用于难治性肿瘤的治疗和/或难治性肿瘤对于抗癌药物的化学敏化的药物组合

摘要

本发明涉及这样的药物组合，其包含酪蛋白激酶2(CK2)磷酸化抑制剂(称为P15)和用于癌症化学疗法的细胞生长抑制剂，它们同时、分开或顺次施用。优选的细胞生长抑制剂为铂类、紫杉烷类、长春花生物碱、5－氟尿嘧啶、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素C、伊马替尼、易瑞沙和万珂(硼替佐米)。肽P15和抗癌化合物之间的协同作用意味着，所述组合中的每种细胞生长抑制剂的有效浓度比相应于单独的细胞生长抑制剂的有效浓度低10－100倍。因此，本发明中描述的组合具有比对于抗癌细胞生长抑制剂所报道的毒性低得多的毒性，这代表了其用于癌症治疗中的关键优点。此外，顺次施用的所述组合通过用肽P15进行预处理而导致难治性肿瘤对于所提及的细胞生长抑制剂的化学敏化。

说明书

技术领域

本发明涉及分子和实验肿瘤学领域，特别涉及描述旨在难治性肿 瘤的治疗和/或难治性肿瘤对于常规细胞生长抑制剂的化学敏化的药 物组合。

现有技术

在过去30年中，使用化学药物作为用于癌症治疗的细胞生长抑制 剂构成了作为用于某些实体和造血系统肿瘤的第一线治疗的选择之 一。用于癌症治疗的最常用的化学药物尤其是：铂类、紫杉烷类长 春花生物碱、多柔比星、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺(Jackman A.L.，Kaye S.，Workman P.(2004)The combination of cytotoxic and molecularly targeted therapies-can it be done？Drug Discovery Today 1：445-454)。然而，来自临床试验的结果显示出这类药物在 癌症治疗中的低的治疗指数(如由边际治疗益处(marginal therapeutic benefit)所证实的)，以及在患者中所观察到的高毒性 特性谱(Schrader C.等人M.(2005)Symptoms and signs o fan acute myocardial ischemia caused by chemotherapy with paclitaxel (taxol)in a patient with metastatic ovarian carcinoma.Eur J Med Res 10：498-501)。例如，许多作者同意，顺铂构成了用于肺 癌的第一线治疗，然而，通常观察到适度功效，并且临床症状和6周 存活增加具有很少的改善(Grillo R.，Oxman A.，Julian J.(1993) Chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer.J Clin Oncol 11：1866-1871；Bouquet P.J.，Chauvin F.等人(1993) Polychemotherapy in advanced non-small cell lung cancer：a meta-analysis.Lancet 342：19-21)。因此，目前用于达到最佳治 疗益处的策略集中于基于常规细胞生长抑制剂以及分子靶向疗法的药 物组合。目前的抗癌药物中的一些被分类为癌症靶向疗法，例如，尤 其是靶向在慢性髓性白血病的发展中起重要作用的Ab1激酶的格列卫 (伊马替尼)(Giles J.F.，Cortes J.E.，Kantarjian H.M.(2005) Targeting the Kinase Activity of the BCR-ABL Fusion Protein in Patients with Chronic Myeloid Leukemia.Current Mol Med 5： 615-623)，以及靶向与表皮生长因子(EGF)受体相关的酪氨酸激酶 的易瑞沙(Onn A.，Herbst R.S.(2005)Molecular targeted therapy for lung cancer.Lancet 366：1507-1508)，和通过靶向蛋白酶体 机制来阻断蛋白质降解的万珂(硼替佐米)(SpanoJ.P.等人(2005) Proteasome inhibition：a new approach for the treatment of malignancies.Bull Cancer 92：E61-66)。考虑到常规化学治疗剂 的非特异性机制集中于细胞有丝分裂的废除，新型癌症靶向治疗剂的 使用提供了实现产生抗肿瘤效应的协同作用的药物组合的极大前景。

