利用木酚素类化合物治疗痤疮的方法及含有该化合物的组合物

摘要

本发明涉及利用通式1所示的木酚素类化合物治疗痤疮的方法以及组合物，更详细地说，本发明涉及含有所述通式1所示的木酚素类化合物的针对痤疮诱发菌的抗菌用组合物以及利用该组合物治疗痤疮的方法。本发明的通式1所示的木酚素类化合物具有优异的抑制痤疮诱发菌生长的抗菌活性，并且具有优异的热稳定性，所以可有效用于针对痤疮诱发菌的抗菌剂以及痤疮治疗剂。

说明书

技术领域

本发明涉及利用以下述通式1表示的木酚素类化合物治疗痤疮的方法，并涉及含有所述木酚素类化合物的组合物。更详细地说，本发明涉及针对痤疮诱发菌的抗菌用组合物，该组合物含有以通式1表示的木酚素类化合物；本发明还涉及利用该组合物治疗痤疮的方法。

背景技术

痤疮起因于毛囊和皮脂腺的炎症性疾病，其导致青春期和年轻年龄段的人在面部皮肤毛囊出现炎症，是一种极为常见的皮肤疾病。然而，最近由于空气污染、性激素不均衡、药品滥用、压力、内脏疾病等原因，罹患痤疮人群的年龄段正在扩大。处于青春期时，男性和女性的男性荷尔蒙分泌均是旺盛的，这刺激了存在于毛囊附近的皮脂腺，结果皮脂腺增大，分泌出大量的皮脂。与此同时，毛孔入口的角质层变厚，粘着力变大，毛孔变窄或者被堵塞。其结果是，皮脂堵在毛囊内，由于栖息在毛囊内的细菌的繁殖而发展成炎症。

引起痤疮和炎症的微生物包括痤疮丙酸菌(Propionibacterium acnes)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)等葡萄球菌(Raman A.et al.，Lett.Appl.Microbiol.，21：242-245，1995)。这些微生物在正常的皮肤内也存在，特别是痤疮丙酸菌是引起痤疮的主要菌。上述微生物首先通过毛囊管侵入到毛囊中，在毛囊深处栖息的同时分解皮脂，生成游离脂肪酸，如果这里发生葡萄球菌的二次感染，则会出现红肿并产生脓。

为了抑制这些引起痤疮和毛囊皮脂腺炎症性皮肤疾病的病原菌，迄今为止有采用过氧化苯甲酰、水杨酸、苯扎氯铵、苯酚、四环素或者红霉素等抗菌药来抑制上述病菌的方法。利用四环素等抗生素的方法在皮肤治疗方面虽然有效，但是已知这样对诱发痤疮丙酸菌中出现抗药性菌株的可能性大，而且很可能诱发光过敏作用等副作用(Gollnick，H.et al.，Dermatology.，196：119-125，1998)。此外已知，水杨酸制剂的主要作用是去除角蛋白，不能用于化脓性皮肤炎，有时还引起皮肤发红和红斑。另外，有大量报道指出抑制化脓菌的过氧化苯甲酰制剂出现过敏性皮肤炎以及红斑等的副作用，而且在功效方面也不能完全治愈痤疮。

另外，最近在利用茶树油(tea tree oil)、王浆(royaljelly extract)、人参提取物(ginseng extract)等天然物治疗痤疮，但是，上述天然物基本都不是单一物质，所以在制成皮肤外用剂和化妆品这些制剂时，有时由于添加的其他物质而出现抗菌活性急剧下降的情况，此外，这些天然物的抗菌谱不宽，所以存在对诱发痤疮的葡萄球菌不能表现出有效的抗菌作用的问题。特别是，从天然物得到的抗菌物质，在加热时，其中相当一部分的有效成分由于挥发而消失，或者存在热稳定性差、抗菌活性急剧下降的倾向，存在难以制成制剂的问题(Higaki，S.et al.，J.Dermatology.，23：310-314，1996)。

