诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基

摘要

本发明涉及植物细胞工程领域一种诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基。本发明所提供的诱导茄子小孢子形成胚状体的方法，是将茄子小孢子接种到本发明培养基，在25－28℃条件下进行暗培养得到胚状体。本发明的培养基成本低、培养效果好，利用本发明培养基进行茄子小孢子诱导的方法具有成胚率高、培养周期短的优点，将本发明培养基及小孢子诱导方法应用于茄子遗传育种中，大大丰富了茄子的优良基因型个体，也会明显缩短育种周期，不仅完善了茄子单倍体育种途径，而且为茄科作物小孢子离体培养提供技术和理论依据，为加快我国茄果类蔬菜作物遗传育种和遗传研究提供可靠的技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞工程领域一种诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基。

背景技术

单倍体在遗传育种中有重要的意义。目前获得单倍体的一种主要手段是离体培养小孢子获得单倍体植株。小孢子数量大，单个状态体积小且形态均一，便于在人工控制条件下研究其生长、分化和遗传转化过程，如人工诱变花粉、染色体功能鉴定等，因而小孢子是很好的研究材料。离体诱导小孢子使植株隐性性状容易表现，进而丰富了植株类型，同时还可以得到纯合的单倍体和双倍体，提供了多种遗传分析材料，加速了育种进程。离体小孢子为单细胞，具有天然的分散性，数量巨大，易于获得，加上小孢子胚胎发生和植株再生能力强，因而能用于胚胎的克隆和新基因型或突变体的大量快速繁殖。通过此法获得的单倍体再进行加倍，获得加倍单倍体群体(DH群体，doubled-haploid progenies)。DH群体在遗传上是纯合的基因组，所以它是AFLP、RAPD、SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，可避免二倍体由于来自双亲的两条染色体在DNA碱基分子碱基序列的细微差异，从而大大提高基因定位标图的准确性。

植物游离小孢子有单倍体细胞分裂形成胚状体或愈伤组织，然后由胚状体发育成小苗或诱导愈伤组织发育为植株两种发育途径。而胚状体在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端(胚根)和茎端(胚芽)，并且与母体细胞或外植体的维管束无直接连系，这与器官发生不同。由此说明胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。也很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条件下长成一株植物。

在植物组织培养中，诱导胚状体与诱导芽相比较，具有显著的优点，一是数量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚状体具有这些优点，所以在育种工作及园艺工作中，可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物组织培养基。

本发明所提供的植物组织培养基是在KM培养基中加入KT和葡萄糖，使KT在植物组织培养基中的终浓度为0.1-0.5mg/L、使葡萄糖在植物组织培养基中的终浓度为50-70g/L；所述植物组织培养基的溶剂为水；所述KM培养基中不含葡萄糖；所述植物组织培养基的pH为5.0-6.5。

所述KT在植物组织培养基中的终浓度优选为0.5mg/L；所述葡萄糖在植物组织培养基中的终浓度优选为65g/L。

本发明的另一个目的是提供一种诱导茄子小孢子形成胚状体的方法。

本发明所提供的诱导茄子小孢子形成胚状体的方法，是将茄子小孢子接种到上述任一所述植物组织培养基，在25-28℃条件下进行暗培养得到胚状体。

所述小孢子可以是按如下方法得到的：将花药接种到预培养基中，在34-36℃条件下暗培养5-6天，然后从花药中取出小孢子；

所述预培养基的组成可以为：在MS培养基中加入2，4-D、KT、维生素C、蔗糖和琼脂，使其在所述预培养基中的终浓度分别为0.05-0.5mg/L、0.5-2mg/L、6-10mg/L、2-4％、5-10g/L；所述预培养基的pH值为5.5-7；所述MS培养基不含蔗糖和琼脂；所述百分含量为质量百分含量。

所述花药可以取自花冠低于花萼1-2mm至花冠高于花萼1-2mm时期的花蕾。

本发明的培养基成本低、培养效果好，利用本发明培养基进行茄子小孢子诱导的方法具有成胚率高、培养周期短的优点，将本发明培养基及小孢子诱导方法应用于茄子遗传育种中，大大丰富了茄子的优良基因型个体，也会明显缩短育种周期，不仅完善了茄子单倍体育种途径，而且为茄科作物小孢子离体培养提供技术和理论依据，为加快我国茄果类蔬菜作物遗传育种和遗传研究提供可靠的技术支持。

