用于沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌复合增菌的培养基及制备方法

摘要

本发明涉及用于沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌复合增菌的培养基及制备方法，以重量份数计，培养基配方组分如下：缓冲蛋白胨水0.5－1.5份、蒸馏水1000份，葡萄糖1.0－5.0份、甘露醇1.0－5.0份、丙酮酸钠0.03－0.06份、无水亚硫酸钠0.5－2.5份、柠檬酸钠1.0－10.0份、氯化钠5.0－25.0份、胆盐1－5份、亚碲酸钾0.0005－0.0025份。制备时，先将缓冲蛋白胨水等加入到蒸馏水中，加热熔解后灭菌；冷却到50℃后，加入亚碲酸钾混匀。该培养基可融合细菌检测的前增菌以及选择性增菌两个步骤，缩短增菌时间至24小时；能够使三种目标致病菌同时增菌，并且抑制其它微生物的生长。

说明书

技术领域

本发明属于致病菌的前增菌培养基，特别是涉及一种同时对沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌复合增菌的培养基。

背景技术

我国是水产品出口大国，但是随着贸易全球化，我国渔业将面临前所未有的新问题和新挑战，对我国水产品质量提出了更高的要求，无污染、无公害必将成为水产品进入国际市场的入场券食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，是一项巨大并不断扩大的世界性公共卫生问题，控制微生物污染是目前解决水产品污染问题的主要内容。

沙门氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌都是水产品中常见致病菌，是进出口水产品中的常检项目。随着人们生活方式的改变以及水环境的恶化，越来越多人由于进食未煮熟的水产品而受到感染，加上这三种细菌危害巨大，特别是霍乱弧菌可引起大流行，严重威胁人民的生命健康，出口水产品污染这三种菌，阻碍我国水产品的出口，影响我国经济和我国在国际上的声誉，所以对水产品进行沙门氏菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的监测势在必行，对于保证人民生命健康，我国经济健康发展具有重大的意义。

目前对沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌主要采用常规增菌培养、生化鉴定及自动酶联荧光免疫检测方法(VIDAS)相结合，大多要耗费4-6天时间，而且程序复杂，所用试剂繁多，费时费力，检出效率低，检测灵敏度低，假阴性比较严重。近年来，酶联荧光免疫检测法(VIDAS)、聚合酶链式反应(PCR)、金标试纸法、API法、聚合酶免疫检测方法(EIA)和DNA探针技术等新技术逐渐应用于微生物检测，大大提高检测的灵敏度和简化了操作，甚至出现多重PCR技术、蛋白或抗体微阵列感受器、免疫吸收及DNA微阵列等技术等同一检测平台上检测多种微生物的检测方法，但是所有这些方法仍然离不开选择性增菌和/或前增菌。现有的增菌方法主要是根据所要监测的菌株进行各自的增菌处理，即不同的菌株采用各自的选择性增菌培养基进行增菌处理，费时费力，不符合现代检测方法一平台同时检测多种致病菌的发展趋势。

国际上研究出一种通用增菌培养基(UPB)可以同时增殖多种细菌，但是由于该培养基没有选择性，除了要监测的目标菌能增殖外，其它杂菌也可以大量生长，杂菌的大量生长必然影响目标菌的生长，UPB的效果不能让人满意。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使得沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌复合增菌，抑制其它微生物的生长的培养基。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌复合增菌的培养基，以重量份数计，其配方组分如下：缓冲蛋白胨水0.5-1.5份、蒸馏水1000份，葡萄糖1.0-5.0份、甘露醇1.0-5.0份、丙酮酸钠0.03-0.06份、无水亚硫酸钠0.5-2.5份、柠檬酸钠1.0-10.0份、氯化钠5.0-25.0份、胆盐1-5份、亚碲酸钾0.0005-0.0025份，培养基的pH值为7.0-7.5。

