骨骼肌周成血管细胞和心脏中成血管细胞、其分离方法和用途

摘要

本发明公开了分离自成人骨骼肌或成人心肌的细胞的分离和特征。这些细胞用于治疗肌肉紊乱，分别包括肌营养不良和心脏疾病。

说明书

发明背景

骨骼肌干细胞

寻求能够修复营养不良患者中肌肉结构和功能的细胞始于1961 年卫星细胞的鉴定(1)。尽管卫星细胞保留了基本上维持在成人肌肉中 主要的生肌活性的细胞类型(2，3)，但是它们的一些生物学特征限制 着它们治疗原发肌病的应用潜力。事实上当卫星细胞被全身递送时， 其缺乏穿过肌肉内皮的能力，而且必须给患者全部肌肉或至少生活必 需肌肉的每2mm³肌内注射，因为这是它们从注射部位显然可以迁移的 最大距离(4)。仅这个特征就致使它们极其难于用在细胞疗法规程中， 至少在当前技术下，还有考虑到大多数被注射细胞在第一天内即消失 (5)。第二个问题表现为来自营养不良患者的卫星细胞增殖潜能降低， 以及近来观察到体外扩充降低它们的体内分化潜能(6)。

居留在骨髓或其他组织的脉管龛的其他细胞类型可以在体外或体 内分化为骨骼肌的实证为肌营养不良的细胞疗法创造了可供选择的可 能(7)。理想的细胞群应该i)容易从可到达的解剖部位获得，ii)可在 体外扩充至全身治疗所需的大量细胞(10⁹或更多)，iii)容易被病毒载 体转导，vi)能够通过全身途径到达骨骼肌，和最后v)能够在体内分 化为骨骼肌细胞，同时保留自我更新能力。在最近鉴定和表征的很多 类型中胚层干细胞当中，很多显示出这些特征中的一个或多个。然而， 通常它们的特征未被系统地研究。相反，在肌营养不良小鼠模型中已 表明胚胎小鼠中成血管细胞(mesoangioblasts)可修复肌肉形态和功 能(8)。人和小鼠细胞在体外广泛增殖的能力显著不同，因此有必要测 试相当于胚胎小鼠中成血管细胞的人细胞是否存在于胎儿或出生后人 组织中，和倘若如此，它们是否显示出可允许预知成功应用于肌营养 不良的细胞疗法规程的特征。

在本研究中，来源于正常和营养不良成人骨骼肌的细胞被命名为 周成血管细胞(periangioblasts)，并且在经历如二倍体非致瘤细胞 的衰老之前可以在体外扩充大约20倍数量；它们可以被表达小肌养蛋 白或其他治疗基因的病毒载体转导，然后诱导分化为骨骼肌。

当移植入营养不良免疫缺陷小鼠时，它们产生表达人肌养蛋白的 大量新纤维。本发明的细胞不同于任何其他中胚层干/祖细胞，这是由 于：a)它们的来源(血管)、b)它们的分离方法(移植而不是蛋白水解消 化)和c)它们的生肌分化潜能，其显著高于体内任何其他细胞，除了 居留的卫星细胞。

周成血管细胞表达白细胞通常粘附和穿过内皮的一些蛋白，因此 当动脉内递送时可以扩散入骨骼肌间隙。这显著优于不能同样如此的 居留的卫星细胞。

因此导管介导递送至succlavia、隔动脉和髂动脉应该允许来自 骨骼肌周成血管细胞到达并定殖于对于运动和呼吸必不可少的肌肉。

更重要地，当诱导体外分化时，周成血管细胞自发分化达到总数 的40％，功效远远胜过迄今为止测试过的其他非生肌细胞，并仅次于 不能通过循环递送的居留的卫星细胞。尽管尚末以系统可比较方法进 行测试，但是周成血管细胞在体内产生的肌养蛋白阳性肌纤维的数量 已远远高于以前其他作者报道的。

因此，本发明的人细胞周成血管细胞群满足成功的肌肉紊乱细胞 疗法规程的所有标准，例如假肥大型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)。周成血管细胞可从用于诊断的活组织检查容易地分离。 针吸活组织检查是可容忍的的手术，可以每隔几年重复以进行进一步 规程治疗。