木酚素是苯基正丙烷通过正丙基侧链的β位键合的天然物的总称，在其药效方面，公开了降血糖功能(韩国公开公报第2003-0064919号)、消炎功能(韩国公开公报第2003-0035124号)等。肉豆蔻木酚素(macelignan)是从植物肉豆蔻(Myristica fragrans)中发现的代表性木酚素类化合物(Tuchinda P.et al.，Phytochemistry，59：169-173，2002)，有报道指出其对诱导细胞凋亡的半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)具有活化作用(ParkB.Y.et al.，Biol.Pharm.Bull.，27(8)：1305-1307，2004)，并具有抗氧化作用(Sadhu，S.K.et al.，Chem.Pharm.Bull.，51(9)：595-598，2003)等。但是，迄今尚没有关于以所述肉豆蔻木酚素为代表的下述通式1的木酚素类化合物针对痤疮诱发菌的抗菌活性的报道的例子。

发明内容

此处，本发明的发明人为了从天然物中得到对所述痤疮诱发菌具有强有力的抗菌活性的化合物，经过长期探索，结果确认，从植物肉豆蔻(Myristica fragrance)分离的木酚素类化合物对痤疮诱发菌表现出卓越的抗菌活性以及热稳定性，从而完成了本发明。

本发明的目的是提供以下述通式1表示的木酚素类化合物，其对痤疮诱发菌表现出优秀的抗菌活性，并提供含有上述化合物的针对痤疮诱发菌的抗菌用组合物以及痤疮治疗用组合物。

此外，本发明的目的是提供抑制痤疮诱发菌的生长的方法以及治疗痤疮的方法，所述方法中，将以下述通式1表示的木酚素类化合物施用至需要这些物质的个体。

此外，本发明的目的是提供利用以下述通式1表示的木酚素类化合物制备针对痤疮诱发菌的抗菌剂以及痤疮治疗剂的用途。

为了达成所述技术课题，本发明提供抗菌用组合物以及痤疮治疗用组合物，所述组合物含有以下述通式1表示的木酚素(lignan；2，3-二苄基丁烷；2，3-dibenzylbutane)类化合物或其可药用盐作为有效成分，对选自由痤疮丙酸菌、表皮葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌组成的组中的痤疮诱发菌表现出抗菌活性。

[通式1]

(所述通式1中，R₁、R₂是C_1-5烷氧基或羟基基团，R₃是或)

此外，本发明提供对选自痤疮丙酸菌、表皮葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌等痤疮诱发菌的生长进行抑制的方法以及治疗痤疮的方法，其中，将有效量的以所述通式1表示的木酚素类化合物施用至需要这些物质的个体。

此外，本发明提供以所述通式1表示的木酚素类化合物的用途，其用于制造针对选自由痤疮丙酸菌、表皮葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌组成的组中的痤疮诱发菌的抗菌剂以及痤疮治疗剂。

本发明中，″有效量″是指本发明的木酚素类化合物在作为给药对象的个体内表现出针对痤疮诱发菌的抗菌活性、能够有效治疗痤疮的量。此外，本发明中，″个体(subject)″是指哺乳动物，特别是包括人类的动物。所述个体有时也指需要治疗的患者(patient)。

下面详细说明本发明。

本发明的特征在于，提供以通式1所示的木酚素类化合物对痤疮诱发菌的抗菌活性用途。

本发明的木酚素类化合物以下述通式1表示。

[通式1]

(R₁、R₂是C_1-5烷氧基或羟基基团，R₃是或)

本发明优选的木酚素类化合物可以是通式1中所述R₁为甲氧基、R₂为羟基、R₃为的化合物，即下述化学式1表示的肉豆蔻木酚素[(8R，8′S)-7-(3，4-亚甲基二氧苯基)-7′-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-8，8′-二甲基丁烷]。

[化学式1]

本发明的木酚素类化合物可以以盐的形式、优选可药用盐的形式使用。所述盐优选为通过可药用游离酸(free acid)形成的酸加成盐。所述游离酸可以使用有机酸和无机酸。所述有机酸包括柠檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、乙二酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲基苯磺酸、谷氨酸以及天冬氨酸，但不限于此。此外，所述无机酸包括盐酸、溴酸、硫酸以及磷酸，但不限于此。

