变性变构型环瓜氨酸多肽、及其融合蛋白、抗体和试剂盒

摘要

本发明公开了五种变性变构型环瓜氨酸多肽、及其融合蛋白、抗体和试剂盒，本发明是综合类风湿关节炎病人自身抗体能够特异性识别的相关抗原，自主设计衍化特殊的氨基酸序列和结构而形成五种变性变构型环瓜氨酸多肽，并实验结果发现能与RA血清中的自身抗体结合，比CCP等现有的环瓜氨酸多肽检测具有更好的免疫反应性。这些多肽是根据对精氨酸残基代谢作用功能多肽而进行变性变构的设计和合成，在与环瓜氨酸多肽(CCP)、C－反应蛋白(CRP)和类风湿因子(RF)等项目的对照下，变性变构型环瓜氨酸多肽CCP5a具有特异性好，检出率高和早期诊断率高等特点。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及变性变构型多肽，特别涉及一种变性变构型环瓜氨酸多肽、及其融合蛋白、抗体和试剂盒。

背景技术：

类风湿关节炎(RA)是一种慢性、炎症性和系统性疾病，它常见的临床症状为手、足关节的畸形、肿大。发病可发生持续性，可长达几周或几个月，并发的症状有急性现象。类风湿关节炎(RA)在中国是一个常见的多发性自身免疫疾病。

类风湿关节炎(RA)疾病的早期可出现关节的疼痛、肿胀和牵拉紧张的感觉，同时还可散在地并发非特异性的麻木、发热、疲累。最典型症状为系统性关节受累。随着病程进展，受累的关节可发展到髋关节、肘关节和肩关节，并且产生运动疼痛，最终会发展失去这些病发关节的功能。

在临床上对类风湿关节炎(RA)疾病持续六周的七个方面的表现可确诊为类风湿关节炎(RA)。①关节运动受阻一小时以上；②关节炎发生三个以上关节；③关节炎发生在手关节上；④对称性关节炎；⑤风湿性小结在关节上出现；⑥血清RF阳性；⑦X光显示关节出现变形。

这也是早期临床用RF来作用类风湿关节炎(RA)的一部分标准，而最头疼的类风湿关节炎(RA)很难与系统性红斑狼疮(SLE)和混合型结缔组织(MCTD)作鉴别诊断。显然，目前在临床上用有RF、CCP、CRP、IgM-RF、GPI(本作者发明项目)等作多方面的血清学类风湿关节炎(RA)的辅助诊断，但这些生物学指标的诊断都带有一定的局限性、正确性、早期性、灵敏性及常有遗漏的问题，并且在方法学上的稳定性、方便性和可行性都也存在不少的问题。

早在1998年Schellekens等人在世界上第一个报道了将蛋白翻译后精氨酸残基修饰的而无正常功能的瓜氨酸多肽呈现在RA病人的血清中，并能与一些自身抗体反应。二年后他又将一条有19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽链的二边各一个丝氨酸改变成半胱氨酸，从而形成二硫键环状多肽，称为CCP。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种变性变构型环瓜氨酸多肽、及其融合蛋白、抗体和试剂盒，所述的这种变性变构型环瓜氨酸多肽、及其融合蛋白和试剂盒要解决现有技术中早期诊断类风湿关节炎的方法小稳定、不方便的技术问题。