附图说明

图1a为膨大的小孢子。

图1b为小孢子第1次细胞分裂形成两个均等的子细胞。

图1c为小孢子第1次细胞分裂形成两个不均等的子细胞。

图1d为小孢子第2次分裂形成对称的四细胞团。

图1e为小孢子第1次细胞分裂形成两个不均等的子细胞。

图1f为细胞继续进行对称分裂形成多细胞团。

图1g球型胚。

图1h为心型胚。

图1i鱼雷型胚。

图1j子叶型胚。

图1k为子叶型胚。

图1l为子叶型胚。

具体实施方式

本实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例中所用的MS培养基的组成如表1所示：

表1、MS培养基组成(此培养基中不含琼脂和蔗糖，使用时再加入)

实施例中所用的KM培养基的组成如表2所示：

表2、KM培养基的组成(此培养基中不含葡萄糖，使用时再加入葡萄糖)

实施例1、绿抗茄子小孢子的诱导

一、绿抗茄子小孢子的诱导

(一)小孢子的分离

1、花蕾的选择和采集

采集在自然条件下生长健壮植株上的发育正常、无虫蛀、无伤痕的绿抗茄子的花蕾，一般选盛花期的花蕾。通过镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的花蕾外部特征为花冠低于花萼1-2mm至花冠高于花萼1-2mm，萼片即将开裂前后，花药一般为黄绿色。

2、花药的预培养

(1)花蕾的消毒 ①用75％(体积百分含量)的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间为30sec；②用6.5％(质量百分含量)的次氯酸钠溶液浸泡15min；③用无菌水洗涤3次，每次5min，然后用无菌纸吸干备用。

(2)接种 在超净工作台上，从消好毒的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基的培养皿(Φ60mm)中，每培养皿接2个花蕾的花药，每培养皿装有8-10mL培养基。

所述预培养基I的组成为：在每升MS培养基中加入2，4-D、KT、维生素C、蔗糖和琼脂，使其终浓度分别为0.2mg·L^-1、1mg·L^-1、8mg·L^-1、3％(质量百分含量)、7g·L^-1；所述预培养基的pH值为5.8；所述MS培养基不含蔗糖和琼脂。采用高压灭菌：121℃下灭菌15-20min。

(3)热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为36℃，处理时间为6天。

小孢子脱分化发生测定：将经过温度预处理的花药进行小孢子游离，每12个花药游离到5mL无菌水中，在倒置显微镜下观察(400X)，每皿选取3个视野，记录每个视野中的小孢子总数和膨大小孢子的数目，脱分化小孢子发生率(％)＝膨大小孢子数目/总的小孢子数目×100％。

试验结果表明，绿抗茄子品种小孢子发生脱分化率为6.39％。

3、小孢子的游离和收集

用无菌的镊子从预培养过的花药中选取无污染、无褐化且膨大的花药，放到无菌的、装有洗涤培养基的培养皿中。用无菌的解剖刀将花药切成两段，再轻轻挤压花药，以使小孢子从花药中游离到洗涤培养基中。

将上述含有小孢子的洗涤培养基经200目尼龙筛网过滤，收集滤液，将滤液于500rpm离心1-10min，去掉上清，沉淀再用洗涤培养基洗涤离心，重复3次，收集沉淀，得到绿抗小孢子，用于进行诱导实验。

其中，洗涤培养基的组成为：在MS培养基中加入终浓度为30g/L的蔗糖；洗涤培养基的pH值为5.5-7。采用高压灭菌：115-121℃下灭菌15-20min。

(二)用液体培养基i进行小孢子诱导

1、小孢子诱导形成胚状体

本实验中使用的液体培养基i为：在KM培养基中加入KT和葡萄糖，得到液体培养基i，使KT在液体培养基i中的终浓度为0.5mg/L，使液体培养基i中的葡萄糖的终浓度为65mg/L；所述液体培养基i的pH为5.5；所述KM培养基的组成如表2所示。

