子的低链烷氧基；更为优选的是甲氧基。该烷氧基可被一个或多个烷氧基、羧基、烷氧羰基、芳香羰基或R₆R_fN-(其中R₆和R_f在前面已经定义)随意取代。典型的烷氧基团包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、异丙氧基、n-丁氧基、己氧基，2-(吗啉-4基)乙氧基和2-(乙氧基)乙氧基。

“芳氧基”指先前在芳基基团中提到的芳基-O基团。

“酰氧基”指先前在酰基基团中提到的酰基-O基团。

“羧基”指COOH-(羧酸)基团。

“R₆R_fN-”指取代和未取代的氨基，所述R₆和R_f在前面已经描述。典型的基团包括氨基(NH₂-)，甲氨基、乙基甲氨基、二甲氨基和二乙氨基。

“R_eR_fNCO-”指取代和未取代的氨甲酰基基团，所述R₆和R_f在前面已经描述。典型的基团为氨甲酰基(NH2CO-)和二甲基氨基甲酰基(Me₂NCO-)。

“酰基R_eN-”指酰氨基团，所述R_e和酰基如本文的定义。

“卤素”指氟、氯、溴或碘。优选的是氟、氯或溴，更优选的是氟或氯。

“前药”指适合患者施用而无毒性、刺激性、过敏性反应等并能够达到预期使用效果的化学式I的化合物形式。前药在体内转化产生如上所述化学式的母化合物，例如在血液中被分解。如由T.Higuchi和V.Stella研究，A.C.S讨论协会，第14卷上发表的，作为新型给药系统的前药中，及由Edward B.Roche等，在1987年由美国药物联盟发明的生物可逆性药物设计中，述及的清晰讨论，都参考引用在该文中。

“溶剂化物”指本发明的化合物与一个或多个溶剂分子物理缔合。该物理缔合涉及不同程度的离子和共价键，包括氢键。在具体实例中的溶剂化物能够分离，例如当一个或多个溶剂分子嵌入晶体的晶格中时。“溶剂化物”包括液相和可分离的溶剂化物。典型的溶剂化物包括乙醇溶剂化物、甲醇溶剂化物能。“水化物”是溶剂分子是水的溶剂化物。

“环结构取代物”指分子中环连接的任何原子和基团。

现有领域的技术人员应当理解，本发明的化合物具有在可选择的主动和外消旋的形式下能够存在或分离的手性中心。有些化合物可具有形式多态性。可以理解的是，本发明包括所有外消旋、光学活性、多态性、互变异构、或立体异构形式，或它们的混合物，本发明的化合物具有此处描述的重要特性，如何准备可选择的活性形式(例如，通过重结晶技术拆分外消旋形式，由起始材料的光学活性合成，手性合成，或者使用手性固定相进行色谱分离)对现有技术来说是熟知的。

本发明的一实施例为一药物组合物，其中化学式I中的R₁和R₂为可由至少一个独立选自于(C_1-7)烷基、卤素OR_a的取代基独立随意取代的苯基。

本发明的另外一个药物组合物的实施例，其中X₁和X₂分别为一键和，R₁为和R₂为

该实施例中化合物在此处也指＂HBF-0259＂或＂7-(2-氯-6-氟-苯基)-5-(4-氯-苯基)-4，5，6，7-四氢-四唑[1，5-a]嘧啶。＂

可理解的是本发明包括本文述及的所有具体和优选的基团的适当组合。

本发明的化合物可通过文献中熟知的已知化合物和易合成的中间物的处理过程获得。例如，在杂环化合物化学的37卷，747-54页(2001)中，由Desenko，S.M.等披露的部分氢化的芳族取代的四唑[1，5-a]嘧啶的制备方法。化合物也可以取自于ChemDiv公司(加利福尼州圣地亚哥)。

药物组合物包含化学式I-III的化合物，例如能够治疗患者体内的肝炎病毒。肝炎病毒的实例包含诸如乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒的嗜肝病毒科家族。

在一实施例中，药物组合物进一步包括一抗病毒化合物。在另外一个实施例中，抗病毒化合物选自于核苷抗病毒化合物、核苷酸病毒化合物和它们的混合物。

还提供了一种通过按需要给患者施用有效量的化学式I-III的化合物，用于治疗患者的肝炎病毒的方法。另外一个治疗患者的肝炎病毒的方法，包括给患者施用有效量的化学式I的化合物，所述化合物减少所述患者的乙型肝炎表面抗原的血清浓度水平。

实际上，包含化学式I-III的化合物的组合物可以任何适当的形式被摄入，例如吸入、局部施用、肠胃外、直肠给药或口服。更为特殊的摄入途径包括静脉、肌肉、皮下、眼内、结肠内、滑膜腔内、腹腔内，经上皮包括透过皮下、眼、舌下、口腔、真皮、眼球，通过吸入剂和气雾剂鼻腔吸入。

化学式I-III的化合物的组合物以最适当的摄入途径摄入。本发明还涉及包含化学式I-III的化合物的摄入组合物，其适于作为患者药物。该组合物可通过使用一个或多个可接受的药物佐剂或辅料的常用方法合成。该佐剂包括，尤其是稀释剂、无菌水合介质和各种无毒有机溶剂。该组合物可以为口服给药形式或者注射剂方式或悬液形式。