以重量份数计，所述培养基配方优选为：缓冲蛋白胨水1份、蒸馏水1000份，葡萄糖1.25份、甘露醇1.25份、丙酮酸钠0.05份、无水亚硫酸钠1.25份、柠檬酸钠5份、氯化钠15.0份、胆盐2.5份、亚碲酸钾0.001份，培养基的pH值为7.2。

用于沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌符合增菌培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)按权利要求1所述配方，将缓冲蛋白胨水、氯化钠、葡萄糖、甘露醇、亚硫酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠和胆盐加入到蒸馏水中，加热熔解后121-125℃灭菌15-18min；

(2)待步骤(1)的培养液冷却到低于50℃，在无菌条件下，加入亚碲酸钾混匀；分装存于2-4℃下备用。

缓冲蛋白胨水是由蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠组成。其中，蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠的重量比为10：3.57：1.5：5。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：本培养基可融合致病菌的前增菌及选择性增菌两个步骤，缩短增菌时间至24小时；使得三种常见的致病菌同时增菌而其它的致病微生物生长受到一定的抑制；本发明的培养物可以直接做目标菌的分离培养及生物鉴定实验，也可以直接用于多重PCR检测，作出诊断报告。

附图说明

图1是沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒检测结果图；

图2是副溶血弧菌荧光PCR检测试剂盒检测结果图；

图3是霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒检测结果图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

称取缓冲蛋白胨水20.1g、葡萄糖1.25g、甘露醇1.25g、丙酮酸钠0.05g、无水亚硫酸钠1.25g、柠檬酸钠5.0g、氯化钠15.0g、胆盐2.5g、、蒸馏水1000ml加热熔解后121℃灭菌灭菌18min。待培养冷却到50℃以下后在无菌条件下加入亚碲酸钾1.0mg，溶解混匀后分装备用。

分别取三种目标菌沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌以及非目标菌大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、小肠耶尔森氏菌、变形杆菌、产气肠杆菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、绿脓杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的斜面培养物，稀释后将稀释到10^-4的各目标菌和非目标菌的菌液0.2ml加入到上述培养基中，37℃培养24h。用可见分光光度计测定540nm下的OD值。同时将菌体接入缓冲蛋白胨水中做空白对照，结果见表1。

表1 目标菌和非目标菌单独在最佳配比的培养基中的生长情况

-表示菌体不生长，0号为空白对照，1-3号管为三个重复。

从表1看到，三种目标菌沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌在所述的培养基中生长24小时后增菌效果比无选择性的缓冲蛋白胨水佳；大部分非目标菌的生长受到了抑制，只有变形杆菌和产品肠杆菌菌液变浑浊，但是与空白无选择性的缓冲蛋白胨水相比这两种菌在所述的培养基中生长明显受到了抑制，它们的生长也明显比3种目标菌慢。

实施例2

称取缓冲蛋白胨水10.05g、葡萄糖1g、甘露醇1g、丙酮酸钠0.03g、无水亚硫酸钠0.5g、柠檬酸钠1.0g、氯化钠5.0g、胆盐1g、、蒸馏水1000ml加热熔解后123℃灭菌灭菌16min。待培养冷却到50℃以下后在无菌条件下加入亚碲酸钾0.5mg，溶解混匀后分装备用。

分别取三种目标菌沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌以及非目标菌大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、小肠耶尔森氏菌、变形杆菌、产气肠杆菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、绿脓杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的斜面培养物，稀释后将稀释到10^-4的各目标菌和非目标菌的菌液0.2ml加入到上述培养基中，37℃培养24h。用可见分光光度计测定540nm下的OD值。同时将菌体接入缓冲蛋白胨水中做空白对照，结果见表2。

表2 目标菌和非目标菌单独在下限培养基中的生长情况

0号为空白对照，1-3号管为三个重复。

从表2看到，目标菌和非目标菌都生长了。与空白无选择性的缓冲蛋白胨水比较，目标菌的生长情况比空白好，而非目标菌则受到不同程度的抑制。

实施例3

称取缓冲蛋白胨水30.15g、葡萄糖5.0g、甘露醇5.0g、丙酮酸钠0.05g、无水亚硫酸钠2.5g、柠檬酸钠5.0g、氯化钠25.0g、胆盐5g、、蒸馏水1000ml加热熔解后125℃灭菌灭菌15min。待培养冷却到50℃以下后在无菌条件下加入亚碲酸钾2.5mg，溶解混匀后分装备用。