液体培养基i用0.22μm一次性滤器过滤灭菌。

将分离得到的小孢子用液体培养基i稀释至4×10⁵个/mL(用血球计数板计数)，分装到无菌培养皿(Φ60mm)中，每个培养皿装5mL(每皿约2个花蕾的花药)，用Parafilm膜封口。

将培养皿放进培养盒内，在28℃、黑暗条件下进行静止浅层暗培养，至胚状体出现，其中每隔15-20天换一次新鲜的液体培养基i。

在游离小孢子进行静止培养时，通过倒置显微镜观察茄子小孢子离体形态发生的过程，并统计胚状体的数目，计算成胚率。

实验设3次重复，每次接种40个培养皿，共使用了约240个花蕾，结果表明，三次重复共获得了12个胚，平均成胚率为5.0％±0.5(平均值±标准差)(成胚率＝成胚数/总花蕾数)。

结果表明：茄子小孢子胚状体的发生过程主要如下：小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞。这两个均等的细胞在染色体上是和典型的营养细胞相似，他们继续分裂，形成胚状体。通过倒置显微镜可以观察到膨大的小孢子(图1：a)发生第1次细胞分裂，形成两个均等的子细胞(图1：b)，而后观察到经过第2次分裂形成对称的四细胞团(图1：d)，之后细胞继续进行对称分裂形成多细胞团(图1：f)，直至肉眼可见的球型胚、心型胚、鱼雷型胚和子叶型胚(图1：g，h，i，j，k，l)。

同时也有个别小孢子的胚胎发生是通过小孢子的不均等分裂产生的(图版1：c，e)。

实验结果还表明，小孢子胚状体离体形态发生存在不同步性，即胚状体形成的时间不一致，在倒置显微镜下可以观察到有的小孢子已刚启动分裂形成二细胞、有的已形成四细胞或多细胞，有的却还未启动分裂仍是一个大圆球细胞；在同一培养皿中肉眼可以观察到球型胚、心型胚、鱼雷型胚和子叶型胚，也说明了胚状体发育的不同步性。

二、绿抗茄子小孢子的诱导

(一)小孢子的分离

1、花蕾的选择和采集

方法与实验一中所述相同。

2、花药的预培养

(1)花蕾的消毒 ①用70％(体积百分含量)的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间为1min；②用5.0％(质量百分含量)的次氯酸钠溶液浸泡5min；③用无菌水洗涤3次，每次1min，然后用无菌纸吸干备用。

(2)接种 在超净工作台上，从消好毒的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基II的培养皿(Φ60mm)中，每培养皿接2个花蕾的花药，每培养皿装有8-10mL培养基。

所述预培养基II的组成为：在每升MS培养基中加入2，4-D、KT、维生素C、蔗糖和琼脂，使其终浓度分别为0.05mg/L、0.5mg/L、6mg/L、2％、5g/L；所述预培养基的pH值为5.5；所述MS培养基不含蔗糖和琼脂；所述百分含量为质量百分含量。采用高压灭菌：121℃下灭菌15-20min。

(3)热激处理 将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为34℃，处理时间为5天。

小孢子脱分化发生测定：将经过温度预处理的花药进行小孢子游离，每12个花药游离到5mL无菌水中，在倒置显微镜下观察(400X)，每皿选取3个视野记录视野中的小孢子总数和膨大小孢子的数，脱分化小孢子发生率(％)＝膨大小孢子数/总的小孢子数×100％。

试验结果表明茄子品种绿抗小孢子发生脱分化率为6.0％。

3、小孢子的游离和收集

方法与实验一中所述方法相同。

(二)用液体培养基ii进行小孢子诱导

1、小孢子诱导形成胚状体

用液体培养基ii进行小孢子诱导

本实验中使用的液体培养基ii为：在KM培养基中加入KT和葡萄糖，使其终浓度分别为0.1mg/L和50g/L；所述液体培养基i的pH为5.0；所述KM培养基的组成如表2所示。