赋形剂和赋形剂中的化学式I-III的化合物的选择，通常根据产品的可溶性和化学特性、具体施用模式和药物实践中遵守的规定决定。当使用水合悬液时，它们可包含乳化剂或有利悬浮的试剂。也可使用诸如蔗糖、乙醇的稀释剂，诸如聚乙二醇、丙二醇、甘油和氯仿或者它们的混合物的多元醇。除此之外，化学式I-III的化合物可加入缓释制剂和配方中。

对于肠胃外摄入，本发明化合物的乳液、悬液或溶液使用诸如麻油、花生油或橄榄油的蔬菜油，或者使用诸如水和丙二醇的水合有机溶液，诸如油酸乙酯的可注射有机酯，还有药用可接受盐的无菌水溶液。可注射形式必须是容易注射的液体范畴，并且能够维持正常流动，例如使用诸如卵磷脂的被覆，表面活性剂使其在扩散时能够维持需要的颗粒大小。通过使用延长吸收成份达到可注射组分的延长吸收，例如，单硬脂酸铝和明胶。本发明的产品的盐溶液尤其适用于肌肉注射和皮下注射。化学式I-III的化合物溶液作为一自由基或药用可接受盐，可在水中与诸如羟基纤维素的表面活性剂适当混合制备。也可以在甘油、液态聚丙二醇和它们的混合物以及油脂中分散制备。所述水合溶液，也包括纯蒸馏水中的盐溶液，可用于静脉注射，在一定的条件下，调整其适当的PH值，配置缓冲溶液，使用适当量的葡萄糖或氯化钠保持等渗，通过加热、紫外、微孔过滤灭菌，和/或加入不同的抗病毒和抗真菌成份，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

无菌注射液的制备为，过滤灭菌后，加入需要量的化学式I-III的化合物于含有如上列举的不同组分的合适溶剂中。通常，加入不同的灭菌活性成份于包含基本分散介质和所需的上面列举其他成分的灭菌器皿中溶解制备。当制备无菌注射液的无菌粉末时，优选的制备方法为，使用真空干燥和冷冻干燥技术，其产生加有来自于先前灭菌的溶液中添加的必要成份的活性成份的粉末。

局部给药可使用包含化学式I-III的化合物的凝胶(以水或酒精为介质)、乳膏或软膏。化学式为I-III的化合物也可以加入凝胶或基质中治疗斑块，其会通过通透屏障控制化合物的释放。

对于吸入摄入法，化学式I-III的化合物可使用雾化器或悬浮液或雾化溶剂，将其溶解或悬浮于合适的载体中，或者可使用干粉吸入剂，将其吸收或吸入适当的固相载体中。

可以改变本发明组合物的化学式为I-III的化合物的使用百分比，构成一定的比例以使得到适当的剂量是必须的。很显然，在大致相同的时间可摄入几个单位剂量形式。施用剂量由医生或合格的医疗专业人员确定，取决于理想治疗效果，摄入途径和治疗时间，以及患者的症状。成人中，剂量通常为，每天通过吸入摄入0.001到大约50，更为优选的是0.001到大约5mg/kg体重，每天通过口服摄入0.01到大约100，更为优选的是0.1到70，尤为优选的是0.5到10mg/kg体重，每天通过静脉注射摄入大约0.001到10，更为优选的为0.01到10mg/kg体重。在每个具体病例中，根据治疗患者的特定因素情况来决定剂量，例如年龄，体重、健康情况或其他因素，其能够影响本发明的化合物的效应。

为了获得理想的治疗效果，本发明的化学式I-III的化合物可能经常在必要时摄入。一些患者可能对稍高或稍低的剂量很快产生反应，需要确定小的多的足够维持的剂量。对于另外一些患者，根据每个患者的生理需要，可能必须在每天施用1-4倍剂量的情况下长时间诊治。通常化学式为I-III的化合物每天可以1-4倍的剂量施用。当然，对于另外一些患者，可能必须每天施用的剂量不超过一或二倍。

以下的非限制性实施例，进一步阐述表明本发明的某些特征。

实施例

细胞培养、病毒、抗体和质粒。为了检测研究和高通量筛选，HepG2.2.15细胞培养于添加有青霉素和链霉素(加利福尼亚卡尔斯巴德的Invitrogen)，10％胎牛血清(FBS)(佐治亚州亚特兰大的亚特兰大生物制剂)，和0.1mg/ml Normocin(加利福尼亚圣地亚哥的InvivoGen)的RPMI培养基中。HepDE19细胞系是基于具有某些修饰的HepAD38细胞系的延伸。简单而言，HepG2细胞与表达四环素(tet)-反应性转录因子(tTA)的质粒pTet-off(加利福尼亚州芒廷维尤的Clontech)，和在HBV pgRNA表达中被带有tet反应元件(TRE)的初期启动子的巨细胞病毒控制的质粒pTREHBVDE转染。使用G418筛选转染HepG2细胞，在不含有四环素的培养基中扩增培养使HBV复制，并且应用southern blot分析病毒DNA的复制水平。筛选HBV高复制的细胞指定为HepDE19。在该细胞系中，整个1.3单位长度的HBV基因组的5’末端前C区的起始密码子AUG被去除，以阻止转基因中的HBeAg表达，但是在病毒DNA复制和随后的cccDNA形成过程中，可能会使前体基因组RNA的3’末端冗余恢复。因而，HBeAg只翻译转录自游离型cccDNA的前C区mRNA。HepDE19细胞培养于含有青霉素和链霉素(Invitrogen)，10％FBS，500μg/ml G418(Invitrogen)和1μg/ml四环素(卫生部圣路易斯(St.Louis，MO)的Sigma-Aldrich)的DMEM/F-12培养基中。HepG2细胞使用与HepG2.2.15相同的培养基。

