一种转sck/cry1Ac双价抗虫基因水稻品系科丰8号外源插入片段旁侧序列及应用

摘要

本发明涉及“一种转sck/crylAc双价抗虫基因水稻品系科丰8号外源插入片段旁侧序列及应用”，属生物技术领域。5’端旁侧序列如SEQ ID NO1所示，3’端旁侧序列如SEQ ID NO2所示。利用该旁侧序列设计特异性引物用于目的DNA扩增，能建立灵敏、特异性的水稻品系科丰8号的品系特异性定性、定量PCR检测。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列。具体的说，涉及一种转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。对转基因植物进行品系特异性的检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。而转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。

目前已经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入载体旁侧序列，例如：张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法，谢家建等人于2007年利用TAIL-PCR、genomewalking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63和科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，并建立了品系特异性的检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。

发明内容

针对上述领域中的空白，提供了一种转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列。

进一步，本发明还提供该转基因品系特异性的PCR检测方法。

一种转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5’端旁侧序列，其特征在于：5’端旁侧序列如SEQ ID NO1所示。

一种转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其特征在于：3’端旁侧序列如SEQ ID NO2所示。

5’端旁侧序列的制备方法，其特征在于提取转基因水稻品系科丰8号植物基因组DNA，通过TAIL-PCR扩增得到。

3’端旁侧序列的制备方法，其特征在于提取转基因水稻品系科丰8号植物基因组DNA，通过PCR扩增得到。

转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为5’端旁侧序列的特异性引物：一条引物为依据SEQ ID NO1中1-1110位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO1的1111-1747位序列设计的反向引物。

所述正向引物为K8P1：5’-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3’，

所述反向引物为K8P2：5’-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3’。

转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为3’端旁侧序列的特异性引物：一条引物依据SEQ ID NO2中1-583位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQ ID NO2的584-650位序列设计的反向引物。

所述正向序列为K8P3：5’-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3’，

所述反向序列为G3-P1：5’-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3’。

转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列定性PCR检测方法，所述PCR反应中同时含有下列引物，

正向引物为K8P1：5’-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3’，

反向引物为K8P2：5’-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3’；

正向序列为K8P3：5’-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3’，

反向序列为G3-P1：5’-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3’。

根据彭海英(彭海英.农杆菌介导的无选择标记转双价抗虫基因籼稻的获得.华中农业大学硕士学位论文.2003)报道的用于转化的载体pCDMARUBAC-Hyg的结构(见图1)，用于转化的目的基因(crylAc基因和SCK基因)和选择标记基因(hpt基因)位于两个独立的T-DNA区域，其结构见图1。其中一个T-DNA由选择标记基因hpt基因表达盒组成；另一个T-DNA由crylAc基因表达盒和SCK基因表达盒组成。

本发明采用常规方法，提取植物基因组DNA，利用TAIL-PCR分离法得到5’端旁侧序列1755bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。通过分析，该5’端旁侧序列包括：水稻基因组序列，位于水稻11号染色体(GenBank登记号：AP008217)的13191855-13192963位，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从1-1110位的核苷酸序列完全相同；转化载体pCDMARUBAC-Hyg部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中1111-1747位的核苷酸序列完全相同；

利用PCR扩增得到3’端旁侧序列650bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。通过分析，该3’端旁侧序列包括：转化载体pCUBAC-HYG部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中的1-583位的核苷酸序列完全相同；水稻基因组序列，位于水稻11号染色体(GenBank登记号：AP008217)的13192994-13193060位，其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从584-650位的核苷酸序列完全相同。

转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，以5’端旁侧序列和/或3’端旁侧序列作为目的DNA扩增片段。根据5’端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据1-1110位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列设计，位于水稻11号染色体(GenBank登记号：AP008217)的13191855-13192963位，反向引物可根据1111-1747位的核苷酸序列设计，即是按照转化载体pCDMARUBAC-Hyg部分序列设计，本发明设计的正向引物为K8P1：5’-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3’，反向引物为K8P2：5’-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3’。

根据3’端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据1-583位的核苷酸序列设计，即是按照转化载体pCDMARUBAC-Hyg部分序列设计，反向引物可根据584-650位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列，位于水稻11号染色体(GenBank登记号：AP008217)的13192994-13193060位，本发明设计的正向序列为K8P3：

5’-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3’，反向序列为G3-P1：

5’-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3’。

本发明首次克隆了转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段，建立灵敏、特异性的转基因水稻品系科丰8号的品系特异性定性、定量PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。

附图说明

图1 pCDMARUBAC-Hyg的T-DNA结构示意图，

图2 科丰8号5‘端边界TAIL-PCR扩增图谱，

M：DNA Marker DL2000，大小依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1，3，5，7，9：引物AD2～AD6的TAIL-PCR第二级扩增反应产物；2，4，6，8，10：引物AD2～AD6的TAIL-PCR第三级扩增反应产物

图3 科丰8号3‘端旁侧序列PCR扩增图谱，

M：DNAMarker DL2000；1：引物组合G3-P1/CptI-p1扩增，

图4转基因水稻品系科丰8号的5‘端旁侧序列特异性引物K8P1/K8P2检测，M：marker DL2000；1，2：转基因水稻品系科丰8号；3，4：对照明恢86，