液体培养基ii用0.22μm一次性滤器过滤灭菌。

将分离得到的小孢子用液体培养基ii稀释至4×10⁵个/mL(用血球计数板计数)，分装到无菌培养皿(Φ60mm)中，每个培养皿装5mL(每皿约2个花蕾的花药)，用Parafilm膜封口。

将培养皿放进培养盒内，在25℃、黑暗条件下进行静止浅层暗培养，至胚状体出现，其中每隔15-20天换一次新鲜的液体培养基i。

在游离小孢子进行静止培养时，通过倒置显微镜观察茄子小孢子离体形态发生的过程，统计胚状体的数目，并统计成胚率。

实验设3次重复，每次接种40个培养皿，共使用了约240个花蕾，结果表明，三次重复共获得了10个胚，平均成胚率为4.2％±0.5(平均值±标准差)(成胚率＝成胚数/总花蕾数)。

结果表明：茄子小孢子胚状体的发生过程与实验一中所述相同，即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞，这两个均等的细胞在染色体上是和典型的营养细胞相似，它们继续分裂，形成胚状体。同时也有个别小孢子的胚胎发生是通过小孢子的不均等分裂产生的。小孢子胚状体离体形态发生也存在不同步性

三、绿抗茄子小孢子的诱导

(一)小孢子的分离

1、花蕾的选择和采集、花药的预培养、小孢子的游离和收集的方法均与实验一中所述相同。

方法与实验一中所述相同。

2、花药的预培养

(1)花蕾的消毒 ①用75％(体积百分含量)的酒精进行花蕾表面消毒，消毒时间为3min；②用8.0％(质量百分含量)的次氯酸钠溶液浸泡40min；③用无菌水洗涤3次，每次10min，然后用无菌纸吸干备用。

(2)接种 在超净工作台上，从消好毒的花蕾中轻轻剥取花药接种于装有预培养基III的培养皿(Φ60mm)中，每培养皿接2个花蕾的花药，每培养皿装有8-10mL培养基。

所述预培养基III的组成为：在每升MS培养基中加入2，4-D、KT、维生素C、蔗糖和琼脂，使其终浓度分别为0.5mg/L、2mg/L、10mg/L、4％、10g/L；所述预培养基的pH值为7；所述MS培养基不含蔗糖和琼脂；所述百分含量为质量百分含量。采用高压灭菌：121℃下灭菌15-20min。

(3)热激处理将接种好的花药放到暗培养箱内进行热激处理，热激温度为35℃，处理时间为6天。

小孢子脱分化发生测定：将经过温度预处理的花药进行小孢子游离，每12个花药游离到5mL无菌水中，在倒置显微镜下观察(400X)，每皿选取3个视野记录视野中的小孢子总数和膨大小孢子的数，脱分化小孢子发生率(％)＝膨大小孢子数/总的小孢子数×100％。

试验结果表明茄子品种绿抗小孢子发生脱分化率为5.9％。

3、小孢子的游离和收集

方法与实验一中所述方法相同。

(二)用液体培养基iii进行小孢子诱导

1、小孢子诱导形成胚状体

用液体培养基iii进行小孢子诱导

本实验中使用的液体培养基iii为：在KM培养基中加入KT和葡萄糖，使其终浓度分别为0.5mg/L和70g/L；所述液体培养基i的pH为6.5；所述KM培养基的组成如表2所示。

液体培养基iii用0.22μm一次性滤器过滤灭菌。

将分离得到的小孢子用液体培养基iii稀释至4×10⁵个/mL(用血球计数板计数)，分装到无菌培养皿(Φ60mm)中，每个培养皿装5mL(每皿约2个花蕾的花药)，用Parafilm膜封口。

将培养皿放进培养盒内，在27℃、黑暗条件下进行静止浅层暗培养，至胚状体出现，其中每隔15-20天换一次新鲜的液体培养基iii。

在游离小孢子进行静止培养时，通过倒置显微镜观察茄子小孢子离体形态发生的过程，统计胚状体的数目，并统计成胚率。

实验设3次重复，每次接种40个培养皿，共使用了约240个花蕾，结果表明，三次重复共获得了9个胚，平均成胚率为3.8％±0.2(平均值±标准差)(成胚率＝成胚数/总花蕾数)。