单纯疱疹病毒类型1(HSV1，菌株K057)于含有青霉素，链霉素和10％FBS的DMEM/F-12培养基中的Vero细胞中培养繁殖。牛病毒性腹泻病毒(BVDV，菌株NADL)于含有青霉素，链霉素和10％马血清(Invitrogen)的DMEM/F-12培养基中的MDBK细胞中培养繁殖。收集病毒细胞原液为，将根据观测整个细胞病变效应的细胞培养基刮收，离心，在适当的培养基中冻/融细胞团，并且嗜菌斑试验测其滴度。将这两种病毒的储液稀释10倍，然后于含有用于培养Vero或MDBK的含有10％FBS的培养基上敷一层甲基纤维素膜的六孔板中进行嗜菌斑检测。嗜菌斑通过用结晶紫染色可见计数。

HBsAg ELISA中用于检测的抗体如下：第一捕获抗体为小鼠表面抗原HBV单克隆抗体(Fitzgerald产业，Concord MA)；检测抗体为抗小鼠表面抗原单克隆抗体-辣根过氧化物(Abbott Diagnostics，Abbott Park，IL)。用于Western blotting的抗体为：抗兔preS2区域的HBV多克隆抗体(Fitzgerald)；兔抗人α-1-酸-糖蛋白单克隆抗体(Sigma-Aldrich)；鼠抗人α-1-胰蛋白酶单克隆抗体(美国得克萨斯蒙哥马利Bethyl实验室)；抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体(加利福尼亚州Temecula国际单克隆)；和抗小鼠HA单克隆抗体(加利福尼亚州伯克利Covance)。用于蛋白dot blot检测的抗体为单克隆抗HBsAg抗体(DakoUSA，Carpinteria，CA)。

表达哺乳动物中C末端带有HA标签的HBV S(ayw亚型)的质粒pNI2.SHA，由德国美因茨的约翰内斯堡(Johannes Gutenberg)大学的Reinhild Prange博士馈赠。为了获得哺乳动物中表达M和S型(ayw亚型，V01460分离型)HBV的pTRE-MS质粒，使用由pUCl 19CMV-HBV质粒获得的pfu聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)PCR扩增3174-1-1980个核苷酸的核苷酸片断，然后将其转入pTRE2(Clontech)中。由pNI2.SHA中的Avrll-Ncol(41-2168核苷酸)片断取代pTRE-MS中的Avrll-Ncol fra片断(650-844核苷酸)，获得表达C末端带有HA标签M和S型(ayw亚型，V01460分离型)HBV的pTRE-MS质粒。

化合物的来源和处理。由80,288种化合物构成的IHVR小分子集引自ChemDiv公司(加利福尼亚州圣地亚哥)，Asinex公司(Winston-Salem，NC)，Chembridge公司(加利福尼亚州圣地亚哥)，和Maybridge公司(英国康沃尔)的完整库。该化合物通过去除通常反应活性的化合物、对非特异性生活性的结构修饰已知的，cLogP值超过5.0，分子量在500道尔顿以上以及其他标准的化学信息分析从每个公司的最大库中筛选。由于IHVR库的部分，ChemDiv和Asinex公司的16,000中化合物的合并，库(～64,000)的大部分是高度多变的。虽然我们无法对它精确确定，然而该集团中的不同药效基因有成千上万。总体上来说，IHVR库的平均分子量大约为350道尔顿，最大cLogP值为5.0。

将购来的干粉状化合物置于96孔“母”板中，用超纯的二甲基亚砜悬浮使其最终浓度为10mM，再用DMSO在工作储存(“子代”)板中稀释至1mM。化合物于-20℃，在加盖的聚丙烯板中储存。

由ChemDiv公司重新合成HBF-0259和其他的化合物。HBF-0259类似物和其它化合物自ChemDiv、Asinex、Chembridge和Maybridge获得。

高通量检测和化合物筛选。HBsAg ELISA捕获样品的制备，在每个聚丙乙烯96孔板的孔中，加25μL用结合缓冲液(0.17％ Na₂CO₃，0.29％ NaHCC₃，pH9.6)将其稀释到0.9mg/mL的HBsAg单克隆抗体(克隆M701077，Fitzgerald)孵育。4℃过夜孵育，然后每孔加150μL含有0.5％ Tween 20的PBS/(PBST)震荡洗两次。捕获样品加150μL含有2.0％BSA的PBST于37℃封闭1小时，然后再用如上的方法洗两次。洗完第二次之后，转移筛选板中的细胞培养物上清，并且如下描述进行处理。