图5转基因水稻品系科丰8号的3‘端旁侧序列特异性引物K8P3/G3-P1检测。M：marker DL2000；1，2：转基因水稻品系科丰8号；3，4：对照明恢86。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

转基因水稻品系科丰8号的外源插入载体的旁侧序列的克隆

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：转基因水稻品系科丰8号。

2、酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

3、实验仪器

PCR扩增仪：Eppendorf Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)

DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

二、实验方法和过程

1、水稻基因组DNA提取与检测

1)水稻基因组DNA的提取

取苗期水稻叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行水稻材料总DNA的提取。

2)水稻基因组DNA检测

取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

2、科丰8号旁侧序列的分离

1)TAIL-PCR分离科丰8号5‘端旁侧序列

TAIL-PCR用于扩增已知区域的侧翼序列。根据科丰8号T-DNA边界区域设计三个巢式特异性PCR引物P1、P2和P3，依次与5个简并引物AD2～AD6分别组合进行三次PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件见表2。

表1 用于TAIL-PCR扩增的简并引物和特异性引物

 

primerssequenceP15’-CATCTTCACTCGGTAACATCG-3’P25’-GAGTTCATTCCAGTTACTGCAAC-3’P35’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’AD25’-AGTGNAGAANCAAAGG-3’AD35’-CATCGNCNGANACGAA-3’AD45’-TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3’AD55’-TCGTNCGNACNTAGGA-3’AD65’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’

表2 TAIL-PCR反应程序和条件

2)科丰8号3‘端旁侧序列的分离

根据已测定的科丰8号5′端旁侧水稻基因组序列，在其下游设计引物G3-P1(序列为：5′-TTTATTTGGATAGTGGCGACC-3′，载体序列中SCK基因上的引物(序列为：CptI-p1：5′-AAAATGAAGAGCACCATCTTC-3’)组合进行扩增。

反应体系：0.25μL rTaq(5U/μL)，5μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)，4μL dNTP(各2.5mM)，引物各2μL(10μM)，模板各2μL(20ng/μL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50μL，

扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min。

3、序列测定和分析

PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM 1300 Genetic Analyzer进行序列测定。采用vector NTI10.0(Invitrogen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。

三、实验结果

1、科丰8号的5’端旁侧序列

科丰8号T-DNA边界的TAIL-PCR扩增结果表明，6个AD引物中只有AD5的第二、第三级扩增产物的条带单一，且片断大小相近(图2)。回收AD5的第三级扩增片段，连到pMD18-T载体上，进行序列测定。

序列测定结果表明，扩增片段长度为1747bp，其中1-1110位为水稻基因组序列，位于水稻11号染色体(GenBank登记号：AP008217)的13191855-13192963；1111-1747位为转化载体pCDMARUBAC-Hyg部分序列。

2、科丰8号的3’端旁侧序列

利用G3-P1/CptI-p1组合PCR扩增得到了特异性的扩增，见图3。序列测定表明，扩增片段长度为650bp，其中1-583位为转化载体pCUBAC-HYG部分序列，584-650位为水稻基因组序列，位于水稻11号染色体(GenBank登记号：AP008217)的13192994-13193060位。

实施例2

基于转基因水稻品系科丰8号的外源插入片段旁侧序列的定性PCR检测方法

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：转基因水稻品系科丰8号。

常规水稻：明恢86。

2、酶与试剂

分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

3、实验仪器

PCR扩增仪：Eppendorf Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

二、实验方法和过程

1、植物基因组DNA提取与检测

见实施例1中的“植物基因组DNA提取与检测”

2、基于5’端和3’端旁侧序列的品系特异性PCR检测

根据实施例1中测定的5’端和3’端旁侧序列，分别在其水稻基因组序列部分和转化载体序列部分设计引物，见表8。PCR扩增结果表明，转基因水稻品系科丰8号的5’端和3’端扩增引物组合分别得到了预期的207bp和278bp的扩增片段，而对照明恢86号均没有相应的扩增片段，见图4和图5。

表8 科丰8号品系特异性PCR检测引物

附：序列表

SEQ ID NO1：5’端序列：(1747bp)