结果表明：茄子小孢子胚状体的发生过程与实验一中所述相同，即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞，这两个均等的细胞在染色体上是和典型的营养细胞相似，它们继续分裂，形成胚状体。同时也有个别小孢子的胚胎发生是通过小孢子的不均等分裂产生的。小孢子胚状体离体形态发生也存在不同步性

实施例2、欧长箭茄子小孢子的诱导

一、欧长箭茄子小孢子的诱导

(一)小孢子的分离

1、花蕾的选择和采集

采集在自然条件下生长健壮植株上的发育正常、无虫蛀、无伤痕的欧长箭茄子的花蕾，一般选盛花期的花蕾。通过镜检观察小孢子的发育时期，选取单核中期和靠边期的小孢子，对应的花蕾外部特征为花冠低于花萼1-2mm至花冠高于花萼1-2mm，萼片即将开裂前后，花药一般为黄绿色。

2、花药的预培养

方法与实施例1中实验一中所述一致。

欧长箭茄子品种小孢子发生脱分化率为6.42％。

3、小孢子的游离和收集

方法与实施例1中实验一中所述一致。

(二)用液体培养基i进行小孢子诱导

1、小孢子诱导形成胚状体

方法与实施例1中实验一中所述一致。

实验设3次重复，每次接种40个培养皿，共使用了约240个花蕾，结果表明，三次重复共获得了21个胚，平均成胚率为8.8％±0.5(平均值±标准差)(成胚率＝成胚数/总花蕾数)。

结果表明：欧长箭茄子小孢子胚状体的发生过程与实施例1中实验一中所述一致，即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞，这两个均等的细胞在染色体上是和典型的营养细胞相似，它们继续分裂，形成胚状体。同时也有个别小孢子的胚胎发生是通过小孢子的不均等分裂产生的。小孢子胚状体离体形态发生也存在不同步性。

二、欧长箭茄子小孢子的诱导

(一)小孢子的分离

1、花蕾的选择和采集

方法与实验一中所述相同。

2、花药的预培养

方法与实施例1中实验二中所述相同。

试验结果表明茄子品种欧长箭小孢子发生脱分化率为6.1％。

3、小孢子的游离和收集

方法与实验一中所述方法相同。

(二)用液体培养基ii进行小孢子诱导

1、小孢子诱导形成胚状体

方法与实施例1中实验二中所述相同。

实验设3次重复，每次接种40个培养皿，共接种了使用了约240个花蕾，结果表明，三次重复共获得了19个胚，平均成胚率为7.9％±0.5(平均值±标准差)(成胚率＝成胚数/总花蕾数)。

结果表明：茄子小孢子胚状体的发生过程与实施例1中实验二中所述相同，即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞，这两个均等的细胞在染色体上是和典型的营养细胞相似，它们继续分裂，形成胚状体。同时也有个别小孢子的胚胎发生是通过小孢子的不均等分裂产生的。小孢子胚状体离体形态发生也存在不同步性。

三、欧长箭茄子小孢子的诱导

(一)小孢子的分离

1、花蕾的选择和采集

方法与实施例1中实验三中所述相同。

2、花药的预培养

方法与实施例1中实验三中所述相同。

试验结果表明茄子品种欧长箭小孢子发生脱分化率为6.0％。

3、小孢子的游离和收集

方法与实施例1中实验三中所述相同。

(二)用液体培养基iii进行小孢子诱导

方法与实施例1中实验三中所述相同。

实验设3次重复，每次接种40个培养皿，共使用了约240个花蕾，结果表明，三次重复共获得了17个胚，平均成胚率为7.1％±0.2(平均值±标准差)(成胚率＝成胚数/总花蕾数)。

结果表明：茄子小孢子胚状体的发生过程与实施例1中实验三中所述相同，即小孢子有丝分裂形成两个均等的细胞而不分化为营养细胞和生殖细胞，这两个均等的细胞在染色体上是和典型的营养细胞相似，它们继续分裂，形成胚状体。同时也有个别小孢子的胚胎发生是通过小孢子的不均等分裂产生的。小孢子胚状体离体形态发生也存在不同步性。