一种过逸型气虚证候动物模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种建立过逸型气虚证候动物模型的方法，其包括：将大鼠置于代谢笼中，饲以高脂饲料，自由饮水，经过8－10周造模时间的培养即得，本发明解决了目前没有过逸型气虚证候动物模型的不足，为中医药评价提供了一种新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及中医药评价领域，具体涉及一种建立气虚证候动物模型的方法。

背景技术

证候研究一直是中医药评价研究的热点领域，其规范化与标准化是传统中医药迈向现代化的必由之路，而自上世纪60年代中医证候动物模型的引入则为此进程架起了一座桥梁。

气虚证是中医临床常见基本证候，近年来中医基础实验发展了多种不同的气虚动物模型的造模方法，包括限日摄食量法、单纯泻下法、疲劳法、烟熏法、化疗药物、X线照射、耗气破气、苦寒泻下加耗气破气降气、手术法、失血法等等，实验动物多采用大鼠或小鼠。综观这些方法，总体上仍以疲劳法为主，正如《素问·举痛论》云：“劳则气耗”“劳则喘急汗出，内外皆越，故气耗也”，劳力过度则伤气，此法符合中医理论，在疲劳的基础上加用限食；《灵柩·玉版篇》云：“人之所以受气者，谷也”；《灵柩·无味篇》云：“谷不入半日则气衰，一日则气少矣”；泻下(以大黄、芒硝、番泻叶等泻下药物为主)的方法使气之生成更加不足，气虚证候更加明显。结合脏腑辩证，脾气虚症的造模方法最多，有疲劳加饮食失节或泻下法，偏食苦味或酸味，耗气破气或苦寒泻下加耗气破气等；心气虚动物模型的制作常在疲劳、控食等的基础上使用心得安或垂体后叶素这两种药物；肺气虚的造模方法比较单纯，主要采用一氧化硫、香烟、锯末等进行烟熏以伤肺脏，耗损肺气；肾气虚动物模型的研究相对较少。

在现有的气虚动物的造模方法中存在着许多问题，如(1)造模方法大多复杂；利用多因素造模较多，在实验过程中不利于操作和推广；(2)有些造模因素与临床不贴近，如偏食苦味造模、食用过量醋造模等，不是临床上常见的导致气虚的原因；(3)一些方法所造的模型是否属于气虚证还存在着争论，如泻下法所用药物大黄、番泻叶等苦性寒，不能排除造成脾阳虚的可能；(4)有一些方法尽管类似，但所用强度和时间都不同，各有不同的标准，不够统一；(5)模型大多偏重一些脏腑的气虚，单纯气虚证较少。

如上所述，疲劳法是制备气虚证模型的主要方法，所谓“劳则气耗”，与之相反，过逸是否也可以造成气虚证的产生呢？过逸，即过度安逸，包括体力过逸和脑力过逸等。清代医家陆九芝说：逸之为病，正不少也，逸乃逸豫，安逸之所生病，与劳相反”；《素问·宣明五气篇》云：“久卧伤气”；《医学入门》也强调久卧久坐“尤伤人也”；张介宾云：“久卧则阳气不申，故伤气；久坐则血脉滞于四肢，故伤肉”。人体每天需要适当的活动，气血才能流畅，阳气才得以振奋，若较长时间少动安闲，或者卧床过久或者长期用脑过少等，可使人体脏腑经络及精气血神的失调而导致病理变化。

过逸致病的特点主要表现在三个方面：一是安逸少动，气机不畅。如果长期运动减少，则人体气机失于畅达，可以导致脾胃等脏腑的功能活动呆滞不振，出现食少、胸闷、腹胀、肢闲、肌肉软弱、或发胖臃肿等(脾气虚的表现)；二是阳气不振，正气虚弱。过度安逸或长期卧床，阳气失于振奋，以致脏腑组织功能减退，体质虚弱，正气不足，抵抗力下降等。故过逸致病，常见动则心悸，气喘出汗等(心气虚的表现)，或抗邪无力，易感外邪致病(肺气虚的表现)；三是长期用脑过少，加之阳气不振，可致神气衰弱，常见精神萎靡、健忘、反应迟钝等(肾气虚的表现)。可见过逸可致机体整体的生理功能减退，导致气的生成不足或运行不畅，从而导致气虚证的发生，且并不偏重于某一脏腑。

临床上部分人群，尤其是肥胖群体，由于生活习惯过于安逸，饮食嗜食肥甘厚味，且日常缺乏劳动及体育锻炼，往往可致气虚证候的产生。

但是，目前却没有关于过逸致气虚证候动物模型的相关文献的报道，因此，对相应药物的评价也缺少规范、标准、科学的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种新的建立过逸型气虚证候动物模型的方法。