另一方面，抗药性现象被认为是当使用化学治疗剂时，癌症疗法 失败的主要原因。尽管在肿瘤位置处的亚最佳药物浓度可以影响抗药 性，但其他因素如细胞起源也在许多肿瘤的化学抗性中起重要作用。 抗药性是依赖于多个独立机制的多因素现象，所述独立机制包括细胞 内解毒、细胞应答的变化、对应激的耐受性和凋亡信号传导途径中的 缺陷(Luqmani A.(2005)Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy.Med Princ.Pract 14：35-48)。糖蛋白-P和谷胱甘 肽S-转移酶是介导与癌症中的抗药性现象相关的细胞内解毒过程的 主要蛋白质(Saeki T.，Tsuruo T.，Sato W.，Nishikawsa K.(2005) Drug resistance in chemotherapy for breast cancer.Cancer Chemother Pharmacol 56：84-89)(Hara T.等人(2004)Gluthathione S-transferase P1 has protective effects on cell viability against camptothecin.Cancer Letters 203：199-207)。已报道 其他蛋白质如β-微管蛋白参与抗药性现象，并且其水平与对紫杉醇的 肿瘤抗性直接相关(Orr G.A.等人(2003)Mechanisms of Taxol resistance related to microtubules.Oncogene 22：7280-7295)。 此外，已报道顺铂抗性受不同蛋白质的过表达的影响，所述蛋白质如 T-丝束蛋白(Hisano T.等人(1996)Increased expression of T-plastin gene in cisplatin-resistant human cancer cells： identification by mRNA differential display.FEBS Letters 397： 101-107)、热休克蛋白(HSP70)和(HSP90)(Jaattela M.(1999) Escaping cell death：survival proteins in cancer.Exp Cell Res 248：30-43)和转录因子YB1(Fujita T.等人(2005)Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cancer pretreated with paclitaxel.Clin Cancer Res 11： 8837-8844)。此外，已报道糖酵解和丙酮酸合成途径的加剧对于在肿 瘤细胞中观察到的化学抗性现象起重要作用(Boros L.G.等人(2004) Use of metabolic pathway flux information in targeted cancer drug design.Drug Disc.Today 1：435-443)。

来自不同团体的报道已表明，存在这样的一系列蛋白质，其抑制 凋亡和增加肿瘤细胞的存活，从而促成肿瘤的化学抗性现象。实例之 一是核磷蛋白，其在促进细胞周期、抑制凋亡中起关键作用，并且已 被视为癌症中的不良预后标记(Ye K.(2005)Nucleophosmin/B23， a multifunctional protein that can regulate apoptosis.Cancer Biol Ther 4：918-923)。此外，CK2酶在细胞存活和肿瘤细胞针对 凋亡的抗性中起重要作用(Tawfic S.，Yu S.，Wang H.，Faust R.， Davis A.，Ahmed K.(2001)Proteinkinase CK2 signal in neoplasia. Histol.Histopathol.16：573-582)。先前的发现已揭示，CK2活 性在上皮实体瘤中相对于正常组织升高3-7倍(Tawfic S.，Yu S. 等人(2001)Protein kinase CK2 signal in neoplasia.Histol Histopatol.16：573-582；Faust R.A.，Gapany M.等人(1996) Elevated protein kinase CK2 activity in chromatin of head and neck tumors：association with malignant transformation.Cancer Letters 101：31-35)。此外，CK2活性是恶性转化的重要细胞事件， 并且它为一种肿瘤进展标记(Seldin D.C.，Leder P.(1995)Casein Kinase IIα transgene-induced murine lymphoma：relation to theileroiosis in cattle.Science 267：894-897)。CK2磷酸化代 表了保护肿瘤细胞免于凋亡的强信号这一事实导致这种酶被视为细胞 生理学中的抗凋亡介体(Ahmed K.，Gerber D.A.，Cochet C.(2002) Joining the cell survival squad：an emerging role for protein kinase CK2.Trends Cell Biol，12：226-229；Torres J.， Rodríguez J.等人(2003)Phosphorylation-regulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase-3：implications for the control of protein stability and PTEN-protein interactions.J Biol Chem，278：30652-60)。

