蝎源免疫调节多肽在治疗类风湿性关节炎的药物中的应用

摘要

本发明公开了一种蝎源活性多肽BmKTX在制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。通过基因工程生产重组蝎源活性多肽BmKTX。该多肽药物具有如下特点：(1)特异性强。蝎源活性多肽BmKTX作用药物靶标钾通道Kv1.3的IC50值为102pM，是目前国际上已发现的活性强的多肽药物；(2)药物效果显著。动物实验表明，重组BmKTX多肽可以有效治疗大鼠的类风湿性关节炎。(3)毒副作用小。动物实验中，蝎源活性多肽BmKTX未对实验动物造成明显的毒性和副作用。本发明方法简单易行，操作方便。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种蝎源活性多肽BmKTX在治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。

背景技术

自身免疫性疾病(autoimmune disease)机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，即人体免疫系统攻击自身的组织。全球约有5-8％的人口受到约40多种自身免疫性疾病的威胁。这些疾病涉及全身一种或多种组织和器官，严重影响人体健康及生命。针对自身免疫性疾病，目前无有效疗法，且病情反复发作。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，一是利用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是使用免疫抑制药物，抑制免疫系统的作用。不过，这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。在自身免疫性疾病中，以T细胞介导为主的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、白塞病、自身免疫性甲状腺和病I型糖尿病等。这类疾病在影响着数百万人的生命，针对这种人类难治疾病的发病机理，研发新型免疫抑制药物已成为全球激烈竞争的领域之一。

近年来，与疾病相关的T细胞上钾通道Kv1.3被鉴定为治疗自身免疫病的新靶标[J.Clin.Invest.，2003，111：1703；Trends in Pharmacological Sciences，2004，25：280；Curr Pharm Des.2006，12(18)：2199]，为抢夺未来巨大的药物市场，现在国际上大制药公司和大学科研机构正掀起一轮以钾通道Kv1.3为靶标的新药研发热潮。有机小分子药物因价格低廉而成为研发的首选。到目前为止，Merck公司、澳大利亚Walter and Eliza Hall药物研究技术中心、美国加利福利亚大学等机构筛选、分离、合成、改造和鉴定了大量的有机小分子药物候选物[Trends inPharmacological Sciences，2004，25：280；Mol.Pharmacol.，2004，65：1364；Journal of Medicinal Chemistr，2006，49(4)：1433；Mol.Pharmacol.，2005，68：1254]。这些有机小分子药物作用同源通道Kv1.1，Kv1.2，Kv1.4，Kv1.5等活性比Kv.1.3通道低2-70倍。这种作用不同钾通道选择性差、潜在的毒副反应严重成为小分子药物研发的致病缺点，这主要是有机小分子候选药物作用Kv1.1-Kv1.7靶标区域的氨基酸残基序列几乎完全一致。与有机小分子靶点截然不同的是，多肽作用的靶区域呈现丰富的序列多样性，这就决定了多肽药物研发是必由之路。

在靶向通道Kv1.3小分子药物研发受阻情况下，国际上把眼光聚焦到钾通道Kv1.3特异性动物毒素多肽抑制剂。中国传统医药常用“以毒攻毒”的策略治疗人类的疑难杂症，有毒动物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首选。现代研究已表明这些有毒动物的毒液中富含动物毒肽多肽，这些多肽特异性作用细胞膜上离子通道。当今，靶特异性动物多肽毒肽已成为全球化研发/治疗相关疾病重要药物的资源(Nat.Rev.Drug.Discov.20032：63)。当钾通道Kv1.3逐步被认识到是治疗自身免疫性疾病有效的药物靶标过程中，以动物毒肽多肽为基础的自身免疫调节新药的筛选就成为了一个重要的研究方向。在各种有毒动物的天然毒素中，大部分高亲和性的Kv1.3通道的抑制剂都来自于蝎源活性腺分泌的蝎源活性肽(Trends Pharmacol.Sci.2004 25：280，Curr.Pharm.Des.2006 12：2199)，这类多肽分子内具有3-4对二硫键的结构共性。美国加利福利亚大学和霍普金斯医院正在联合研发以海葵毒素多肽ShK为分子骨架的先导药物[Curr Med Chem.2004，11：3041，Mol.Pharmacol.，2005，67(4)：1369]。ShK是从海葵中分离到的3对二硫键的35残基多肽，近两年正通过多肽化学合成方法修饰和合成20多种ShK多肽的类似物。在2006年，成功地发现了ShK类似物(ShK-L5)可较好地治疗风湿性关节炎和I型糖尿病(PNAS，2006，103：17414)，法国国家科学研究中心近年正在以通道Kv1.3特异性蝎源活性素多肽OSK1及AOSK1[Biochem.J.，2005，385：95；Mol.Pharmacol.，2006，69：354]为分子骨架，设计和化学合成了30多种3对二硫键38个残基类似多肽，加速新型免疫抑制多肽药物研发。