利用以往提取分离物质的方法可以从植物或者植物的一部分中获得本发明的木酚素类化合物。为了获得目的提取物，可将茎、根或者叶经适宜脱水、浸软或者仅经脱水后，利用本发明所属技术领域的技术人员公知的精制方法，精制目的提取物。此外，与上述通式1所示的木酚素类化合物相应的合成化合物或者这些化合物的衍生物一般是可以购买到的物质，或者是可以利用公知的合成方法化学制造的。

所述通式1表示的本发明的木酚素类化合物可以从植物肉豆蔻(Myristica fragnance Houtt.)分离精制(Jung Yun Lee et al.，Kor.J.Pharmacogn.21(4)：270-273，1990)。优选从肉豆蔻(nutmeg)或假种皮(aril)分离、精制获得。所述肉豆蔻是指植物肉豆蔻的成熟果实或果实中的种子。此外，本发明的木酚素类化合物可以从肉豆蔻经压榨获得的油中分离精制。此外，也可由作为其他肉豆蔻科植物的长形肉豆蔻(Myristicaargentea Warb)等分离精制(Filleur，F.et al.，Natural Product Letters，16：1-7，2002)。进一步也可以从厚朴(Machilus thunbergii)(Park B.Y.et al.，Biol.Pharm.Bull.，27(8)：1305-1307，2004)、蜂巢草(Leucas aspera)分离精制(Sadhu，S.K.et al.，Chem.Pharm.Bull.，51(9)：595-598，2003)。

作为用于本发明的木酚素类化合物的分离的提取溶剂，可使用水或者C₁-C₆有机溶剂。优选单独使用或者混合使用蒸馏水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、苯、氯仿、醋酸乙酯、二氯甲烷、己烷、环己烷、石油醚等各种溶剂。从植物肉豆蔻提取物分离精制本发明的木酚素类化合物时，可以单独或者同时使用填充有硅胶(silica gel)或者活性氧化铝(alumina)等各种合成树脂的柱色谱(column chromatography)以及高效液相色谱(HPLC)等。不过，有效成分的提取以及分离精制方法不一定限定为上述方法。

这样，本发明的木酚素类化合物可以以分离、精制的纯化合物形式使用，进一步，也可以以含有该化合物的提取物的形式使用。例如，如上所述，可以以植物肉豆蔻的种子、果实或者假种皮提取物的形式使用，或者以植物肉豆蔻的种子经压榨得到的油的形式使用。如上所述，所述提取物可以通过用水或者C₁-C₆有机溶剂提取植物肉豆蔻来获得。所述提取物优选由植物肉豆蔻的种子获得，即为肉豆蔻提取物(nutmeg extract)。

本发明的一个实施例中，从植物肉豆蔻(Myristica fragrance)果实(肉豆蔻)的乙醇提取物中分离、精制上述通式1表示的木酚素类化合物中代表性的化合物，即上述化学式1表示的肉豆蔻木酚素(macelignan)(参见实施例1)。

本发明的通式1所示的木酚素类化合物对痤疮丙酸菌等痤疮诱发菌表现出卓越的抗菌活性，并且热稳定性优异，即使加热也能维持该抗菌活性(参见实施例3)。

研究本发明的木酚素类化合物对于引起痤疮的病原菌即痤疮丙酸菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是否有抗菌活性，结果表明其具有高的抗菌活性(参见图6以及表2)。特别是对于已知作为痤疮的主因菌的痤疮丙酸菌，经证明其最小抑菌浓度(MIC)为2μg/ml，显示出比以往作为痤疮治疗剂而大量使用的药剂更好的抗菌活性。也就是说，以往作为痤疮治疗剂使用的过氧化苯甲酰对痤疮丙酸菌的最小抑菌浓度(MIC)是500μg/ml～1000μg/ml(Decker，LC.et al.，Antimicro.Agents.Chemother.，33(3)：326-330，1989)，苯扎氯铵的最小抑菌浓度(MIC)为200μg/ml～300μg/ml(Gloor，M.et al.，Arch.Dermatol.Res.，265(2)：207-212，1979)，茶树油成分松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol)的最小抑菌浓度(MIC)为300μg/ml～500μg/ml(Raman，A.et al.，Lett.Appl.Microbiol.，21(4)：242-245，1995)，所以本发明的木酚素类化合物与所述公知的痤疮治疗剂相比，对痤疮诱发菌表现出了更优秀的抗菌活性。此外，本发明的木酚素类化合物对痤疮丙酸菌的最小抑菌浓度是64μg/ml，其抗菌活性甚至是肉豆蔻粗提物的约30倍以上，抗菌活性出色(参见下面的比较例1)。此外，制造含有本发明的木酚素类化合物的化妆水以及乳剂并进行抗菌活性实验，结果表明，所述化妆水及乳剂对痤疮诱发菌的抗菌活性极为出色(参见表5以及表7)。