总之，CK2磷酸化是代表了用于癌症治疗的潜在靶标的生物化学 事件，并且这个事件的特异性抑制剂可以产生对于癌症治疗而言具有 前景的药物候选物。

不同研究组已使用2种独立的方法开发出了抑制CK2磷酸化的不 同策略：a)对CK2α催化亚基的直接抑制，b)对CK2底物上的酸性 结构域的直接靶向(专利WO 03/054002和Perea S.E.等人(2004) Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylation by the protein kinase CK2.Cancer Res.64： 7127-7129)。通过使用这2种方法，作者已证实CK2抑制导致肿瘤细 胞的凋亡这一构思。这些发现加强了CK2作为合适靶以开发抗癌药物 的实验确认。

比较蛋白质组学研究以及分子生物学的发展已部分地使得能够了 解参与细胞恶性转化和肿瘤化学抗性的分子机制。因此，癌症治疗方 案应将其注意力集中于产生有效的药物组合，其极大地减少毒性并且 还降低化学抗性出现的可能性。

因此，当前癌症治疗的主要目标之一是通过减少由这类药物的有 效剂量和固有毒性来增加目前的细胞生长抑制剂的治疗指数。其他的 目前策略是克服针对常规细胞生长抑制剂的肿瘤化学抗性。

发明详述

本发明解决了上文提及的问题，因为它提供了包含下述2种成分 的药物组合：CK2磷酸化抑制剂(肽P15)和药学上可接受的细胞生长 抑制剂。

在本发明中，“药学上可接受的细胞生长抑制剂”指用于实体瘤 和造血系统起源的肿瘤的癌症化学疗法的所有细胞生长抑制性化学化 合物。优选的细胞生长抑制剂是与合适的载体相混合的铂类(例如， 卡铂和顺铂)、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)、长春花生物 碱(例如，长春新碱和长春碱)、5-氟尿嘧啶、多柔比星、环磷酰胺、 依托泊苷、丝裂霉素C、伊马替尼、易瑞沙和万珂(硼替佐米)

在本发明中，“CK2磷酸化的抑制剂”这一术语还包括阻断底物 或酶本身的任何化学或肽性化合物。根据情况，这种药物组合的活性 成分可以同时、分开或顺次施用。这种药物组合的施用可以通过全身、 局部或口服途径来进行。

本发明还涉及在哺乳动物尤其是人中难治性肿瘤的治疗和/或化 学敏化，包括施用上文提及的药物组合。此外，本发明还涉及这种药 物组合的成分在制备药物中的用途，所述药物用于治疗化学难治性肿 瘤并增强本发明中提及的细胞生长抑制剂的抗肿瘤效应。

实施例1(表1)显示了，本发明中描述的药物组合在体外产生协 同的抗肿瘤效应。因此，亚最佳剂量的肽P15以及顺铂、紫杉醇、多 柔比星、长春新碱、依托泊苷、丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶、伊马替尼 或易瑞沙的同时组合实现了本发明中提及的每种细胞生长抑制剂的有 效剂量10或100倍减少。有效剂量是达到50％抗肿瘤效应的剂量， 这在体外增殖测定法中也称为50％抑制浓度(IC50)。在本发明中， “亚最佳剂量”指低于IC50的那些剂量。

实施例2举例说明了通过使用这种药物组合增强了体内抗肿瘤效 应，所述药物组合包含肽P15以及顺铂(图1A)、环磷酰胺(图1B) 和丝裂霉素C(图1C)。该药物组合在相关动物模型(如在裸鼠中异 种移植的人肿瘤的动物模型)中导致完全的肿瘤消退。然而，与在安 慰剂组中观察到的效应相比较，作为单一疗法来使用这种药物组合的 成分仅产生在肿瘤生长方面的少量延迟。