心肌干细胞

梗塞后心室重建的特征为初始梗塞面积和左室腔的进行性扩大， 纤维组织沉积在室壁上取代心肌细胞。提出的逆转心肌重建的一个方 法是使用干细胞使心肌细胞再生(35)。不同的团体已报道了基于显著 的细胞表面标记例如Sca-1或c-Kit分离心肌干细胞样细胞(36，37)； 这些细胞能够修复缺血损伤后心脏的功能，尽管功效可变。然而它们 的自发心肌分化低并且它们也分化为心脏的其他组织类型(36-39)，提 示它们呈现多能祖细胞的体外扩充，仍需要特殊信号经历末期心肌分 化。另一方面，表达Is1-1的祖细胞看来只进行心肌分化，但对于增 殖和分化仍需要与其他细胞相互作用(38)。显现出来的方案揭示无法 预料的复杂性，其中可以鉴定出不同类型的祖细胞并在它们分化过程 的不同阶段最终被分离出来。大多数这些细胞施加于梗塞心脏的有益 作用的显著部分归因于增加残留心肌存活率和/或有利的血管生成的 因子的分泌也变得明朗化(40)。这例如胚胎中成血管细胞的情况，它 们的移植致使心脏功能恢复50％，但是罕见其分化为新的心肌细胞 (41)。

在本发明中，实施成年小鼠和人心肌活组织检查，通过机械和非 酶促离解方法，允许分离命名为成年心脏中成血管细胞(cardiac mesoangioblast)的细胞。基于对来自骨骼肌的细胞的上述研究，可 以认为成年细胞的局部定型(local commitment)可以引起比以前在 胚胎中成血管细胞中观察到的更有效的心肌分化。的确，小鼠心脏中 成血管细胞显示出自发(无化学佐剂)并且高的分化为搏动心肌细胞的 分化率，而唯独显示出低的分化为平滑肌细胞的分化率。至于人心脏 中成血管细胞，它们在5-azatydine存在下或当与大鼠新生心肌细胞 共培养时显示出分化为搏动心肌细胞的高分化率，和唯独分化为平滑 肌细胞的低分化率。

在小鼠心脏中成血管细胞的情况下，自发心肌分化的效率惊人地 高于和优于已描述过的心肌干细胞(Anversa group，专利申请WO 02/09650)，Is1-1阳性成心细胞(Chien group)，Tert/Sca1+祖细胞 (Schneider group，专利申请WO 04/019767)，并且甚至心肌分化能力 仅仅是笑谈的其他类型干细胞不可与之相提并论。关于它们的表型， 小鼠心脏中成血管细胞不同于所有其他的心肌干细胞：a)它们表达 CD34和CD31，这不同于心肌干细胞和Is1-2成心细胞；b)它们表达 c-Kit和Nkx 2.5，这与Tert/Sca1祖细胞不同。

人心脏中成血管细胞表达与小鼠心脏中成血管细胞类似的标记和 基因，但是这些细胞仅能够在5-azatydine存在下或与大鼠新生心肌 细胞共培养时分化为心肌细胞。

专利US 5,486,359和6,184,035描述了人间质干细胞及其分离和 激活方法，以及骨骼肌干细胞或祖细胞分化的控制。这些专利中描述 的细胞与本发明的细胞显著不同，尤其是在存在或不存在特殊标记方 面。

发明详述

本发明描述了类似于但显著不同于以前描述的源自骨骼肌和心脏 中成血管细胞(9)的人细胞的分离和特征。此外，作者证明了从成年 骨骼肌(本文命名为周成血管细胞(periangioblasts))和成年心肌(本 文命名为心脏中成血管细胞)分离的细胞分别满足企图治疗肌肉紊乱 包括肌营养不良和心脏病所要求的所有标准。

事实上，本发明描述了分别从哺乳动物成年骨胳肌或心肌的活组 织检查分离周成血管细胞和心脏中成血管细胞。

因此本发明的一个目的是骨骼肌周成血管细胞细胞群，其特征在 于表达下列标记表型：CD31^-、CD34^-、CD45^-、CD62L^-、CD106^-、CD117 ^-、CD133^-、CD146⁺、CD49b⁺、CD13⁺和CD44⁺。优选，骨骼肌周成血管 细胞细胞群进一步表达属于下组的至少一个蛋白：VCAM-1(血管细胞 黏附分子)、ICAM-1/5/2(诱导型细胞黏附分子)、CD36、CD44、b7、 b5、b1、b2整联蛋白、整联蛋白(一些a1、a5和a6)、LFA-1(白细胞 因子抗原)、IL-1R(白介素-1，受体)、SDF-R(基质衍生因子，受体) 或钙粘连素。更优选，骨骼肌周成血管细胞细胞群能够在适当的培养 条件下自发体外分化为生肌谱系，如在无诱导剂的低丰富培养基中培 养。甚至更优选，骨骼肌周成血管细胞细胞群被遗传修饰，致使其表 达外来编码序列。优选外来编码序列编码肌养蛋白或其衍生物。更优 选外来编码序列编码小的肌养蛋白。

本发明的另一目的是上面定义的周成血管细胞细胞群用于细胞疗 法治疗肌肉紊乱，如肌营养不良的用途。优选，肌营养不良选自下组： 假肥大型肌营养不良、Becker型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良症、 肌强直性肌营养不良、肢带型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良、艾 -德肌营养不良(Emery-Dreifuss肌营养不良)、远端型肌营养不良症 或先天性肌营养不良。可供选择地，肌肉紊乱可以是肌肉肌病。