本发明提供了一种变性变构型环瓜氨酸多肽，其具有如下的氨基酸连接结构：

或者

本发明还提供了一种变性变构型环瓜氨酸多肽，其具有如下的氨基酸连接结构：

本发明还提供了一种变性变构型环瓜氨酸多肽，其具有如下的氨基酸连接结构：

本发明还提供了一种变性变构型环瓜氨酸多肽，其具有如下的氨基酸连接结构：

本发明还提供了一种变性变构型环瓜氨酸多肽，其具有如下的氨基酸连接结构：

本发明还提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白含有上述的变性变构型环瓜氨酸多肽。

优选的，所述的融合蛋白中还含有牛血清白蛋白、或者锁孔蛋白、或者人或鼠免疫球蛋白Fc端多肽蛋白。

具体的，所述的多肽分别在N-端链接半胱氨酸，然后与牛血清白蛋白、或者锁孔蛋白、或者人或鼠免疫球蛋白Fc端多肽蛋白偶联。

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有上述的变性变构型环瓜氨酸多肽。

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有上述的融合蛋白。

本发明还提供了一种单克隆或多克隆抗体，所述的抗体抗上述的变性变构型环瓜氨酸多肽。

本发明所呈现的发明是关于5个自主设计的变性变构型环瓜氨酸多肽，并针对类风湿关节炎(RA)病人血清中的自身抗体而作为模拟自身免疫病的自身抗原。五个变性变构型多肽的变性变构设计和合成，建立其与类风湿关节炎(RA)病人自身抗体的免疫反应的专一性、高效性和早期检测性。本发明在与相关性靶标检测比较基础上还建立了几种检测方法，同时对RA的自身抗原和自身抗体都进行了检测和比较，取得了临床诊断的重大价值和深远意义。

本发明的检测可用于体外类风湿关节炎(RA)及其一些自身免疫病的诊断和早期诊断。此方法用变性变构的环瓜氨酸多肽作为自身抗原进行检测是对新的类风湿关节炎(RA)生物化学靶标的一个尝试并产生临床诊断意义。为了对类风湿关节炎(RA)诊断的正确性、早期性和敏感性作进一步的比较和分析，在类风湿关节炎(RA)病人组和正常人对照组的比较下，本发明所阐述的方法包括CCP5a检测法和现有临床上应用的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF检测法一起作比较，并产生了可观的结论。

本发明是根据Schellekens提出变性的多肽有瓜氨酸存在并能与RA血清中自身抗体反应原理，设计出一套5种变性变构型的环瓜氨酸新颖合成多肽，也证明了其有重大的类风湿关节炎(RA)血清学诊断意义。这一发明是基于类风湿关节炎(RA)的生物学靶标参数来帮助发现和早期发现类风湿关节炎(RA)的存在。这一发明不仅提供了类风湿关节炎(RA)在CCP的基础上又一新颖靶标，也加强和扩展了类风湿关节炎(RA)的诊断意义和临床应用价值。

五个变性变构型环瓜氨酸多肽是经过对瓜氨酸多肽结构分析和顺序解读的特殊设计调整而发明的一组与类风湿关节炎(RA)病人血清中的自身抗体相关的，能进行特异性免疫反应的CCP5a～e系列人工合成的多肽抗原。基于类风湿关节炎(RA)病人已存在的CCP和MCV的mRNA编码，精氨酸代谢衍生物，以及人类的免疫病发生发展、医学免疫学、分子生物学基本原理的基础上从相关瓜氨酸变性多肽上进行变性变构设计和修饰，形成一组特异性、有空间结构变形、接近类风湿关节炎(RA)真正自身抗原和其早期发生或形成的多肽抗原。

在将设计的变性变构型环瓜氨酸多肽合成并与牛血清白蛋白的偶联后，进行一系列自身抗原分析评价和对照。以CCP5a代表的CCP5a～e多肽和其各个相应的多克隆抗体都具有不同程度与类风湿关节炎(RA)病人血清自身抗体和抗原的免疫反应性。本发明和已有技术相比：第一，证明了类风湿关节炎(RA)病人中有这些CCP5a～e变性变构型多肽的存在(RA相关自身抗原)；第二，证明了类风湿关节炎(RA)病人在早期和整个病程中都出现对CCP5a变性变构多肽反应的自身抗体；第三，用CCP5a对RA临床诊断意义重大，并超过了CCP、CRP、IgM-RF、IgG-RF等指标在临床上应用的价值。

建立CCP5a作为自身抗原的间接ELISA，胶体金点杂交等方法是对类风湿关节炎(RA)病人血清中自身抗体进行检测，同时用抗CCP5a抗体对此方法进行相关价值的定标(标准曲线)以及与正常人结果对照，以换算成类风湿关节炎(RA)病人自身抗体的相对结果值(RU/mL)。所建立的方法特异性好，灵敏度高、线性优，可靠性强和重复性佳，可作为临床上对类风湿关节炎(RA)病人血清中自身抗体检测不可比拟的好方法，也将是临床上对类风湿关节炎(RA)早期诊断优选方法之一。