同有机小分子相比，靶向钾通道Kv1.3的先导多肽药物具有极高的特异性。如法国国家科学研究中心研发的AOSK1的IC50值为3pM，美国研发ShK多肽IC50值为16pM，而目前报道最好的有机小分子先导药物的IC50值为3nM。可见，先导多肽药物比有机小分子先导药物的特异性提高了1000倍。同时，先导多肽药物的选择性也得到了极大提高。因此，潜在新型免疫抑制多肽药物研发已成为治疗T细胞介导自身免疫性疾病的新方向。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种蝎源活性多肽BmKTX在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。

钾通道Kv1.3已被鉴定为预防和治疗T细胞介导自身免疫性疾病的靶标，在有机小分子药物研发严重受挫情况下，目前美国、法国、澳大利亚等国家正在研发免疫抑制多肽药物。本发明主要目的在于发现了一种蝎源活性多肽在作为制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

制备了基因工程蝎源活性多肽BmKTX。

将含有蝎源活性多肽BmKTX基因的表达质粒，转化大肠杆菌DE3(购自Novagen公司)。对转化的大肠杆菌IPTG(购自Merck公司)。诱导培养后收集菌体，超声波破碎细菌并通过GST亲和层析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再经脱盐浓缩、小肠激酶(EK)酶切、色谱分离，获得重组蝎源活性多肽BmKTX(Biochemistry 1997 36：13473)。

通过膜片钳技术鉴定蝎源活性多肽BmKTX对钾通道Kv1.3的药理学活性。

重组蝎源活性多肽BmKTX可特异性抑制钾通道Kv1.3电流，它IC50值为100pM，药理学数据表明蝎源活性多肽BmKTX可特异性作用自身免疫疾病的靶标钾通道Kv1.3。

蝎源活性多肽BmKTX在作为制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。

选取无特定病原体(SPF)级近交系SD大鼠(武汉大学实验动物中心)40只，♀，体重150±10g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2ml/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2周即出现类风湿性关节炎症状。然后将关节炎大鼠随机分为：模型鼠+生理盐水10只(模型阴性对照组)；模型鼠+氨甲喋呤10只(模型阳性对照组)；模型鼠+多肽药物10只；另设正常对照组10只(阴性对照组)。给药组按150μg·kg^-1剂量皮下注射，每天上午1次；模型阴性对照组和阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组按1.75mg·kg^-1剂量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天1次，连续给药。给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。按照大鼠一个关节红肿计1分，大鼠二个关节红肿计2分，大鼠各个关节红肿计3分，大鼠整个肢体严重关节炎计4分的标准打分。

实验结果表明，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组得分最高(40分/10只)；多肽药物BmKTX治疗后，大鼠的症状得到显著改善，得分为17分/10只，仅比模型阳性对照组(药物氨甲喋呤治疗)高5分。由此可见，蝎源活性多肽BmKTX能有效地治疗类风湿性关节炎。

可见，本发明具有如下特点：(1)特异性强。蝎源活性多肽BmKTX作用药物靶标钾通道Kv1.3的IC50值为102pM，是目前国际上已发现的活性强的多肽药物；(2)药物效果显著。动物实验表明，重组BmKTX多肽可以有效治疗类风湿性关节炎。(3)毒副作用小。动物实验中，蝎源活性多肽BmKTX未对实验动物造成明显的毒性和副作用。

附图说明

图1为重组蝎源活性多肽BmKTX及其融合表达蛋白GST-BmKTX的电泳检测分析示意图

1为rBmKTX未经IPTG诱导的全细胞蛋白；2为rBmKTX经IPTG诱导的全细胞蛋白；3为超滤脱盐浓缩后的融合蛋白GST-BmKTX；4为融合蛋白GST-BmKTX经EK酶切后的产物；5为经HPLC分离纯化得到的rBmKTX多肽。