上述这些结果意味着本发明的木酚素类化合物对引起痤疮的病因菌即痤疮丙酸菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性出色，具有治疗痤疮的效果。本发明首次探明了这种通式1所示的本发明的木酚素类化合物对痤疮诱发菌的抗菌活性。此外还得知了本发明的木酚素类化合物的抗菌活性远高于以往作为痤疮治疗剂而使用的化合物的抗菌活性，与以往的痤疮治疗剂相比，本发明的木酚素类化合物可以用作具有优秀效果的痤疮治疗剂。

因此，以本发明的上述通式1所示的木酚素类化合物或者其可药用盐作为有效成分的抗菌用组合物以及痤疮治疗用组合物在临床给药时，可以口服或者非口服给药，并且可以以常规药物制剂的形式进行应用。

当本发明化合物以常规药物形式进行制剂时，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或者赋型剂进行调制。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，对于这种固体制剂，可以在上述的木酚素类化合物中混合至少一种赋型剂进行调制，所述赋型剂例如为淀粉、碳酸钙、蔗糖或者乳糖、明胶等。

此外，除简单的赋型剂外，还可以使用润滑剂等，所述润滑剂例如为硬脂酸镁或滑石。用于口服给药的液体制剂包括悬浊剂、内溶液剂(internal solution)、油剂(emulsion)、糖浆剂等，除广泛使用的单纯稀释剂如水、液体石蜡之外，其同时还可含有多种多样的赋型剂，例如可包含湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于非口服给药的制剂包括经灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浊剂、油剂(emulsion)、冻干制剂、软膏剂、乳剂(cream)。作为非水性溶剂、悬浊剂，其中可使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等注射用酯等。

此外，本发明的抗菌用组合物以及痤疮治疗用组合物可以进行非口服给药，非口服给药可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射或者胸内注射的注入方式进行。为了制成非口服给药用剂型，将上述通式1的木酚素类化合物与稳定剂或者缓冲剂一起在水中混合，制成溶液或者悬浊液，将其制成安瓿或者小瓶的单位给药形式。对于剂量单位，例如可以是单剂量的1、2、3或4倍，或者1/2、1/3或1/4倍。单剂量优选为含有一次施用的有效药物，这通常相当于1日给药量的全部、1/2、1/3或者1/4。

对于本发明的通式1所示的木酚素类化合物的有效容量，1次服用量为0.1mg/kg～50mg/kg，优选为1mg/kg～10mg/kg，1天可服用1～3次。对于特定患者，剂量水平根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、食物、给药时间、给药方法、排泄率、疾病的严重程度等进行改变。

将本发明的通式1所示的木酚素类化合物对小鼠口服给药，进行毒性实验，结果表明，口服毒性实验的50％致死量(LD₅₀)大于等于2000mg/kg。

特别是，含有本发明的通式1所示的木酚素类化合物的抗菌用组合物以及痤疮治疗用组合物可以制剂化为皮肤涂敷用药品，也就是软膏、乳剂形式，相对于制剂物总重量，可以根据剂型适当地配合0.001重量％～10.0重量％、优选0.001重量％～5.0重量％的本发明的化合物。这是因为，添加量少于0.001重量％时，抗菌活性降低，添加量超过10.0重量％时，抗菌活性并不会因为仅增加该添加量而存在明显差别。