HepG2.2.15细胞培养物储液生长至汇合，胰蛋白酶消化、离心，PBS悬浮洗一次再离心，以5.0*104细胞/孔的浓度转接于有新鲜培养基的96孔板中，为了获得新鲜的单克隆，培养基中不含有先前的分泌型HBV抗原。每个筛选平板由80个化合物检测孔构成，4孔中的细胞只含有1.0％的DMSO，4孔含有DMSO不含细胞，4孔中的细胞含有作为非特异性参照抑制剂DMSO和1mM二硫苏糖醇(DTT)。细胞转接之后，子代化合物平板立即置于37℃解冻，然后将化合物加入筛选平板中通过含有1.0％ DMSO最终浓度为10μM的自动处理液处理。筛选平板在含有5.0％ CO₂的空气中于37℃培养六天。培养之后，从每孔转移150μL培养基至封闭捕获平板中，再于4℃培养4天，去除培养基，洗平板，加25μL/每孔检测抗体(在含有2.0％BSA的PBST中稀释至0.625ng/mL)。将平板于37℃孵育1小时，150μL/每孔PBST摇动洗两次，加50μL/每孔BM蓝色过氧化物酶底物(POD，Roche，Indianapolis，IN)。将平板置于室温放置20分钟后，使颜色改变可鉴别。与此同时，准备细胞染色筛选平板，并且用50％的乙醇0.5％结晶紫染色，然后每种化合物的整个毒性通过化合物孔中的染色单克隆和负对照孔中的可见对比来鉴定。

为了鉴定目标化合物的活性，抑制50％分泌活性(EC₅₀)的有效浓度，通过如上描述的ELASA，在含有浓度为50μM-0.016μM(一半步骤中)的化合物的复制孔中孵育细胞测定。用SLR雨虹分光 光度计(Tecan US，Research TrianglePark，NC)，于650nm，参照波长为490nm下，测定试验检测板的吸光度，并且用XLfit4.0(IDBS；Bridgewater，NJ)对结果进行最佳曲线分析。通过对比只加DMSO培养细胞的多个负对照样品计算抑制程度。另外，每板的多个含有DTT的孔作为参照抑制剂。只有R2值超过0.5的曲线被认为是有效的EC₅₀值。

表现50％细胞毒性的浓度(CC₅₀)，通过以1.0*104/每孔(20％的汇合)的浓度接种细胞对细胞生长的抑制，对比不加化合物的细胞测定。然后接种细胞与如上描述的稀释化合物对照，加3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯四唑溴(MTT，Sigma-Aldrich)使最终浓度为0.5mg/ml进行孵育。过夜孵育后，每孔加与培养基(100μL)相等的10％ SDS/0.01N HCl，接种板再于37℃孵育4小时。用雨虹分光光度计，于570nm(参照波长为630nm)下读吸光度，并且用如上描述的XLfit4.0分析。

每个化合物的可选择指数定义为SI＝CC₅₀/EC₅₀。

化合物处理细胞和HBV抗原的免疫检测。以1.0*106细胞/35mm孔接种三组HepG2.2.15于6孔板中，为了获得新鲜的单克隆，培养基中不含先前的分泌型HBV抗原。对照孔中含有0.5％ DMSO，并且在含有总浓度为0.5％ DMSO的每个接种板中检验孔含有指定浓度的化合物。每个样品的培养物收集，离心后，保留上清，接种板在含有5.0％ CO2的空气中于37℃培养6天。以3:1的比例将上清与4*SDS-PAGE负载缓冲液(20OmM Tris-HCl(pH6.8)，400mM DTT，8％ SDS，0.4％溴酚蓝，40％甘油)混合。对应样品的单克隆细胞在2*SDS-PAGE负载缓冲液中裂解和收集。每个样品20μL煮沸5分钟，10％SDS-PAGE电泳分离，转膜到BiotracePVDF膜上(Pall公司；Pensacola，FL)。按操作说明使用WesternBreeze(Invitrogen)试剂，进行西方(Western)印迹。使用增强化学发光试剂(GE医疗联合公司)检测抗体吸收的信号，ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)测定反应膜的密度。

为了检测HBV e抗原(HBeAg)，从设定用于EC₅₀测定的HBsAg ELISA板中的每孔中取50μL上清液，利用引自国际免疫诊断(加拿大福斯特城)的HBsAgELISA试剂盒，最终不加H₂SO₄进行分析。在650nm，对照为490nm下测定吸光度。

南方(Southern)印迹和粒子检测。从按先前描述(19)的化合物处理的HepDE19和HepG2.2.15细胞中提取胞内病毒核DNA。简单地说，取60mm平皿上的细胞用1mL的裂解液(10mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA，1％ NP40和2％蔗糖)于37℃下裂解10分钟。离心去除细胞碎片和细胞核，上清用250μL含有1.5M NaCl的35％的聚乙二醇(PEG-8000)混合。在冰上孵育1小时之后，加入400μL消化液[0.5mg/ml链霉蛋白酶(Calbiochem，San Diego，CA)，0.5％ SDS，150mM NaCl，25mM Tris-HCl pH8.0，和10mM EDTA]于37℃消化处理1小时，然后于4℃，1200g，离心10分钟，沉淀病毒核壳。消化混合液用苯酚抽提两次，乙醇沉淀DNA，再将其于TE缓冲液(1OmM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)溶解。取每个平板中的DNA样品的六分之一，1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶在1M Tris-HCl(pH7.4)和1.5M NaCl中和后，然后，用含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的溶液变性。之后，DNA在含有20X SSC缓冲液的Hybond-XL膜(GE Healthcare)中杂交。膜用α-32P-UTP(800Ci/mmol，Perkin Elmer)-标记的HBV负特异链探针标记。用0.1*SSC和0.1％ SDS在65℃洗1小时之后，在5mL EKONO杂交缓冲液(Genotech，St.Louis，MO)中先于65℃预杂交1小时，然后再于65℃过夜杂交。该膜用感光成像胶片曝光，使用QuantityOne软件(Bio-Rad)定量杂交信号。