附图说明：

图1显示了精氨酸在精氨酸肽脱亚胺酶、水分子和钙离子的作用下进行脱氨并释放出氢离子而形成瓜氨酸的反应过程。

图2显示了在三羧酸循环和尿素代谢中，主要以鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸与瓜氨酸(Cit)之间可作转化代谢，从而在多肽蛋白合成代谢中产生精氨酸(R)的非正常衍生物瓜氨酸(Cit)多肽的反应过程。

图3显示了当精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽代谢中形成后，其多肽中的精氨酸和瓜氨酸在结构上，精氨酸与瓜氨酸或瓜氨酸与瓜氨酸可能会形成环化结构的二种模式。

图4显示了五种CCP5a～e多肽-BSA偶联蛋白质的氨基酸顺序，其中BSA为牛血清蛋白；瓜氨酸(Cit)是从精氨酸(R)代谢中的衍生物；瓜氨酸(Cit)和瓜氨酸(Cit)之间和或瓜氨酸(Cit)和精氨酸(R)之间的边线为其多肽结构中的环化；在CCP5a的二个环化连线中，链线(1)和链线(2)是两种环化可选择的可能性(也是造成抗原多样性一方面)；除了瓜氨酸(Cit)三字母代码外，其它英文字母为氨基酸单字母代码。

图5显示了五种抗CCP5a～e抗血清经三倍系列稀释后分别与五种抗CCP5a～e多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度(OD)和梯度曲线，以代表羊抗CCP5a～e抗体与CCP5a～e抗原的效价。

具体实施方式：

实施例1  设计和合成五种变性变构型环瓜氨酸多肽

五种特殊设计变性变构型环瓜氨酸多肽是来自于精氨酸与瓜氨酸之间演变及其环化中间体。精氨酸(Arginine，Arg or R)与赖氨酸(Lysine，Lys or K)和组氨酸(Histidine，Hisor H)一样是一种碱性氨基酸，是人体20种必须氨基酸之一，也是人体正常蛋白质合成、分解代谢中不可缺少的原料之一。但是瓜氨酸却不是人体代谢的必须氨基酸，它是精氨酸变性变构后去氨基的衍生物，如图1所示，精氨酸在精氨酸肽脱亚胺酶(PAD＝peptidglarginine deiminase)、水分子和钙离子的作用下进行脱氨并释放出氢离子而形成瓜氨酸(Citrulline or Cit)。在精氨酸变性变构去氨基产生其衍生物瓜氨酸过程中的精氨酸肽脱亚胺酶(PAD)，也是在三羟酸循环和尿素代谢中的中间体，并且它自己可循环代谢反应。如图2所示，在三羧酸循环和尿素代谢中，主要以鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸与瓜氨酸(Cit)之间可作转化代谢，从而在多肽蛋白合成代谢中产生精氨酸(R)的非正常衍生物瓜氨酸(Cit)多肽。

如果在人体蛋白质代谢最重要的三羧酸循环中，精氨酸代谢出现其非正常的衍生物瓜氨酸并滞留在多肽蛋白中，那么此多肽蛋白就可能被人体的免疫机制看作是一个外来抗原而产生自身抗体，这样抗原抗体的结合物会沉积在人体一些关节中，它们可激发补体的链接反应而造成局部组织损伤，是潜在的类风湿关节炎(RA)病的发病基础。

本发明申请者认为当精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽中形成后，其多肽中的精氨酸和瓜氨酸在结构上，精氨酸与瓜氨酸或瓜氨酸与瓜氨酸会形成环化结构(如图3所示)，并且这样的变性变构型环瓜氨酸多肽结构更容易被人体的免疫机制所识别为自身抗原，这就是本发明申请者认为是类风湿关节炎(RA)或自身免疫疾病的发病机制之一。

实施例2  五种变性变构型环瓜氨酸多肽的顺序和理化性状

根据前面阐述的生物生化原理和类风湿关节炎(RA)的临床自身抗原的基础，由精氨酸衍生物蛋白多肽环瓜氨酸序列、其环化结构和蛋白多肽的理化性质，还以临床上应用CCP等多肽分子作参照而重新进行变性变构设计，合成一组新型的五种变性变构型环瓜氨酸多肽，并将此序列多肽命名为CCP5a～e(如图4所示)。