这种药物组合的成分的顺次施用证实，P15处理在体外和体内克 服了肿瘤化学抗性。在本发明中，应当理解“克服肿瘤化学抗性或化 学敏化”指在用肽P15预处理后降低了对于产生50％抗肿瘤效应而言 所需的药物剂量的事件。实施例3(表2)举例说明了肽P15预处理在 肿瘤细胞的化学敏化中的效应，并且它导致有效药物剂量10-100倍 减少。类似地，表3中显示的数据表示，所述药物组合的顺次施用在 体外克服了肿瘤细胞的固有化学抗性。在本发明中，当IC50值达到高 于1000μM的浓度时，被视为具有体外化学抗性。

类似于体外结果，在体内用肽P15预处理克服了肿瘤的固有化学 抗性(实施例4)(图2A、2B、2C)。

肽P15成分(氨基酸序列：CWMSPRHLGTC)先前已被报道为CK2 抑制剂(Perea S.E.等人(2004)Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylation by the protein kinase CK2.Cancer Res.64：7127-7129)。然而，这种 肽出乎意料地在肿瘤细胞中调节一组蛋白质(表4)，所述蛋白质加 强并阐明所述药物组合中的成分的协同抗肿瘤效应以及通过用肽P15 预处理而产生的化学敏化。例如，由P15调节的蛋白质在肿瘤细胞增 殖的控制和凋亡中起重要作用，并且这些机制独立于由这种药物组合 的其余组分例如在本发明中优选的细胞生长抑制剂所采用的机制。

同样地，由成分P15调节的其他蛋白质是这样的蛋白质，其参与 对于本发明中优选的细胞生长抑制剂的肿瘤化学抗性的分子机制。这 些出乎意料的结果构成了当成分顺次施用时，由这种药物组合产生的 肿瘤化学敏化的分子基础。

本发明的特点是下述事实：与细胞生长抑制剂单独使用时的有效 剂量相比较，所述药物组合中的细胞生长抑制剂的有效浓度减少10- 100倍。这表示，在CK2抑制剂和本发明中优选的细胞生长抑制剂之 间发生协同相互作用。从实际观点来看，这种协同相互作用意味着， 基于这种药物组合的药物的毒性比仅基于细胞生长抑制剂的药物的毒 性低得多。

类似地，在顺次施用这种药物组合的成分后所引发的肿瘤的化学 敏化表现出巨大优点，因为它允许治疗在实体瘤和造血系统起源的肿 瘤中经常观察到的化学抗性。

附图简述

图1：在癌症动物模型中由所述药物组合增强了抗肿瘤效应：(A) 显示了顺铂+P15的协同作用的结果，(B)显示了环磷酰胺+P15的 协同作用的结果，(C)显示了丝裂霉素C+P15在体内的协同作用的 结果。

图2：在体内肽P15的化学敏化效应：(A)显示了对于顺铂的化 学敏化，(B)显示了对于紫杉醇的化学敏化，和(C)显示了对于多 柔比星的化学敏化。

实施例的详细说明

一般操作程序：

细胞培养：H-125细胞系来源于人非小细胞肺癌(NSCLC)，而SW948 细胞系来源于人结肠癌。将这2种细胞系维持在补充有10％胎牛血清 和庆大霉素(50μg/ml)的RPMI 1640培养基(Gibco)中。细胞培 养物的温育于37℃在5％ CO₂中进行。

细胞生存力测定法：为了这个目的，将20μl四唑鎓(MTS) (Promega)加入至每个包含所播种的细胞的96孔平板中。于37℃放 置2小时后，读取在492nm处的吸光度。最后，使用“CurveExpert” 软件由各自的剂量-反应曲线估计IC50值。