对于HBsAg打点法(dot blot)检测，在指定的时间点收集液体培养物，于1，000rpm离心10分钟，在4℃储存。将四十微升上清点于硝酸纤维素膜上(Schleicher& Schuell/Whatman，Florence Park，NJ)，自然晾干，在含有2.5甲醛的PBS中浸泡30分钟，用水稍微冲洗，然后在50％甲醇中浸泡30分钟，每次用水洗5分钟三次之后，封闭膜，再用抗HBsAg单克隆抗体(DakoUSA，Carpinteria，CA)标记，洗膜，再用结合HPR的二抗孵育。使用增强化学发光检测系统(Amersham PharmaciaBiotech)使结合可见。

对于DNA打点法(dot blot)检测，点400μL上清于硝酸纤维素膜上，自然晾干，再在含有1.5M NaCl的0.2M NaOH中浸泡膜30分钟，使含有DNA的粒子变性。然后滤膜用包含1.5M NaCl的0.2M Tris-HCl，pH7.4复性30分钟，用TNE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA)洗膜，晾干。用如上描述的杂交法检测病毒DNA。

如先前的描述(33)进行HBV粒子检测。简单地说，病毒粒子沉淀自于4℃培养1小时之后，添加有最终浓度为10％的PEG-8000的1mL的澄清液体培养物。于925xg离心20分钟收集沉淀物，再于40μL DMEM/F12的培养基中溶解。1％的琼脂糖凝胶电泳分离病毒粒子，再转膜到由TNE杂交的硝酸纤维素滤膜上。然后使滤膜上DNA的粒子的变性、复性，再用如上描述的杂交法检测病毒DNA。

转染和化合物处理。接种1.0*105个/孔(40-80％汇合)HepG2细胞于24孔板中。对于每个转染情况，根据产品说明，加Fugene 6转染试剂(Roche Diagnostics)于培养基，然后在室温孵育5分钟。加1μg/mL质粒DNA，混合物于室温孵育30分钟。然后将转染混合物以滴状加入100μL/孔的细胞中，再于37℃过夜培养。第二天，去除转染混合物，将含有4μM HBF-0259或0.5％DMSO的新鲜培养基加入每孔。细胞用HBF-0259处理6天之后，换培养基和化合物培养3天。培养之后，收集培养物上清和单克隆细胞，分别通过Western blot作S-HA和M-HA分析用。

结果

作为HBV表面抗原分泌物的抑制剂的HBF-0259的鉴定。用“夹层结构”的ELISA设计，定量检测HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg的表面抗原，高通量筛选IHVR集中的80,288种化合物。初筛得到1,758个标记物，确定为至少50％抑制分泌的化合物。通过结晶紫染色初筛的细胞，由于其中1607个在10μM时具有充分的毒性，记为抑制剂，而当在多个不同浓度(10、3.6、1.0、0.36μM)重复检测初步筛选检测时，不能重复抑制HBsAg分泌。其余的151个用更宽浓度范围(50-0.016μM)的化合物重复分析初筛的细胞，以确定EC₅₀，并且在相同浓度时用MTT测定确定CC₅₀。该检测在我们组培养的HepG2.2.15和the HepDE19两种细胞系中进行。其中，发现77个的SI值等于或高于4.0，选择以备进一步检测。由于通过ELISA检测筛选鉴定抑制天然“a”表面抗原分泌的能力，因此我们用西方印迹(Western blotting)二次检测分析确定其全长、变性的表面抗原的效应。因此，用每个浓度为8，4，2，1，0.5和0.25μM的化合物处理HepG2.2.15细胞，分析L和M型分泌。其中，鉴定大约有16种化合物能够极大影响，重复抑制大型和中型抗原。用HPLS/质谱分析这些化合物的纯度。发现几乎所有的至少有90％的预期物质构成。根据对化学处理和成本估算常规预测，选择四氢-四唑-嘧啶(具体而言，7-(2氯-6-氟-苯基)-5-(4-氯苯基)-4，5，6，7-四氢-四唑[1，5-a]嘧啶)指定为HBF-0259(图2A)，用于下面的研究。

HBF-0259是HBsAg分泌的选择性抑制剂。应用ELASA筛选，测定HBF-0259的EC₅₀和CC₅₀。在HepG2.2.15细胞系中，虽然没有检测到毒性，但是ELASA初筛中HBF-0259的EC₅₀有一些变化。该变化(还注意到也存在其他化合物中)表现为细胞的性能，并且可能与由HepG2.2.15细胞系产生的高度变化水平的HBV抗原分泌相关联。可选择的是，HepDE19细胞系抑制表面抗原分泌的EC₅₀的分布范围为1.1-1.6μM。然而CC₅₀>50μM，产生一个至少31(图2B)的特定指数。