图4是五种CCP5a～e多肽与BSA蛋白质偶联后的氨基酸顺序，其中BSA为牛血清蛋白；瓜氨酸(Cit)是从精氨酸(R)代谢中的衍生物；瓜氨酸(Cit)和瓜氨酸(Cit)之间和或瓜氨酸(Cit)和精氨酸(R)之间的边线为其多肽结构中的环化。在CCP5a的二个环化连线中，链线(1)和链线(2)是两种环化可选择的可能性(也是造成抗原多样性一方面)。除了瓜氨酸(Cit)三字母代码外，其它英文字母为氨基酸单字母代码。五种CCP5a～e多肽的生物理化特性为：

1).CCP5a：18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为1937.16道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH₂)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0～2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5a多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。

2).CCP5b：18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为1870.05道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH₂)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0～2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5b多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。

3).CCP5c：18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为2011.26道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH₂)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0～2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5c多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。

4).CCP5d：18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为2101.35道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH₂)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0～2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5d多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。

5).CCP5e：18个氨基酸长的环状多肽(图4)，分子量为2249.57道尔顿(Dal)，在与BSA偶联之前，氨基(-NH₂)末端的修饰为氢链(H)，羟基(COOH)末端的修饰为羟基(OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0～2分钟达到95％A峰(主峰)，在2～10分钟后为5％的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍然按照CCP5e多肽的浓度计算(BSA为载体，浓度在反应中忽略不计)，经冷冻干燥后，配成1.0mg/ml在PBS缓冲液中(可溶性佳)的多肽蛋白溶液并经0.22um过滤，无菌保存在4℃冰箱中。

实施例3  五种CCP5a～e变性变构型环瓜氨酸多肽特征和抗原抗体的比较

五个CCP5a～e变性变构型环瓜氨酸多肽的生物学特征是一种按照氨基酸多肽合成中精氨酸和瓜氨酸之间或瓜氨酸与瓜氨酸之间互相环化性质的多肽。此原理就像CCP多肽顺序中将二个丝氨酸变性成半胱氨酸而形成半胱氨酸之间的二疏键(-S-S-)链环化，CCP5a～e在结构上有着一个或一个以上环化的多肽。虽然这些环多肽是假设和人工合成的，并为了模拟类风湿关节炎(RA)病人血清中自身抗原的一些蛋白质多肽在代谢中的变性变构的性质，其CCP5a～e的环化作用也增强了RA自身抗原的自我免疫原性和与自身抗体反应的免疫亲和力。这些特征在下列的实验中得到了证实和比较。

五种CCP5a～e多肽的KLH偶联蛋白分别用加强免疫法免疫美国得克萨斯州的纯种山羊，以产生较高滴度的抗血清，分别为抗CCP5a、CCP5b、CCP5c、CCP5d和CCP5e多克隆山羊抗体。其鉴定这些抗体的反应性(反应滴度)同时也证明五个CCP5a～e多肽的免疫反应原性(如图5所示)，五种抗CCP5a～e抗血清经三倍系列稀释后分别与五种抗CCP5a～e多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度(OD)和梯度曲线，以代表羊抗CCP5a～e抗体与CCP5a～e抗原的效价。

羊抗CCP5a～e抗血清ELISA效价反应的鉴定，其方法和步骤为，在PBS中每种CCP5a～e分别以0.5微克/微升(ug/ml)的浓度100微升/孔(ul/well)包被于96孔ELISA板上(MaxiSorb plate，Nunc，Inc.)室温过夜。第二天，用1.5％BSA/PBST(牛血清白蛋白/磷酸盐/吐温-20缓冲液)封闭一小时，然后分别加上已经三倍系列稀释的五种羊抗CCP5a～e和五种相应的羊的血清(在免疫羊之前收集的，作为本底对照)，室温反应一小时；用PBST洗涤三次后加上100ul/well经1∶4000稀释后的HRP偶联的兔抗羊抗体(美国Jackson ImmunoLab公司)，室温哺育反应1小时，再用PBST洗涤四次后，加HRP的底物TMB和过氧化氢溶液进行显色；最后在Dynatech MR5000酶标阅读仪上取λ＝450nm波长阅读OD值和λ＝590nm波长参比OD值(减少本底的读数)而取得相对的抗体滴度效价。