图2为重组蝎源活性多肽BmKTX与GST蛋白质的色谱分离纯化示意图

图3为不同浓度BmKTX多肽对钾通道Kv1.3电流的抑制示意图

图4为重组多肽BmKTX抑制钾通道Kv1.3电流的浓度依赖性示意图

具体实施方式

实施例1：重组蝎源活性多肽BmKTX的表达和纯化

将含有蝎源活性多肽BmKTX基因的表达载体质粒pGEX-6p-1-BmKTX(由购自安玛西亚公司的表达载体pGEX-6p-1插入了编码BmKTX的基因序列构建而成，Biochem.J.2000 346：805-809)转化大肠杆菌DE3。对转化的大肠杆菌IPTG诱导培养后收集菌体，超声波破碎细菌并通过GST亲和层析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再经脱盐浓缩、小肠激酶(EK)酶切、色谱分离，获得重组蝎源活性多肽BmKTX。

通过高压液相色谱对BmKTX多肽进一步分离，去除GST蛋白质，得到色谱纯BmKTX多肽(图2)，对不同阶段得到的BmKTX多肽及其与GST融合蛋白进行了PAGE电泳检测(图1)。

实施例2：重组蝎源活性多肽BmKTX对钾通道Kv1.3靶标的药理学活性分析

将COS-7细胞在含10％的胎牛血清的DMEM培养基37℃、5％ CO2条件下培养，将钾通道Kv1.3重组质粒用Sofast^TM的转染试剂盒转染，转染细胞在0.8mg/ml Geneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA，Elektronik，Lambrecht，Germany)，对重组蝎源活性多肽BmKTX的药理学活性进行测定和分析。实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过Pulse软件(Elektronik，Lambrecht，Germany)来控制。仪器的滤波器设置为10kHz(Bessel)，电极阻抗为2-5MΩ，在电极与细胞膜之间形成高阻(1-5GΩ)封接后，进行快电容自动补偿(c-fast)，稍加负压破膜后，进行慢电容自动补偿(c-slow)，在-70mV的钳制电位下，从-60mV起给予10mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+50mV，观察电流情况，BmKTX多肽通过MPS-2(INBIO Inc，Wuhan，China)灌注系统实现精确灌注。将蝎源活性多肽BmKTX溶解后，经DAD给药系统(ALA)喷射给药，给药管尖端距记录细胞100μm左右。BmKTX对钾通道Kv1.3的药理学活性为102pM(图3和图4)。

实施例3：蝎源活性多肽BmKTX在作为制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。

选取无特定病原体(SPF)级近交系SD大鼠(武汉大学实验动物中心)40只，♀，体重150±10g，在清洁级环境条件下适应性饲养1周后，以0.2ml/只剂量的降植烷(pristane)在实验组大鼠尾根部皮内注射。饲养2周即出现类风湿性关节炎症状。然后将关节炎大鼠随机分为：模型鼠+生理盐水10只(模型阴性对照组)；模型鼠+氨甲喋呤10只(模型阳性对照组)；模型鼠+多肽药物10只；另设正常对照组10只(阴性对照组)。给药组按150μg·kg^-1剂量皮下注射，每天上午1次；模型阴性对照组和阴性对照组皮下注射等量生理盐水；模型阳性对照组按1.75mg·kg^-1剂量皮下注射氨甲喋呤(MTX)，每天1次，连续给药。给药21天后，观察大鼠患关节炎状况。按照大鼠一个关节红肿计1分，大鼠二个关节红肿计2分，大鼠各个关节红肿计3分，大鼠整个肢体严重关节炎计4分的标准打分。

 

模型阴性对照组阴性对照组模型阳性对照组BmKTX多肽得分40/10只0/10只12/10只17/10只

实验结果表明，在没有药物治疗情况下，模型阴性对照组得分最高(40分/10只)；多肽药物BmKTX治疗后，大鼠的症状得到显著改善，得分为17分/10只，仅比模型阳性对照组(药物氨甲喋呤治疗)高5分。由此可见，蝎源活性多肽BmKTX能有效地治疗类风湿性关节炎。