本发明的另一目的是上面定义的周成血管细胞细胞群用于筛选肌 肉紊乱治疗药物的用途。

本发明的另一个目的是从供体组织样品分离上面定义的骨骼肌周 成血管细胞细胞群的体外方法，包括步骤：

a)通过非蛋白水解消化方法允许细胞从组织样品解离；

b)在包括生长因子、氨基酸、微量元素、非必需氨基酸、胎牛血 清和b-FGF的哺乳动物细胞生长培养基中培养解离细胞。

优选，生长培养基是DMEM或培养基。更优选， 体外方法进一步包括将培养的提取细胞与Sdf-1或TNFα孵育的步骤。

优选，供体是健康的或罹患疾病的受试者。更优选，受试者罹患 肌营养不良。更优选，肌营养不良是假肥大型肌营养不良。

本发明的又一个目的是人心脏中成血管细胞细胞群，其特征在于 表达下列标记表型：CD31⁺、CD34⁺、CD44⁺、CD117⁺、CD45^-和CD133^-。 优选人心脏中成血管细胞细胞群进一步表达下列标记表型：Nkx2.5⁺、 Gata4⁺、Mef2A⁺、Tbx2⁺、Tbx5⁺和Is1-1^-。更优选人心脏中成血管细胞 细胞群能够在体外在适当的培养条件下自发分化为心肌细胞。通过将 细胞暴露于5-氮胞苷或将人心脏中成血管细胞与新生心肌细胞共培 养可以诱导分化为心脏细胞。为了群间区分，可以使用小鼠或大鼠新 生心肌细胞。

本发明的另一目的是上面定义的人心脏中成血管细胞细胞群用于 细胞疗法治疗心脏疾病的用途。优选，该心脏疾病由心脏坏死或过度 增大引起。优选该心脏疾病是扩张型心脏病变或瓣膜病变。

本发明又一目的是小鼠心脏中成血管细胞细胞群，其特征在于表 达下列标记表型：CD31⁺、CD34⁺、CD44⁺、Sca-1⁺、c-kit⁺和CD45^-。优 选小鼠心脏中成血管细胞细胞群进一步表达下列标记表型：Nkx2.5⁺、 Gata4⁺、Gata6⁺、Tbx2⁺、Tbx5⁺、Is1-1⁺和Mef2A^-。更优选，小鼠心脏 中成血管细胞细胞群能够在体外在适当的培养条件下分化为心肌细 胞。通过将细胞暴露于5-氮胞苷或将小鼠心脏中成血管细胞与新生心 肌细胞共培养可以诱导分化为心脏细胞。为了群间区分，可以使用小 鼠或大鼠新生心肌细胞。

本发明的另一个目的是上面定义的小鼠心脏中成血管细胞细胞群 用于筛选治疗心脏疾病的药物的用途。

本发明的另一个目的是从供体组织样品分离上面定义的小鼠或人 心脏中成血管细胞细胞群的体外方法，包括步骤：

a)通过非蛋白水解消化方法允许细胞从组织样品解离；

b)在哺乳动物细胞生长培养基中在非贴壁涂层(non adhering coating)存在下培养解离细胞。

优选，供体是健康的或罹患疾病的受试者。更优选，受试者罹患 心房瓣膜功能障碍。

现在参照下列附图通过非限制性实施例描述本发明：

图1.人周成血管细胞的体外特征。A：培养自正常成人肌肉活组织 检查物的含有小血管的间质组织碎片的细胞长出物的相差显微镜形 态。注意成纤维细胞样细胞顶层的圆形和可折射细胞的存在。B：分离 自正常成人骨骼肌移植培养物的多克隆群体外传代5次后的相差显微 镜形态。C：人正常周成血管细胞传代15次后的Cariotype，显示了 染色体的整倍体数量。D：两个不同的正常(空心符)和两个营养不良(实 心符)人周成血管细胞的增殖曲线。E：人正常周成血管细胞传代VIII °、XII°和XIX°(图右侧)的端粒酶活性。在左侧也作为阳性对照显 示了人癌细胞HI299。箭号指示聚合酶添加产物的第一梯；黑色箭头 显示所有样品中存在的非特异性扩增产物，而灰色箭头显示内TRAP 试验标准。F：细胞在传代VIII°、XI°和XIX°(分别是第1、2、3 道)时的平均端粒长度，显示进行性缩短。

图2：A：正常人周成血管细胞的体外特征。暴露于不同生长因子 组合的相同多克隆群的相差显微镜形态：A：无；B：FGF；C：FGF+PDGFbb； D：FGF+EGF；E：FGF+LIF；F：FGF+IGF1。