含有本发明的上述通式1所示的木酚素(lignan)类化合物的针对痤疮诱发菌的抗菌剂以及痤疮治疗剂包括痤疮皮肤用化妆品。所述痤疮皮肤用化妆品包括肥皂等清洁剂以及乳剂、化妆水等。

含有本发明的通式1所示的木酚素(lignan)类化合物的化妆品可以制备成多种多样的制剂形式使用，例如肥皂、液态以及乳剂形式的洁面剂等多种多样形式的清洁剂或者乳剂、化妆水、凝胶体、水溶性液体、精油、水包油型以及油包水型等剂型，但是，本发明所属技术领域的技术人员能够极容易地确定以什么样的剂型进行制造使用。此外，可轻松地添加到洁面泡沫、乳液、精油等基础化妆品中作为痤疮皮肤用化妆品使用。

相对于清洁剂或者化妆品总重量，本发明的通式1所示的木酚素类化合物根据剂型可在0.001重量％～10.0重量％、优选0.001重量％～5.0重量％的范围内进行适当的配合。这是因为，添加量少于0.001重量％时，抗菌活性降低，添加量大于10.0重量％时，抗菌活性不会因为仅增加该添加量而存在明显差别。

附图说明

图1是本发明的木酚素类化合物的¹³C-NMR光谱；

图2是本发明的木酚素类化合物的¹H-NMR光谱；

图3是本发明的木酚素类化合物的¹H-¹H COSY光谱；

图4是本发明的木酚素类化合物的¹H-¹³C HMBC光谱；

图5是本发明的木酚素类化合物的EI-Mass光谱；

图6是图表，表示根据活菌数测定法测定本发明木酚素类化合物对痤疮丙酸菌的抗菌活性的结果(◆对照组的二甲基亚砜、■0.002％浓度的肉豆蔻木酚素试样、▲0.001％浓度的肉豆蔻木酚素试样、●0.0005％浓度的肉豆蔻木酚素试样)。

图7是图表，表示根据活菌数测定法测定本发明的肉豆蔻粗提物对痤疮丙酸菌的抗菌活性的结果(◆对照组的二甲基亚砜、■0.02％浓度的肉豆蔻粗提物试样、▲0.01％浓度的肉豆蔻粗提物试样、●0.005％浓度的肉豆蔻粗提物试样)。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明进行更详细的说明。

但是，下面的实施例仅仅是本发明的举例，本发明的内容并不被限定为下面的实施例。此外，下面的实施例以及实验例等中，没有特别明示为体积％的百分比(％)表示重量％。此外，所有的活性分析均重复实施至少3次，其结果以平均值±标准偏差表示。此外，利用Students′s t-test进行统计分析，p值＜0.05的情况下，认为具有统计学上的明显差异。

<实施例1>由肉豆蔻分离、精制木酚素类化合物

<1-1>肉豆蔻木酚素的分离以及精制

在经干燥粉碎的100g(干燥重量)肉豆蔻中加入400ml 75体积％的乙醇，在常温放置二天之后，利用沃特曼(Whatman)2号滤纸过滤该溶液。重复上述过程2次之后，将乙醇过滤液真空浓缩，进行冷冻干燥之后，利用硅胶柱色谱分离法，用己烷和乙酸乙酯以20∶1的比率混合的溶剂进行洗脱，用真空旋转浓缩器完全除去溶剂，制造肉豆蔻粗提物。将上述肉豆蔻粗提物在TLC板上用己烷和乙酸乙酯以10∶1的比例混合的溶剂系统进行分离，通过TLC板分析法对其确认。将通过TLC板分析法确认的提取物的抗菌活性物质用己烷和乙酸乙酯以10∶1混合的溶剂系统展开，调整抗菌活性物质的展开距离与溶剂的展开距离的比例为0.2，再用甲醇和水的比率为8∶2(体积/体积)的展开溶剂进行薄层色谱分析(TLC，RP-18gel 60F₂₅₄，Merck)，分离Rf＝0.2、在紫外线波长(254nm、365nm，VL-6-LC、Vilberlourmat)有强吸收带的单一物质。