从图5的结果上，对五种CCP5a～e抗体进行小结排列如下：

抗CCP5a多抗＞抗CCP5b多抗＞抗CCP5c多抗＞抗CCP5d多抗＞抗CCP5e多抗

(1∶6000±)  (1∶5000±)  (1∶2500±)  (1∶2000±)  (1∶1500±)

从图5中可以看到，在免疫羊血清本底对照组中，五种CCP5a～e都有一些本底，原因可能此类动物羊的聚球蛋白与BSA有一些非特异性的吸附，或者在兔抗羊抗体中有非特异性反应，但是这些本底并不是太高，不会影响到测定的OD读数。

在建立CCP5多肽抗原反应的模式中，有二种CCP5a～e多肽结合蛋白可供选择，牛血清白蛋白(BSA，约9kDa分子量大小)偶联的CCP5多肽蛋白和锁孔蛋白(KLH，约56kDa分子量大小)偶联的CCP5多肽蛋白。为作比较，将这二种偶联蛋白分别以0.5ug/mL，100ul/well包被于96孔ELISA反应板上并室温过夜，反应板封闭后，将已经1∶100稀释的混合正常人血清(用德国欧蒙医学实验诊断股份公司的抗CCP抗体ELISA检测试剂盒而检测到CCP约为1个单位)和1∶100稀释的已用欧蒙试剂盒检测过的RA病人血清(CCP中度阳性)100ul/well加在已包被和封闭好的ELISA反应板上，室温1小时后洗涤三次，再加100ul/well以1∶30,000稀释HRP偶联的羊抗人IgG，室温1小时后再洗涤四次，加HRP底物溶液(TMB和过氧化氢)并显色10分钟，读取OD 450/590nm值。将结果小结如“表一”所示。

表一是BSA和KLH分别偶联的CCP5a～e蛋白多肽在与正常人和RA病人血清反应的比较。类风湿关节炎(RA)病人血清的阳性对照是以已临床测定的RF、IgM-RF、CRP和CCP等的中间值域(OD值)的病人血清(各3例)混合而成。CCP5a～e RU/ml是由取各3份混合阳性血清OD值及各3份混合正常人血清OD值除得平均值为相应的抗CCP5单位(RU/ml)(重复三次)。

从“表一”的结果分析看，BSA偶联的各个CCP5a～e OD值或相关单位(RU/ml)都比KLH偶联的CCP5a～e好，显示了BSA偶联CCP5a～e有更好的应用价值。KLH偶联的CCP5a～e可能由于KLH分子量较大，偶联后KLH巨大蛋白将CCP5a～e的环形表位自身抗原决定簇在蛋白质折垫后覆盖住了。

实施例4  五种CCP5a～e变性变构型环瓜氨酸多肽BSA偶联体与临床上应用CCP多肽蛋白的诊断价值和意义比较

选择已用CCP方法对21例类风湿关节炎(RA)病人血清测定，将其低、中和高三种结果各7例RA血清选出，同时随机选取20例正常人血清进行混合。将此21例高、中和低CCP值的类风湿关节炎(RA)病血清及混合20例正常人血清分别与进行免疫反应。经过上述的ELISA方法进行测定，所得结果如“表二”所示。

CCP and CCP5a～e Comparing Each Other.

表二是用ELISA方法对CCP与五种CCP5a～e多肽蛋白互相比较。21例类风湿关节炎(RA)病人血清和随机选取20例正常人血清进行混合作为阴性或本底对照进行CCP测定，分出低、中和高三种各7例结果值，然后用同样的血清样本和分组进行五种CCP5a～e的ELISA检测。将这些结果分组排列比较。

综合上述“表二”分析，五种CCP5a～e蛋白多肽和CCP多肽互相比较中，以CCP5a的结果最合理，也较接近已在目前临床上确立诊断意义的CCP结果。显然五种CCP5a～e多肽都与CCP多肽的检测结果有着不同程度的差异，这些差异也从另一方面给CCP5比CCP在RA的临床诊断意义上比较打下了基础。这些结果证明了五种自主设计的CCP5a～e是可行的，有类风湿关节炎(RA)诊断应用价值的。而CCP5对类风湿关节炎(RA)的临床诊断意义将在下面详细描述。