癌症动物模型：本发明中使用的动物模型基于在裸鼠(Nu/Nu， BalBC)中植入人肿瘤。简而言之，将5×10⁶个H-125细胞悬浮于磷 酸盐缓冲溶液(PBS)中并进行皮下接种。在肿瘤出现(大约30mm³) 后，使用本发明中描述的药物组合开始处理。为了评估所述药物组合 的抗肿瘤效应，测量肿瘤体积，其通过使用下式来进行计算：V＝宽 度²×长度/2。

细胞提取物中蛋白质谱的分析：H-125细胞用本发明中描述的药 物组合的肽P15成分处理40分钟或不进行此处理。随后，用PBS洗涤 细胞单层并从表面上刮下细胞。在用冷PBS再洗涤2次后，将细胞粒 状沉淀重悬浮于10mM tris-HCl pH7.5，0.25M蔗糖，1mM EGTA+蛋 白酶抑制剂混合物中，并且如先前所述获得核内蛋白级分(González L.J.等人(2003)Identification of nuclear proteins of small cell lung cancer cell line H82：An improved protocol for the analysis of silver stained proteins.Electrophoresis 24：237-252)。 为了分析由P15调节的蛋白质，各核内蛋白提取物备选地在二维凝胶 (pH4-7)中和/或通过与质谱法偶联的液相色谱(纳米HPLC)来进 行解析。

本发明通过下述实施例来进行说明：

实施例1：肽P15+常规细胞生长抑制剂的组合的协同效应。

在下述实验条件下评估了与不同细胞生长抑制剂相组合的肽P15 成分的抗肿瘤协同效应：将H-125细胞种植在96孔平板中，并将肽 P15以10和50μM的浓度加入至每个平板中。同时，在本发明中优选 的细胞生长抑制剂各自以1-2000nM的剂量加入，并且在相同条件下 继续温育72小时。最后，如本发明中上文所述，测定细胞生存力和 IC50值。表1中所示的结果证实，当同时与10或50μM的成分P15 相组合时，每种细胞生长抑制剂的IC50值减少10-100倍。这些结果 明确地证实，包含肽P15和在本发明中优选的细胞生长抑制剂作为成 分的药物组合加强了抗肿瘤效应。

表1.通过同时施用这种药物组合中的成分而获得的 抗肿瘤协同相互作用

 

变量单独的         细胞生长抑制剂细胞生长抑制剂+ P15(10μM)     细胞生长抑制剂+ P15(50μM)     顺铂720nM530nM40nM紫杉醇17nM8nM3nM5-氟尿嘧啶1200nM420nM60nM长春新碱856nM100nM8nM多柔比星423nM200nM76nM环磷酰胺2400nM1004nM85nM丝裂霉素C994nM93nM9nM伊马替尼600nM200nM58nM万珂2000nM1200nM700nM易瑞沙689nM174nM47nM

实施例2：在癌症动物模型中所述药物组合的抗肿瘤效应的加强。

为此，如本发明中上文所述，将5×10⁶个H-125肿瘤细胞植入6 -8周大的BalBc裸鼠中。肿瘤出现后，如下施用所述药物组合的成 分：在5天期间以0.5mg/kg/天经腹膜内施用在盐水溶液中的肽P15。 与此同时，以相同的频率以1mg/kg/天来腹膜内注射顺铂(图1A)、 环磷酰胺(图1B)或丝裂霉素C(图1C)。也将细胞生长抑制剂溶解 于盐水溶液中。如本发明中上文所述，记录肿瘤体积。图1A、1B和 1C中所示的结果表明，当同时施用所述成分时，所述药物组合加强抗 肿瘤效应，这表现为观察到完全的肿瘤消退。相反地，当作为单一疗 法施用所述成分时，相对于安慰剂组仅观察到不大的抗肿瘤效应。因 此，我们在相关的且预测性的临床前肿瘤模型中进一步证实了这种药 物组合中的成分之间的协同相互作用。