本发明中的过逸型气虚证候的“过逸”主要是指高脂饮食复合久卧引起的气虚证候。

本发明建立过逸型气虚证候动物模型的方法为：将大鼠置于代谢笼中，饲以高脂饲料，自由饮水，经过8-10周造模时间的培养即得。

本发明中使用的高脂饲料可以在本发明的启示下采用本领域常规技术进行配制，以使大鼠产生过逸型气虚证候为目的。

本发明中高脂饲料优选包含以下成分，以100份基础饲料计：全脂奶粉10-15份、猪油3-5份、蛋黄40-50份、黄豆10-15份、鱼肝油0.2-0.5份、胆酸钠0.5份；优选以100份基础饲料计：全脂奶粉15份、猪油5份、蛋黄50份、黄豆15份、鱼肝油0.35份、胆酸钠0.5份。

为了更好的实现本发明，本发明中大鼠使用的代谢笼为单笼，笼内空间以保持大鼠基本安静、且能够转身移动为标准，笼内空间随大鼠的生长状况可进行调整。

本发明过逸型气虚证候动物模型中，造模时间优选为10周；大鼠优选为清洁级Wistar雄性大鼠，体重在160-180g之间。

为更好的实现本发明目的，本发明选用以下方法对过逸型气虚大鼠模型进行评价：经过8-10周造模时间培养的大鼠，按观察指标观察大鼠的生物学表征，其生物学表征半定量评分应在4分以上。

中医证候模型是利用动物的某些生物体征来模拟人体证候特征的一类生物表征模型，在证候自身的生物学基础病理生理依据还没有完全被揭示的今天，不能一味追寻生物化学、病理或病理生理指标为证候动物模型成立的依据。

症状在中医证候的临床诊断中起着最重要的作用，因此，中医证候动物模型的评价标准应以症状为主，以动物体表特征如舌象、唇象、爪象、耳轮、尾尖、眼球、毛皮以及动物行为等表现为依据。

本发明过逸型气虚证候动物模型的评价标准中，优选了精神状况、皮肤及毛发、耳尾颜色和粪便四类生物学表征作为观察指标，并制定了相应的半定量评分标准，其中，

按精神状况不同分为：活泼好动为0分，反应稍有迟钝、自主活动减少为1分，倦怠懒动、精神萎顿、四肢蜷缩、行动迟缓为2分，精神萎靡不振、攻击性、对抗性行为消失为3分；

按皮肤及毛发不同分为：皮肤与脂肪连接紧密、柔韧有弹性、毛发光亮柔顺为0分，皮肤略松弛、松软、张力减少、毛发枯黄无光泽为1分，皮肤松弛、少许脂肪、易抓取、毛发干枯或结穗打卷、无光泽为2分，皮肤松弛、皮下无脂肪、抓之触骨、全身毛发枯槁、稀疏脱落为3分；

按耳尾颜色不同分为：红润光泽为0分，淡红少泽为1分，淡白少泽为2分，苍白或透青色为3分；

按粪便不同分为：粪便干、成形为0分，粪便粘软有形为1分，粪便不成形、但不稀溏为2分，粪便稀溏、绿褐粘腻恶臭为3分。

为更好的实现本发明目的，本发明更进一步优选选用以下方法对过逸型气虚大鼠模型进行评价：按观察指标观察大鼠的生物学表征之后，再采用力竭游泳的方法进行评价，其中力竭游泳的具体方法包括：使大鼠在游泳缸中强迫负重游泳，游泳至力竭为止时，统计游泳时间，其游泳时间与相同条件下正常大鼠游泳时间相比应缩短≥1/3。

乏力为气虚证的代表症状之一，而力竭游泳由于能使动物全身的肌肉参与运动，比爬竿实验或攀网实验更能体现实验动物的耐力情况，因此本发明同时还采用了大鼠力竭游泳实验的方法对过逸型气虚模型进行验证。

本发明大鼠游泳优选在25-27℃水温的专用游泳缸中，强迫负重游泳，采用两次游泳法，前后相差10分钟，游泳至力竭为止；其中游泳至力竭的标准为：游泳范围逐渐缩小，动作明显失调、慌张、鼻部在水面上下浮动，头部没入水面下3秒不能上浮。

大鼠使用的游泳缸优选为60cm×40cm×100cm的专用泳缸，但并不限于上述规格的游泳缸，还可以是其它常用的泳缸；

其中在负重游泳时，每只大鼠的负重优选为按每只大鼠自身体重的5％计算。

本发明解决了目前没有过逸型气虚证候动物模型的不足，为规范、标准、科学的评价中医药提供了一种新方法，具有造模方法简单、易于操作和推广，贴近临床的特点。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行进一步的阐述，但本发明并不受限于此。