实施例5  抗CCP5a的抗体测定方法和临床诊断的意义

在选定了以CCP5a为五种CCP5a～e变性变构型环瓜氨酸多肽中的代表，其相对结果稳定，线性好，是最具有类风湿关节炎(RA)临床潜在意义的一种自身抗原。

为了与临床上现有的类风湿关节炎(RA)诊断方法作比较和定诊断靶值，如前面所述的间接酶标方法等是为了建立一种稳定、可靠、特异高、灵感强的检测方法。当然此发明申请的检测方法权限不只局限于间接酶标法，还包括任何运用五种CCP5a～e多肽抗原和其相应的抗体对任何自身免疫病包括类风湿关节炎(RA)抗原抗体的CCP5a的金标法(其数据和结果表明都相当有意义，  它的比较结果与下例间接ELISA检测结果类似，这一组实验结果就不例在此)、比浊法、生物芯片法、膜点杂交法等等血清学或体液学的诊断方法。

以间接ELISA法的实验方法为例，临床上的血清标本用生理盐水作1∶100稀释后为样本进行检测。酶标的封闭液采用1.5％BSA/1.0％牛血清/PBST缓冲液(pH7.4的磷酸盐、Tween-20和牛血清白蛋白缓冲液)。

CCP5a蛋白多肽诊断单位的定值，采用10份CCP5a阳性血清和10份混合正常人血清(其CCP值在1.0RU/ml，即欧蒙公司相对单位)进行间接ELISA检测并重复3次，然后分别计算其混合阳性血清和混合正常人阴性血清的平均吸光度值。定义该混合正常人阴性血清的抗CCP5a自身抗体水平的为一个抗CCP5a单位。再将混合阳性血清平均吸光度值除以混合正常阴性血清的平均吸光度值，其商即为混合阳性血清抗CCP5a单位。以混合阳性血清用含10％牛血清/PBS中作系列稀释，在测定后得到相应的100、50、25、12的抗CCP5a自身抗体单位，然后再以混合正常人阴性血清的抗CCP5a自身抗体水平为一个抗CCP5a单位，并将此单位称为相关单位(RU/ml)。

将已建立好的检测方法和设计计算的抗CCP5a～e自身抗体靶值相对单位作为一个可在临床上应用的方法。用单盲法将配制的试剂、材料和操作方法在上海市光华风湿病综合医院进行对81例已在临床上确诊为类风湿关节炎(RA)的病人新鲜血清检测抗CCP5a自身抗体，还同时对CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF作比较检测。CCP的检测是用进口试剂盒(德国欧蒙医学实验诊断股份公司的抗CCP抗体ELISA检测试剂盒)和其相应的标准(即大于25.0RU/ml为阳性)，CRP ELISA检测的标准为大于5mg/L为“+”阳性、RF-IgG的ELISA测定结果大于50U/ml为阳性、而IgM-RF的乳胶比浊滴定法测定结果大于1∶80为阳性。

用四种对照方法的临床81例病人结果都一一与CCP5a间接ELISA结果作比较，并采用2×2卡方(X²)检验方法进行统计学处理。在81例类风湿关节炎(RA)病人中，首先进行以男女性别分组处理，其结果发现所有5项指标之间都没有男女性别的差异(结果在此省略)。

其次，以年龄方面分组(如“表三”所示)，男女平均年龄都小于40岁的有16个样本，其RA的发病史在平均5年左右。通过统计结果分析，RA病人的CCP5a结果与CRP、IgG-RF、

表三是以81例RA男女病人中以小于40岁的年龄为一组(共16例)，进行五项测定指标结果的比较(阴影部位可看作阳性结果)，并用卡方检验对这些结果进行分析。

IgM-RF测定结果的差别没有显著意义。然而，CCP5a的阳性检出率为63％(10/26)，而CCP只有38％(6/10)，两者之间结果经卡方检验的统计学分析显示，它们之间的差异有显著意义。说明CCP5a自身抗体对40岁以下年龄组的检出率比CCP自身抗体要高得多。