1    ACGTAGGATT ACCTAATTGA TTAGAATAGC CTTTGTGGTG GACACTACTT AGAATAGGCT

61   GTGTTCAATA CTATGGGTTG GGAACCCAAA TCCTGTGCAC GGAAAACGGA ACGGTCTATT

121  AGCACGTGAT TAATTAAGTA TTAGCAATTT TTTTTTAAAA ATGGATCAAT ATGATTTTTT

181  TAAGCAACTT TCGTATAAAA ACTTTTTGCA AAAAACACAC CATTTAGCAG TTTGAAAAGT

241  GTGCGCGCGG AATACGAGGG AAAGGGGCTG GGAACCTCCT CATCCGAACG CAGCCTAAGG

301  CTGTGTTCTT CCCCTTCTTT CCCGAGTCAC ATTCTTCTTT TTCTGTGCGC ATGCTTTTGC

361  GAATGTTTTA TATAGGAAAC TTACTTTTAA AAATCATACT AAACCATTTT TCAAGCTCTT

421  TTTTACTAAT ACTTAATTAA TCACGTGTTA ATAGGCAACA CCGTTCCCCG TGTGGGGAAG

481  TGGAGTTACT CCACCTCCTG AACTCAGCCT AATACATCAA AGCTATCATG AGATTACCAA

541  CATGGCTTTT TCTTCGGACT CACAAATAAG ACGGTATTAT AATAACTCAA GGGACAAATC

601  CTTTAATTGA TTCTTTAAAT GATTATGATA AATTCATATA GTAATCTCTA GCGGTGTATA

661  CACTCAAGCA AGACTTAATT CTTTATTTAT TTGAATAATT TTTAATATTG TTTAGTATCT

721  TGGAAATTGA AACGTTGCAT TCGTATTTAA AACTATAGCA TAACAGAATT TTCAATGACT

781  TATACATCCT TAATTTGAAG TATTTCTCTA AATGATACTG GCATATAAAG AGCTAGCTTT

841  GGTTGGAAAC GATAATAAAC TATGCATAGA GGAAATAAAA ATATGTGGGC TTTTACCTTC

901  ACAGTAGCGA ACGTCACATT GTTTCCATAC GTCATGGTGA ATCTGCGAAT CAATTACATT

961  TCAGAGCACA CATGCATAAG CATTATTGTT CAAAATAGTT TGTACCTTTA TATGTATTCT

1021 AAAAATATTC TGAAGTGGCC TGTTATTAAA TGAACTAATA TGCTGAAGCA AATATCTGAC

1081 CCTGCAGACT GGCCATCAAG ATGCCAGGCC TGATAGTTTA AACTGAAGGC GGGAAACGAC

1141 AATCTGATCC AAGCTCAAGC TGCTCTAGCA TTCGCCATTC AGGCTGCGCA ACTGTTGGGA

1201 AGGGCGATCG GTGCGGGCCT CTTCGCTATT ACGCCAGCTG GCGAAAGGGG GATGTGCTGC

1261 AAGGCGATTA AGTTGGGTAA CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGACGTTGTA AAACGACGGC

1321 CAGTGCCAAG CTCTGGCGAA AGGGGGATGT GCTGCAAGGC GATTAAGTTG GGTAACGCCA

1381 GGGTTTTCCC AGTCACGGCG TTGTAAAACG ACGGCCAGTG AGCGCGCGTA ATACGACTCA

1441 CTATAGGGCG AATTGGAGCT CCACCGCGGT GGCGGCCGCT CTAGAACTAG TGGATCCCCC

1501 GGGCTGCAGG AATTCGATAT CAAGCTTCTA GAGATCTAGT AACATAGATG ACACCGCGCG

1561 CGATAATTTA TCCTAGTTTG CGCGCTATAT TTTGTTTTCT ATCGCGTATT AAATGTATAA

1621 TTGCGGGACT CTAATCATAA AAACCCATCT CATAAATAAC GTCATGCATT ACATGTTAAT

1681 TATTACATGC TTAACGTAAT TCAACAGAAA TTATATGATA ATCATCGCAA GACCGGCAAC

1741 AGGATTC

SEQ ID NO2：3’端序列：(650bp)

1    AAAATGAAGA GCACCATCTT CTTTGCTCTC TTTCTCTTTT GTGCCTTCAC CACCTCATAC

61   CTACCTTCAG CCATCCCTGA TTTCGTTTTA AAGGTGTGTG TGCTGGTACT TTTCCTTGTA

121  GGGGTTACTA CTGCAGCCAT GGATCTGAAC CACCTCGGAA GTAATCATCA TGATGACTCA

181  AGCGATGAAC CTTCTGAGTC TTCAGAACCA TGCTGCGATT CATGCATCTG CACTAAATCA

241  ATACCTCCTC AATGCCATTG TACAGATATC AGGTTGAATT CGTGTCACTC GGCTTGCAAA

301  TCCTGCATGT GTACACGATC AATGCCAGGC AAGTGTCGTT GCCTTGACGT TGCTGATTTC

361  TGTTACAAAC CTTGCAAGTC CAGGGATGAA GATGATGAGA AAGATGAACT CTAGATCAAG

421  CTCGATTCTA GAGTCAAGCA GATCGTTCAA ACATTTGGCA ATAAAGTTTC TTAAGATTGA

481  ATCCTTTGC CGGTCTTGCG ATGATTATCA TATAATTTCT GTTGAATTAC GTTAAGCATG

541  TAATAATTAA CATGTAATGC ATGACGTTAT TTATGAGATG GGTGATCTCA CCCATGCTTG

601  GGTACTAAGA AATGGCAGAA CAGCATCATG GTCGCCACTA TACAAATAAA

SEQ ID NO3：

K8P1：5’-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3’

SEQ ID NO4：

K8P2：5’-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3’

SEQ ID NO5：

K8P3：5’-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3’

SEQ ID NO6：

G3-P1：5’-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3’