实施例

1、模型制备材料及方法

1.1、动物：清洁级的Wistar雄性大鼠，体重160-180g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2007—0001。

1.2、药物：人参冻干粉，由石家庄以岭药业股份有限公司提供，为淡黄色冻干剂，使用前取102.86mg干粉加入100ml 0.5％CMC-Na中，相当于0.12g生药/ml，4℃保存备用。

1.3、高脂饮料的配制：每100g基础饲料中加入全脂奶粉15g，猪油5g，蛋黄50g，黄豆15g，鱼肝油10滴(约0.35g)，胆酸钠0.5g；

1.4、仪器：代谢笼，大鼠专用泳缸；

1.5、实验分组及其方法，清洁级Wistar雄性大鼠45只，随机分为3组：空白对照组、气虚模型组、人参干预组，每组15只；空白对照组大鼠分别置于代谢笼中(单笼)，饲以普通饲料，自由饮水；气虚模型组大鼠分别置于经改造的代谢笼中(单笼)，笼内的空间以保持其基本安静、且能够转身移动为标准(空间据大鼠的生长状况可随时调整)，饲以高脂肪饲料，自由饮水；人参干预组大鼠于实验开始按1ml/100g给予人参冻干粉CMC-Na混悬溶液灌胃(1.2g生药/kg/d)，1次/天，其它处理同气虚模型组。实验共计10周。

1.6、观察指标及检测方法

1.6.1、大鼠生物学表征观察：制定半定量评分表(见表1)于实验结束后对大鼠生物学表征进行观察。

表1、实验大鼠生物学表征半定量评分观察表

1.6.2、力竭游泳实验：实验结束后，每只大鼠在25-27℃水温的专用游泳缸(60cm×40cm×100cm)中，被强迫负重(每只大鼠的负重按自身体重的5％计算)游泳，采用两次游泳法，前后相差10分钟，游泳至力竭为止，以最大限度耗竭动物体力(力竭标准：游泳范围逐渐缩小，动作明显失调、慌张、鼻部在水面上下浮动，头部没入水面下3秒不能上浮为力竭标准)。

1.7、统计分析

应用SPSS12.0软件统计，采用单因素方差分析法，组间两两比较用LSD法检验，所有数据均以均数±标准差(x±s)的形式表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1、各组大鼠生物学表征评分：结果见表2。

表2、实验各组大鼠生物学表征观察评分结果(x±s)

 

组别N(只)分值空白对照组151.00±0.50气虚模型组154.25±1.21*人参口服组152.08±0.90#

注：与空白对照组比较，*P<0.01；

与气虚模型组比较，#P<0.01；

实验结果显示，对照组大鼠活泼好动，反应灵敏，气虚模型组大鼠则表现倦怠懒动，精神萎顿、四肢蜷缩，行动迟缓，甚则迷眼、缩肩拱背；皮肤松弛，背部毛色无光泽；尾、鼻颜色淡白少润；大便稀软但有形，生物学表征评分与空白组比较显著升高(P<0.01)，人参口服组大鼠反应稍有迟钝，自主活动少，皮肤略松弛，松软，尾、鼻颜色淡红少润；大便干燥、有形、生物学表征评分与气虚模型组比较显著降低(P<0.01)。

2.2、各组大鼠力竭游泳时间，结果见表3

表3、实验各组大鼠力竭游泳时间比较结果(x±s)

 

组别N(只)力竭游泳时间(s)空白对照组15701.3±75.6气虚模型组15270.4±41.7*人参口服组15357.9±22.6#

注：与空白对照组比较，*P<0.01；

与气虚模型组比较，#P<0.01；

实验结果显示，与空白对照组比较，气虚模型组大鼠力竭游泳时间明显缩短，统计有显著性差异(P<0.01)；与气虚模型组比较，人参口服组大鼠力竭游泳时间明显延长，统计有显著性差异(P<0.01)。

由上述试验结果可以看出，气虚模型组大鼠评分显著升高，其表征改变基本可以体现临床神疲、懒言、气短、乏力的气虚证候表现；同时，气虚模型大鼠力竭游泳时间显著缩短，也表明其整体运动耐力降低，乏力症状明显。

其次、治疗作用的反证也是衡量模型是否成功的一个重要标志。人参是中医典型的补气药之一，本发明将人参用于气虚证候模型的治疗，结果显示其可显著改善模型大鼠的生物学表征，延长大鼠的力竭游泳时间，从而反正了气虚证候模型的成功建立。