实施例3：在体外肽P15的化学敏化效应。

在这个测定法中，我们评估了当成分顺次施用时所述药物组合的 化学敏化作用。为此，将H-125细胞以2000个细胞/孔种植在96孔平 板中，并且在24小时后加入20μM的肽P15。在与肽P15成分温育16 小时后，将细胞单层用盐水溶液洗涤2次。最后，以1-2000nM的浓 度添加在本发明中优选的细胞生长抑制剂，并将温育继续72小时。最 后，如本发明中先前所述，测定每种细胞生长抑制剂的细胞生存力和 IC50值。表2中所示的结果证实，用肽P15成分对肿瘤细胞进行预处 理增加了这些细胞对本发明中优选的每种细胞生长抑制剂的敏感性。 此外，我们评估了P15预处理对于SW948细胞的影响，所述SW948细 胞固有地对于细胞生长抑制剂的效应具有抗性。结果证实，肽P15成 分还将固有药物难治性肿瘤细胞转变成对于本发明中优选的细胞生长 抑制剂敏感的细胞。(表3)。

我们的数据证实，顺次施用肽P15成分和本发明中优选的细胞生 长抑制剂导致肿瘤细胞对于此类药物的抗肿瘤效应的敏化。

表2.顺次施用的药物组合的体外化学敏化效应

 

变量单独的         细胞生长抑制剂细胞生长抑制剂+ P15预处理      顺铂720nM20nM紫杉醇17nM0.9nM5-氟尿嘧啶1200nM105nM

 

长春新碱856nM83nM多柔比星423nM72nM环磷酰胺2400nM100nM丝裂霉素C994nM20nM伊马替尼600nM10nM万珂2000nM370nM易瑞沙689nM63nM

表3.顺次施用的药物组合对于固有药物难治性肿瘤细胞 的体外化学敏化效应

 

变量单独的         细胞生长抑制剂细胞生长抑制剂+ P15预处理      顺铂≥1000μM120μM紫杉醇≥1000μM97μM多柔比星≥1000μM320μM

通过在本发明中使用的肿瘤细胞之中观察到的由药物调节的蛋白 质谱进一步验证了肽P15成分对于化学敏化的影响。为此，如本发明 中先前所述，分析来自用肽P15成分处理或未处理的H-125细胞的核 内蛋白提取物。表4显示了一组蛋白质，其由肽P15成分调节，并且 通过其功能性质，其在分子水平上支持和证明了在本发明的药物组合 中这种肽的化学敏化作用。

表4.由P15调节的蛋白质谱

 

通过用肽P15成分进行处理 而被已知的蛋白质       抑制系数核磷蛋白48T-丝束蛋白3.34热休克蛋白(HSP-27、-70和-90)2.5

 

Y-box1转录因子3.33促红细胞生成素前体120S-谷胱甘肽转移酶4.87蛋白酶体激活复合物3.35由泛素激活的E1酶2.49葡萄糖-6-磷酸异构酶8.53甘油醛-6-磷酸脱氢酶6.62丙酮酸激酶8.34在翻译方面受控制的肿瘤蛋白质4.32通过用肽P15成分进行处理 而被激活的蛋白质       激活系数抗增殖蛋白2.28微管蛋白α-13.23微管蛋白β-22.56微管蛋白β-33.15

实施例4：在体内肽P15成分的化学敏化效应。

为此，如本发明中先前所述，将5×10⁶个SW948细胞植入在肿瘤出现后，如下顺次施用所述药物组合：首先，在5天期间以0.5 mg/kg/天经腹膜内施用肽P15成分。随后，在另外5天期间以5mg/kg/ 天施用顺铂(图2A)、紫杉醇(图2B)和多柔比星(图2C)。本文的 结果证实，在体内用P15预处理化学难治性肿瘤能够恢复抗性表型，从 而使得所述肿瘤变得能够对本发明中优选的细胞生长抑制剂作出应 答。这些发现还提供了证据来证明，当顺次施用所述成分时，本发明 的药物组合能够克服常常观察到的固有肿瘤抗性。