使用专用于preS2区域的抗体，应用西方印迹(Western blotting)分析处理细胞的上清和整个裂解物，检测该化合物对分泌和胞内L和M型HBV抗原处理过程的影响。以浓度为8.0、4.0和2.0μM的HBF-0259的处理HepG2.2.15细胞，与只用化合物溶剂(DMSO)处理的对照相比，发现上清中的L和M型的数量明显减少。在4.0μM样品中，该杂交的薄层扫描分析表明，L和M型分泌的总抑制率为58％，该检测中得到的EC₅₀为3.0-4.0μM。在同一样品中，α-1-酸糖蛋白(AGP)和α1-抗胰蛋白酶的量没有表现因加化合物而受影响(图3A)。

胞内L和M的量和它们各自的糖蛋白形式没有表现减少，并且实际上在有化合物，尤其是非糖基化形式的M(p30，图3A)存在时，产生轻微的聚集。对整个S、M和L分泌的影响，也使用一抗S(“一”表面抗原)抗体应用打点(dotblot)EIA检测，并且表明取自HBF-0259处理的HepG2.2.15细胞(图3B)的上清培养物的整个信号没有表现明显减少，因而应用ELISA初筛和L和M特异Western blotting的观察结果形一致。有意思的是，与DTT处理的HepG2.2.15(图3)相比，HBF-0259对HBeAg分泌物没有影响。由于HBeAg分泌物不同于HBV亚病毒粒子，并且胞外的两种非病毒蛋白的水平也不受影响，因此HBF-0259表现为只是包含S，M，和L的粒子分泌的特异性靶标。

为了检测HBF-0259长期处理亚病毒粒子的效应，高密度接种HepG2.2.15细胞，并且加溶于0.5％ DMSO的4.0μM化合物，或只加0.5％ DMSO培养24天。每三天收集一次有培养基的样品，并且含有化合物/DMSO的培养基也以这个时间间隔更新。应用Westernblotting分析样品的L，M和AGP。不加化合物时，稳定18天后，再培养六天，L和M的水平明显减少。加化合物时，L和M分泌水平在早期的三天衰减，9天之后检测不到，同时AGP的分泌保持相对不受影响(图4D)。这些观察表明，HBF-0259可能对部分细胞存在潜在趋势，使延长期的HBV亚病毒粒子的分泌衰减，并且HBV分泌路径没有被常规存在的抑制剂抑制。

HBF-0259减少HBV病毒粒子的分泌，不影响病毒的复制。为了确定化合物对胞内病毒复制的影响，不加四环素，使HepDE19细胞能够的HBV前体基因组和mRNA合成，反转录装配病毒壳和DNA合成。7天之后，以2.0，4.0和8.0μM添加HBF-0259或独立加DMSO，在不加tet时，再培养6天，每三天换一次新鲜的培养基和化合物。然后收集细胞单克隆和培养物上清。应用Southern blot检测分析胞内病毒的复制中间体(re和ss DNA)。非变性琼脂糖凝聚电泳分离培养物上清，并且用用于病毒DNA的杂交DNA探针标记。另外，上清也用打点(dot blotting)分析和DNA杂交。

我们没有观察到加HBF-0259(图4，顶部条带)时，胞内DNA水平的变化。，表明该化合物对病毒基因组的复制步骤没有影响，其在被称为HBV复制后转录的HepG2衍生稳定转染系统中复制。HepG2.2.15细胞中病毒基因组复制的相同分析，产生的结果相同(没有表明)。然而，我们无法排除这种可能，即化合物可能影响此处不进行复制的复制步骤，尤其是病毒与受体的结合，进入和脱壳。然而，转录前体步骤的抑制不能影响HepG2.2.15或HepDE19系统中的包膜分泌，因此会与此处报道的观察无关。

与此相反，通过粒子检测和DNA打点(dot blot)表明(图4，分别为中间和底部条带)，HBF-0259处理对这些细胞中分泌的病毒相关联DNA的水平有明显的抑制效应。该观测与对包括病毒粒子的包膜蛋白的抑制一致。也观察到“裸露的”HBV病毒壳有轻微变化。虽然常见，此处核酸壳所执行的细胞机制不清楚，但是这种效应完全可能验证完全病毒水平的抑制观察。因而，由HBF-0259标记的胞内HBV生命周期阶段表现为发生下游壳装配和反转录步骤的包膜粒子的分泌。

HBF-0259抑制瞬间表达的HBV包膜蛋白的分泌。为了证实在HepG2.2.15和HepDE19稳定表达细胞系统中我们所观察到的，我们采用HepG2亲本细胞系和构建的pNI2.SHA和pTRE-MSHA质粒，其分别编码C末端带有HA抗原标记的S和M蛋白，进行瞬时转染。由于L型外源表达固有的细胞毒性，该蛋白在本试验中没有被采用。转染之后，立即激活化合物，持续处理48小时，收集培养基和细胞单克隆，使用HA(用于S和M)和pre-S2(用于M)抗体进行Westernblotting分析。如图5A所示，加4.0μM HBF-0259进行孵育，使得分泌型S-HA的水平明显减少；胞内S-HA的水平没有减少，并且非糖基化形式的S-HA(p24)产生聚集。另外，用DMSO处理的样品，胞内S-HA信号有“拖尾”；用HBF-0259处理的样品，胞内S-HA信号明显减少(位于，图5A)；可能所观察到的是S的低聚物，这种情况甚至在温和减少凝胶的情况下也能观察到(例如，加DTT)。S的低聚物在内质网运输的过程中产生，表明HBF-0259可能抑制HBsAg通过分泌通路的运输。