<1-2>结构分析

为了确定在实施例<1-1>被分离的单一物质的结构，分别用600MHz和150MHz(溶剂：DMSO)测定¹H-NMR光谱和¹³C-NMR光谱，分别示于图1和图2。为了以¹³C-NMR光谱和¹H-NMR光谱的结果为基础测定¹H-¹H的相关关系和¹H-¹³C的相关关系，测定了¹H-¹H COSY光谱和¹H-¹³C HMBC光谱，其结果示于图3和图4。综合分析¹H-NMR、¹³C-NMR、¹H-¹H COSY、¹H-¹³C HMBC，结果示于表1。

表1

 位置  ¹³C-NMR  ¹H-NMR  ¹H-¹H COSY¹H-¹³C HMBC 1  135.4 2  109.2  6.72brsC-7，C-6，C-4，C-3 3  147.3 4  145.1 5  107.9  6.79d(7.8)  6.61C-6，C-4，C-3，C-1 6  121.7  6.61dd(7.8)  6.79C-7，C-5，C-4，C-2，C-1 7  38.2  2.23dd(13.2，9.3)  2.66dd(13.2，4.8)  1.64，2.66  1.64，2.23C-8，C-6，C-2，C-1C-9，C-8，C-6，C-2，C-1 8  38.7  1.64brs  0.75，2.23，2.66C-7 9  16.0  0.75d(6.3)  1.64C-8，C-7 1′  132.4 2′  112.9  6.66brsC-7′，C-6′，C-4′，C-3′ 3′  147.1 4′  144.4 5′  115.2  6.66d(7.9)  6.53C-6′，C-4′，C-3′，C-1′ 6′  121.0  6.53d(7.9，1.1)  6.66C-7′，C-5′，C-4′，C-2′，C-1′ 7′  38.0  2.17dd(13.2，9.3)  2.66dd(13.2，4.8)  1.64，2.66  1.64，2.17C-8′，C-6′，C-2′，C-1′C-9′，C-8′，C-6′，C-2′，C-1′ 8′  38.7  1.64brs  0.75，2.17，2.66C-7′ 9′  16.1  0.75d(6.3)  1.64C-8′，C-7′ OMe  55.5  3.72(s) O-CH₂-O  100.6  5.95d(4.8)C-3，C-4

<1-3>质量分析

此外，为了分析上述分离的单一物质的质量，将测定的EI/MS的结果示于图5。根据EI/MS，[M]⁺出现在m/z328，由此确定本化合物分子量为328，分子式是C₂₀H₂₄O₄。

将上述的¹H-NMR、¹³C-NMR、¹H-¹H COSY、¹H-¹³C HMBC以及EI/MS的结果与已经发表的研究报告(Woo，W.S.et al.，Phytochemistry，26：1542-1543，1987)进行比较分析、鉴定，结果确认到在实施例<1-1>中分离的单一物质是用上述化学式1表示的肉豆蔻木酚素(macelignan)化合物。

<实施例2>抗菌活性的研究

<2-1>通过活菌数测定法测定木酚素类化合物抑制痤疮诱发菌生长的效果

将上述实施例<1-1>制造的肉豆蔻木酚素化合物溶解在二甲基亚砜中，制造浓度为0.002％、0.001％、0.0005％的试样。将痤疮丙酸菌用所制造的试样稀释成2×10⁵CFU/ml，向各个试管中添加100μl，在37℃分别进行2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时的反应之后，将各试样依次10倍梯度稀释，进行倾注平板法(pour plate method)培养，培养于37℃恒温箱中进行，测定作为代表性的痤疮诱发菌的痤疮丙酸菌的活菌数。其结果如图6所示。

由图6可知，根据活菌数测定法测定活菌数的结果表明，肉豆蔻木酚素化合物的浓度为0.002％(20μg/ml)时，2小时内基本杀灭了细菌，浓度为0.001％(10μg/ml)时，8小时内基本杀灭了细菌。该结果意味着，采用以肉豆蔻木酚素化合物作为原料的口服药物或经皮施用的药物作为痤疮治疗剂的情况下，若为口服药物，则通常考虑每隔8小时服用，若为软膏或贴剂，则考虑每隔约2小时～4小时使用，此时所述药剂对作为代表性痤疮诱发菌的痤疮丙酸菌表现出极为有效的杀菌活性。