再次，为了说明检测CCP5a的自身抗体能作为类风湿关节炎(RA)早期诊断的一个首选指标，从81例类风湿关节炎(RA)病人中选出其发病史短于1年半的18例病人血清测定数据编成一组(如“表四”所示)。以如上相同的五种检出方法作比较，其中抗CCP5a自身抗体的检出率不仅最高(比CCP的检出率高达3倍以上)，而且它与CCP结果比较有着非常显著的差异(P＜0.01)。因此，抗CCP5a自身抗体的检测是对类风湿关节炎(RA)病人发病早期诊断的好方法。

表四是18例类风湿关节炎(RA)病史在一年半以内的病人，对其血清进行五项测定指标测定和比较(阴影部位可看作阳性结果)，并用卡方检验对这些结果进行分析。

最后，将所有81例类风湿关节炎(RA)病人以男女性别分开，以病人血清的五项检测指标(包括CCP5a、CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF)结果陈列于“表五”中。所有81例RA病人的平均年龄在56岁左右(22-76岁之间)，他们的平均发病史在8年左右，他们的性别与发病和检测结果没有差异。通过对包括CCP5a、CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF五项检测指标的结果进行两两X²卡方检验和统计学处理。除了CRP外，抗CCP5a自身抗体的检测结果都与CCP、IgG-RF和IgM-RF的结果有着非常显著的差异。即抗CCP5a自身抗体与其它三者CCP、IgG-RF和IgM-RF结果比较，其检出率高，灵敏性强，并且它的阳性高低与临床症状和诊断符合率高。

表五是81例类风湿关节炎(RA)男女病人，其血清学的五项测定指标测定和比较(阴影部位可看作阳性结果)，并用卡方检验对这些结果进行分析。

通过对“表五”结果作进一步分析，可以看到虽然CRP与抗CCP5a自身抗体的结果没有明显的差异，但是这81例标本是以临床上诊断RA阳性病人的血清标本，而CRP是一个过于感敏的血清学诊断方法，其特异性公认为不高，只能作为项目互相比较的参考价值。抗CCP5a自身抗体的检测不仅敏感性能达到CRP那样高，其特异性也非常好。在这五个项目检测中，都以100例正常人血清的平均值为阴性的低值(基础值)。

抗CCP5a自身抗体检测的特异性和检出率总体上，比抗CCP自身抗体检测要好和高许多。比如在这组81类风湿关节炎(RA)病人中检测指标与临床诊断符合情况为，CCP5a有16例漏检或为阴性(20％)，而CCP却有29例漏检或为阴性(36％)，其比较有显著差异(X²＝4.43，n＝162，f＝1，P＜0.05)。如果将漏检或阴性的类风湿关节炎(RA)病例作CCP5a和CCP两两比较，在CCP5a的16例阴性中，CCP只有6例为阳性占37.5％；而在CCP5a 65例阳性中，CCP却有19例为阴性占29.2％。反而言之：在CCP 29例阴性，CCP5a有19例阳性占65.5％；在CCP 52例阳性，CCP5a有6例阴性占11.5％。虽然其漏检或为阴性结果的真正原因和二边的误差性都有待于探讨和研究，但是从这些结果的比较上看，CCP5a比CCP检出阳性率相对地高近3倍，而漏检率却低近一倍，其意义是非常明显的。

结论：

五种变性变构型环瓜氨酸多肽是根据多肽结构和自身免疫病包括类风湿关节炎(RA)的自身抗原结构为依据，独立创新设计的一种新型、具有临床诊断意义，特别是对类风湿关节炎(RA)病可作早期诊断价值的人工合成自身抗原。为此建立了一个特异强、稳定性好、敏感性高的间接ELISA CCP5a诊断新方法。用单盲法对临床上81例类风湿关节炎(RA)病人检出结果显示，它不仅可作类风湿关节炎(RA)的诊断和早期诊断指标，而且比目前已临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF，特别是比CCP检出方法要优越得许多，是今后将会发展成一个在中国乃至在世界对类风湿关节炎(RA)诊断方面可靠、可依赖早期诊断和首选的方法。检出这一CCP5a自身抗体也是临床上对类风湿关节炎(RA)进行早期治疗或预防的一个非常有价值参考的指标，同时也可指示类风湿关节炎(RA)或自身免疫病的病程发展。