通过HA和pre-S2抗体检测观察M-HA分泌的减少，虽然两种检测情况的抑制水平不同(图5B)。与S相同，胞内M分泌表明，HBF-0259使得非糖基化M-HA聚集，也使得单糖基形式M-HA聚集，表明HBF-0259可能影响所有的M-HA糖基化形式。总之，图4中的数据表明，HBF-0259对HBV亚病毒粒子的影响不依赖非包膜病毒蛋白和病毒的复制，并且该化合物可能在糖基前体和早期糖基化过程中通过分泌通路抑制HBsAg的运输。

HBF-0259的可选择性抗病毒谱。由于HBF-0259的完整作用机制还不知道，因此该化合物可能对延展的其他病毒有一通用活性。为了证实HBF-0259作为通用抗病化合物的可能，我们检测其对I型单纯疱疹病毒(HSV1，属于疱疹病毒科)，菌株K057，和牛病毒性腹泻病毒(BVDV，属于黄病毒科)，菌株NADL的细胞间扩散的效应。HSV-1用于感染vero细胞系，BVDV用于MDBK细胞系。对于两种病毒，细胞以1.0、0.1、0.01和0.001的不同感染复数(MOI)，或只加5μMHBF-0259或DMSO被模拟感染或感染。使用显微镜观测不同MOI下的细胞病变(CPE)现象，并且每天收集只加DMSO控制的观察的所有CPE的样品。收集BVDV接种感染四天后或HSV-1接种感染9天后的模拟感染或其所有的CPE没有观测的样品。收集时，通过MTT检测作为DMSO独立处理的样品模拟感染活力的百分数，确定细胞的活力。如图6中的描述，A和B组，HBF-0259无法保护其免除在MOI为1.0或0.1时其他病毒的所有的CPE。然而，BVDV的MOI为0.01或0.001的感染细胞中，加HBF-0259相比独立加DMSO(图6A)，与BVDV诱导CPE水平的轻微减少相一致。这种效应在由HSV-1感染的样品(图6C)中观测不到。

对于两种病毒系统，HBF-0259对噬菌体大斑小的影响，和因此产生的对细胞间扩散的影响，通过接种大约100噬菌体单位/35mm孔的生长至75％结合度的MDBK和vero细胞单克隆时测定。细胞大致覆一层包含甲基纤维素，并且还含8.0、4.0、或2.0μM HBF-0259或只加DMSO的培养基。通过可见滴度和显微镜检测噬菌体的生长，并且可跟踪可见噬菌斑大小增大的位点。去掉覆膜以后，固定细胞，并用结晶紫染色。与只加DMSO(图6B)的情况相比，加三种HBF-0259的情况似乎只能引起BVDV噬菌斑非常轻微的减小。HSV1噬菌斑的大小没有受化合物的影响(图6D)；由于野生型HSV1的最初扩展是由胞外病毒引起的，而不是合胞体引起的，这些结果表明，HBF-0259不具备抑制HSV1细胞间扩展效应的能力。然而，通过在非常低的MOI下(尽管不是在10％或者更多地细胞被感染的MOI)，保护单克隆免于CPE，表明该化合物可能能够微弱地抑制BVDV细胞间扩展效应的能力。

HBF-0259的结构类似物的抑制活性。我们获得了10个HBF-0259的类似物，其中所有的都在四氢-四唑-嘧啶环的碳5或碳7上有不同的芳香环取代基。简单而言，我们指R₁为碳5的取代基，R₂为碳7的取代基。如图7表明，10个取代基中的6个的EC_50S低于50μM，化合物中的4个没有检测到抑制性，或者EC_50S高于50μM。活性类似物的细部毒性也相对低；化合物的CC₅₀不低于37.5μM(例如，化合物4567)，虽然计算的化合物2160的SI值非常低，但是4564有相对高的EC_50S。讨论

HBF-0259是HBV粒子分泌的特异抑制剂。为了努力鉴定会抑制来自HBV复制HepG2.2.15细胞系的外在胞外病毒抗原的新型化合物，我们组利用详细组装的小分子库进行了高通量筛选。鉴定试验着重于鉴定HBV生命周期重要步骤的抑制剂，并且尽量减少鉴定影响其他步骤的化合物。例如，由于包膜蛋白最初表达于这些细胞的完整HBV转基因中，而不是以cccDNA膜板构建，因此我们的筛选试验不会鉴定病毒基因组复制的抑制剂，也不会是HBV DNA细胞转运和cccDNA构建的抑制剂。同样地，由于亚病毒粒子(与Dane粒子相比，其包含最大的胞外HBV表面抗原)是独立装配的壳蛋白，影响核蛋白二聚体和通用壳蛋白装配的化合物也不会被鉴定。通过二次筛选，我们去除了有明显细胞毒性的化合物，并且验证了多数初筛靶标的活性。最后，进一步对选中化合物检测之后，我们判定其在HBV特异方式中所起的作用。其中，HBF-0259是第一个被报道的。在组织培养物中，它有一个低微摩尔范围内的EC₅₀和高于50μM的CC₅₀，构成一个足够大的“视窗”，表明该化合物的抑制活性不是直接来自对胞内代谢的抑制。它的活性持续存在于延长孵育中，其表现为作用于所有的三个HBV表面抗原，和作用于也为感染粒子的亚病毒粒子。与最近报道的鞣花酸的活性直接相反，它不抑制HBeAg的分泌，展现对HBV表面抗原的影响。最初观察到的其对胞内非糖基化和糖基化形式的HBsAg的影响，表明它阻断了该通路早期步骤的分泌。它对HBVDNA合成没有影响，因而不会影响壳装配或反转录。它对两个不相关病毒进行细胞间扩展的能力的影响很微弱或没有影响。最后，限制性SAR研究表明BF-0259的活性可能延及该类分子的其他一些成员，表明探索其化学活性可能会产生更优化的活性。总之，HBF-0259是HBV生命周期和慢性疾病进展的关键步骤的新颖抑制剂。