<2-2>木酚素类化合物的最小抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration，MIC)测定

将实施例<1-1>制造的肉豆蔻木酚素化合物溶解在0.5％的甲醇中，分别在每个准备好的试管中加入1ml血液平板培养基(BHI broth，脑心浸出液)，仅在最初的试管中分别加入1ml 2％浓度的肉豆蔻木酚素类化合物，以2倍梯度依次稀释。分别向各个试管中添加100μl痤疮丙酸菌，使该稀释液中痤疮丙酸菌浓度为2×10⁵CFU/ml，在37℃培养至少24小时，测定不产生混浊的最小抑菌浓度，并示于表2。按同一方法测定对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度，其结果示于表2。

表2对痤疮诱发菌的最小抑菌浓度的测定结果(单位：μg/ml)

  痤疮丙酸菌  金黄色葡萄球菌  表皮葡萄球菌  肉豆蔻木酚素  2  125  64

<比较例1>肉豆蔻粗提物抗菌活性的研究

对于在上述实施例<1-1>分离肉豆蔻木酚素的过程中制造的肉豆蔻粗提物，以上述实施例<2-1>公开的方法，测定其对痤疮诱发菌的生长的抑制效果，结果示于图7。此外，以实施例<2-1>公开的方法测定肉豆蔻粗提物对痤疮诱发菌的最小抑菌浓度，结果确认到对痤疮丙酸菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度分别是64μg/ml、250μg/ml、250μg/ml。

<实施例3>木酚素类化合物的热稳定性

将上述实施例<1-1>制造的肉豆蔻木酚素化合物溶解在二甲基亚砜中，制造0.1％浓度的试样，分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃以及121℃进行30分钟的热处理，以打孔扩散法(well diffusion assay)测定抗菌活性，结果示于下述的表3中。

表3

  处理温度(℃)  60  70  80  90  100  121  加有肉豆蔻木酚素的板上的  清亮区的直径(mm)  17  16  17  17  18  17

从上述表3可知，进行从60℃到121℃的热处理以后，抗菌活性也几乎没有减少。从而，确认了本发明的木酚素类化合物在高温处理过程中稳定。

<实施例4>含有肉豆蔻木酚素的化妆水的制造以及其抗菌活性的研究

<4-1>含有肉豆蔻木酚素的化妆水的制造

利用本发明的肉豆蔻木酚素化合物，制造具有下面表4的组成的化妆水。将实施例<1-1>分离的肉豆蔻木酚素化合物制成4种浓度(1.0％、0.1％、0.01％、0.001％)，分别在一定量的水中溶解后，与磷酸水溶液混合。将乙醇与甘油、丙二醇混合后，加入到前面制造的混合物中，混合的同时追加香料、防腐剂，用蒸馏水调整重量后，均匀混合。

表4

<4-2>抗菌活性的研究

在每个试管中分别添加4ml上述实施例<4-1>制造的含有不同浓度的肉豆蔻木酚素的化妆水，在该试管中添加1ml含有痤疮丙酸菌等痤疮诱发菌的液体，振荡培养，24小时之后测定活菌数。其结果示于下面的表5。

表5

从上述表5的结果可知，与不含肉豆蔻木酚素化合物的成分的化妆水相比，本发明的药用化妆水对痤疮丙酸菌等痤疮诱发菌的抗菌活性极高。

<实施例5>含肉豆蔻木酚素的乳剂的制造及其抗菌活性的研究

<5-1>含肉豆蔻木酚素的乳剂的制造

利用本发明的肉豆蔻木酚素化合物，制造具有下面表6组成的乳剂。首先，在75℃～80℃使B表示的物质熔融，在同样的温度使C表示的物质中的鲸蜡醇和防腐剂熔融。使C在B中乳化，分别向其中加入浓度为3.0％、0.1％、0.01％、0.001％的以A表示的肉豆蔻木酚素化合物，混合，最后加入香料，用蒸馏水进行定量，制得所述乳剂。