分别接入稀释到三种目标菌沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌以及非目标菌大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、小肠耶尔森氏菌、变形杆菌、产气肠杆菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、绿脓杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌斜面培养物，将稀释到10^-4的各目标菌和非目标菌的菌液0.2ml加入到上述培养基中，37℃培养24h。用可见分光光度计测定540nm下的OD值。同时将菌体接入缓冲蛋白胨水中做空白对照。结果见表3。

表3 目标菌和非目标菌单独在上限培养基中的生长情况

-表示菌体不生长，0号为空白对照，1-3号管为三个重复。

从表3看出，目标菌均有生长，但是与空白无选择性的缓冲蛋白胨水相比，三种目标菌生长得比空白缓慢，受到了不同程度的抑制，特别是沙门氏菌和霍乱弧菌；非目标菌均不生长。

实施例4

按实施例1配制培养基，将沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌按照10¹cfu/ml水平以1：1：1比例接入培养基中，37℃培养24小时候，将菌液稀释到10^-6，分别涂布到BS琼脂平板以及TCBS平板上，进行分离培养。沙门氏菌在BS琼脂上位墨绿色圆形菌落，副溶血弧菌和霍乱弧菌不生长。在TCBS平板上霍乱弧菌菌落为黄色，扁平，真径2-3mm；副溶血弧菌菌落为蓝绿色，菌落呈圆形，边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明，多数具尖心、斗笠状，直径2-4mm；沙门氏菌不生长。生长结果见表4。

表4 复合增菌培养基增菌效果

表4结果表明，沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌能够同时增殖。

实施例5

按实施例1配制培养基。在无菌条件下，将鱼、墨鱼、鱿鱼(经荧光PCR鉴定不含三种目标菌)分别制备成25份粉碎。将培养物按照大约3×10²cfu/份水平接种于样品中，室温下处理15min，使细菌被吸收，然后将其放入含有225ml的自制培养基的无菌袋中，混合2min。均匀好的样品接种后37℃培养24小时。用酚/氯仿法提取细菌的DNA，用沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒进行检测，检测结果如图1至图3，可见三种目标菌均出现明显的扩增曲线，说明所述的复合增菌培养基使得样品中的三种目标菌沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌同时增殖，并达到检测的菌浓度要求，证明经所述的复合增菌培养基增菌培养后，可用于PCR检验，满足其检测限的要求。

本发明单一的培养基可以同时支持沙门氏菌，副溶血弧菌和霍乱弧菌三种食源性疾病的同时生长，将常规检测方法中的前增菌步骤和选择性增菌步骤合二为一，用于在一个检测平台上检测多个致病菌的相关技术中。

上述实施例中培养基含有抑制剂柠檬酸钠、胆盐和亚碲酸钾，高浓度的氯化钠也对背景微生物具有抑制作用。其中，柠檬酸钠可以抑制大肠埃希氏菌和枸橼酸杆菌，而对3种目标菌没有明显的抑制作用，胆盐抑制革兰氏阳性菌，亚碲酸钾可以抑制肠道杆菌和革兰氏阳性菌。三种抑制剂的添加可以起到抑制背景微生物的生长，使目标菌有较好的生长。三种菌对氯化钠的耐受性能好，提高其用量，抑制其他微生物的生长；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾可用于调节pH；蛋白胨、甘露醇是培养基中基本的营养和支持成分；丙酮酸钠用于复活并促进沙门氏菌的生长；葡萄糖用于促进副溶血弧菌的生长；亚硫酸钠用于促进霍乱弧菌的生长，同时柠檬酸钠对霍乱弧菌也具有促进作用。标本接种后，在37℃培养，增菌24小时后，划线到三种目标菌各自的选择性培养基上，分离鉴别。