HBF-0259是能够抗HBV活性的新型化学类。除却干扰素，所有FDA批准的用于治疗乙型肝炎的抗病毒药物为核苷和核苷为基础的聚合酶抑制剂。进一步地，诸如Bay41-4109的抗HBV试验化合物和类似物杂环二氢嘧啶(HAPs)、bis-ANS、和苯丙烯酞胺衍生物AT-61和AT-130，在功能或结构上与HBF-0259无关。鞣花酸，其由完整的植物叶下珠抽提物衍生的重要的化合物，表现为对体内和离体中HBeAg分泌的特异性抑制，不影响表面抗原分泌，或HBV基因自复制。我们组已经报道了对HBV分泌物分泌和其他的脱氧野尻霉素(DNJ)的免疫糖衍生物的糖蛋白和相关糖脂，其最初通过α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制，也通过固有的干扰素效应的激活起作用。为了收集核定和试验的抗病毒，我们筛选代表HBF-0259化合物的四氢嘧啶类，其先前没有报道过具有抗病毒活性。

新型化学类HBV抑制剂的有效性可分为诊疗作用，也可能利用它揭示HBV粒子装配和分泌的新型特性。抗原分泌抑制剂可证明在改善慢性乙型肝炎患者的抗原血中起作用。那么该临床终点使得减少免疫诊断(例如，疫苗接种)，或甚至排出肝中感染病毒种群是可能的。WHV感染型中的抗原血的减少，将产生抗HBV胞内免疫功能和抗体效价的增加。与干扰素和/或聚合酶抑制剂有关的分泌抑制剂和免疫诊断，可能作为抗鸡尾HBV起作用，会有效地减少胞内病毒复制，和感染和亚病毒粒子两种形式中环状抗原的水平。

作用机制的研究。可以证明HBF-0259是在进一步解释HBV的装配和分泌中的有用工具。与α-葡萄糖苷酶不同，HBF-0259表现为不影响HBV包膜蛋白的后-糖基化过程。另外，我们还观测到非糖基化或早期糖基化形式的包膜蛋白的明显的胞内聚集，而由免疫糖影响的分泌抑制能够使M蛋白体处理过程加快。这直接表明HBF-0259的功能是与DNJ和其衍生物不同的作用机制，并且对其感兴趣调查的独特原因。

该识别化合物特征的原则是其对HBV抗原分泌影响的明显程度的特异性。它在活性浓度时有轻微的细胞毒性；它不能抑制至少两种丰富的胞内糖蛋白的分泌；它不影响两个也编码糖蛋白的不相关包膜病毒家族的原型；并且，惊人的是，它不抑制HBeAg的分泌，其为一非结构病毒或亚病毒粒子成分的HBV糖蛋白。虽然HBF-0259的完整作用机制还未阐明，这些观测表明它通过直接作用于HBV病毒和它们的亚病毒粒子，其包含抗原，或它们的分泌粒子唯一需要的胞内过程或因子而影响发生。

HBF-0259的优化。化学易处理性是我们决定将会对哪一种在筛选中鉴定的化合物进一步检测的标准。HBF-0259的四氢-四唑-嘧啶取代结构易于进行所有的结构优化修饰。最初我们为了这样做，在初步筛选检测中检测了许多四氢嘧啶环被不同取代基取代的类似物；一些化合物具有活性，表明HBF-0259结构确实是HBV抗原分泌抑制的基础。还有，该系列物的毒性没有明显增加，表明在任何负面效应显露之前，还有很大的修饰空间。

HBF-0259的显著特征是位于四氢嘧啶环的碳5和碳7的两个手性中心。由于它可能是唯一的一个具有生物活性的立体异构体，因此假定每个异构体部分相等，该化合物的EC₅₀可能低于我们测定的HBF-0259或任何一个检测的类似物的四倍。这一点可通过两种方法得出：1)通过手性色谱法分离混合物，随后应用初步ELISA筛选检测分离的立体异构体，和2)合成由在四氢嘧啶环中插入双键以减少或去除手性修饰的IHVR类似物，再检测。通过这些方法，我们能够测定活性立体异构体的共同特性，并且重要手性的生物活性。

前述优选的实施例的例子和描述的是为了公开，而不是为了限制本发明于所揭示的具体形式。由于会容易被理解，以上阐述的不同变化和组合的特征能够在不偏离本发明所表明的实施方式下被利用。这些变化不认为是脱离了本发明的思想和主旨，并且所有这些变化包括在以下的权利要求限定的范围内。