表6

<5-2>抗菌活性的研究

在每个试管中分别添加4ml上述实施例<5-1>制造的含有不同浓度的肉豆蔻木酚素化合物的乳剂，在该试管中添加1ml含有痤疮丙酸菌等痤疮诱发菌的液体，振荡培养，24小时之后测定活菌数。其结果示于下面的表7。

表7

从上述表7的结果可知，与不含肉豆蔻木酚素的成分的乳剂相比，本发明实施例的乳剂对痤疮丙酸菌等痤疮诱发菌的抗菌活性极高。

<实施例6>木酚素类化合物的浓度对痤疮患者的临床试验

<6-1>口服给药

使用实施例<1-1>分离精制的肉豆蔻木酚素，实施临床试验治疗痤疮。试验对象选择受痤疮困扰的十几岁到三十几岁的30名男女，1天2次，每次600mg，给药4周之后，将结果示于表8。与给药前的病变的个数相比，给药4周后的病变的个数明显减少，在统计学上有明显差别(p值＜0.05)。

表8口服给药时痤疮病变个数的测定

  给药前的平均个数  给药4周后的平均个数  p值  面疱  18.92  7.94  0.0073  丘疹  14.47  5.69  0.013  脓疱  5.92  2.30  0.037  结节  0.74  0.24  0.0215

<6-2>经皮施用

使用上述实施例<5-1>制造的含有肉豆蔻木酚素的乳剂，实施对痤疮预防以及治疗的临床试验。试验对象选择受痤疮困扰的十几岁到三十几岁的30名男女，1天2次每次定量用于皮肤，4周之后，将结果示于表9。与研究开始前的病变的个数相比，给药4周后的病变的个数明显减少，在统计学上有明显差别(p值＜0.05)。

表9经皮施用时的痤疮病变的个数测定

  研究开始之前平均个数  给药4周之后平均个数  p值  面疱  19.74  5.21  0.0083  丘疹  18.40  6.17  0.0024  脓疱  6.24  2.37  0.0231  结节  0.73  0.26  0.034

<制造例1>本发明的痤疮治疗剂的制造

<1-1>片剂的制造

将25mg本发明的肉豆蔻木酚素与26mg直接成片用赋型剂乳糖、3.5mg Avicel(微晶纤维素)、1.5mg作为崩解助剂的乙醇酸淀粉钠、以及8mg作为粘合剂的直接成片用L-HPC(低取代羟丙纤维素)一起放进U型混合机混合20分钟。混合完毕之后，追加1mg作为润滑剂的硬脂酸镁，混合3分钟。经定量试验和抗湿试验后进行制片，然后进行包衣，得到片剂。

<1-2>糖浆剂的制造

用下述方法制造含有2％(W/V)本发明的肉豆蔻木酚素或者其可药用盐作为有效成分的糖浆剂：将2g本发明肉豆蔻木酚素的酸加成盐、0.8g糖精、以及25.4g糖溶解在80g温水中。将上述溶液冷却后，在其中混合8.0g甘油、0.04g香料、4.0g乙醇、0.4g山梨酸以及适量的蒸馏水。向上述混合物添加水使达到100ml。

<1-3>胶囊剂的制造

将50mg本发明的肉豆蔻木酚素、50mg乳糖、46.5mg淀粉、1mg滑石以及适量的硬脂酸镁进行混合，然后将其填充到硬凝胶胶囊中，制造胶囊剂。

<1-4>针剂的制造

按下面的方法制造含有10mg有效成分的针剂。将1g本发明的肉豆蔻木酚素的盐酸盐、0.6g氯化钠以及0.1g抗坏血酸溶解在蒸馏水中，制造100ml溶液。将所述溶液装瓶，在20℃加热灭菌30分钟。

产业上的可利用性

根据上述研究，本发明的通式1所示的木酚素类化合物对痤疮丙酸菌(Propionibacterium acnes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等痤疮诱发菌具有出色的抗菌活性，并具有出色的热稳定性。因而，本发明的木酚素类化合物作为针对痤疮诱发菌的抗菌剂以及痤疮治疗剂极为有用。