图3：在不同培养基：Megacell、D-MEM、RPMI或A-MEM存在下生 长的正常人周成血管细胞的生长曲线。

图4：成人周成血管细胞的表型。(a-f)免疫荧光分析，用抗SMA(a) 和抗肌间线蛋白(b)，揭示群体大约10％表达和一些情况下细胞共表达 这两个标记(箭号)；抗PDGF受体β(c)使大多数细胞的细胞表面被染 色，详情如(d)和(e)(其也显示与抗SMA共染色)和抗NG2(f)；核被 DAPI染色。(g)RT-PCR分析人成纤维细胞、卫星细胞、正常(N)和DMD 周成血管细胞中MyoD、Myf5、肌细胞生成蛋白、Pax7、Pax3和ALP 的表达，也示出了对照GAPDH。(h)周成血管细胞提取物中NG2蛋白聚 糖和PDGFRβ的蛋白质印迹分析。分离自正常(第1、2道)和DMD(第 3、4道)肌肉。也显示了作为阴性对照的人正常肌肉提取物(第5道)。 为了样品标准化，显示了GAPDH。(i)使用一系列CD抗体(CD34、CD133、 CD44、CD146、CD31、CD13、CD49b、CD45)的人周成血管细胞的FACS 分析。(j)显示了DMD(第1、2道)、正常(第3、4道)周成血管细胞 多克隆群之间显著地差异表达的基因的微阵列分析。第5和6道显示 了来自第3道所示的多克隆群的两个单独克隆的差异表达基因谱。(a， b，c，d，e和f)棒＝20μm。(K)：碱性磷酸酶(AP)染色揭示100％的 细胞群表达水平有变化。插图显示了刚从移植物(如图1A所示)取出的 浮动细胞，所有这些细胞也表达AP。L：肌肉部分中AP的表达，在小 动脉中显示出活性(白色箭号)，但是在小静脉中不显示活性(黑色箭 号)。M：分离自正常成人骨骼肌的细胞中AP+(蓝色实心柱)和AP-(红 色实心柱)的分布。以前所挑选细胞的AP+(蓝色阴影柱)和AP-(红色 阴影柱)的克隆率。

图5：流式细胞术分析的表面标记表达。分析正常人周成血管细 胞中CD117、CD44、CD106、CD13或CD62L的存在。

图6：Duchenne(DMD3和DMDA)和正常(MIX40Y和MIX78Y)人周成 血管细胞两个群中，以及来自MIX78Y的两个克隆分离物(CL9和CLB) 中基因差异表达谱。仅显示了所有Duchenne和正常细胞当中表达变化 至少3倍的基因。

图7：人周成血管细胞和卫星细胞衍生的生肌前体的培养物的生 肌分化时程。从人骨骼肌消化细胞和FACS分类为(a)CD56+、卫星细 胞和ALP+、周成血管细胞，其在促生肌条件下分开培养。b和b′中分 别显示了在培养第1天，两个细胞类型的相差显微镜形态。培养物被 固定并每天用抗Pax7、Myf5、MyoD、肌细胞生成蛋白和肌球蛋白重链 (MyHC)的抗体染色：d中显示了周成血管细胞的实例和f显示了卫星 细胞的实例。棒＝20μm。计数20个随即选定区域内的阳性细胞并计 算为通过DAPI可见的总核百分比。显示了周成血管细胞(c)和卫星细 胞(e)中这些不同的蛋白的表达时程。

图8：人营养不良肌肉中周成血管细胞的组织分布和分化。A：体 内周成血管细胞回复。注射到2月龄雌性mdx/SCID小鼠右侧股动脉(治 疗的肌肉)的5x10⁵个雄性小鼠(黑柱)或人(灰色柱)周成血管细胞。6 小时后收集不同器官并用实时PCR针对Y染色体计算迁移细胞百分比。 显示了一式三份进行的三个独立实验的平均值。B：两个人细胞核的高 倍放大(核纤层蛋白A/C阳性：绿色)，位于肌纤维基底层下面，被抗 层粘连蛋白抗体染色(红色)。核被DAPI染色。C：相似区域的低倍放大， 显示肌纤维间隙和内部中的很多人细胞核(核纤层蛋白A/C阳性：绿 色)，被抗层粘连蛋白抗体染色(红色)。D、E：mdx/SCID小鼠的免疫 荧光分析，在移植5x10⁵个人正常周成血管细胞后1个月，并用抗 层粘连蛋白(绿色)和抗人肌养蛋白(第3天，红色)的抗体染色。F、G： mdx/SCID小鼠的免疫荧光分析，在移植5x10⁵个人DMD周成血管细 胞后1个月(被用表达人小肌养蛋白的慢病毒载体体外转导)，并用抗 层粘连蛋白(绿色)和抗人肌养蛋白的抗体染色。H：用5 x 10⁵个人正 常(1-5道)和营养不良、校正(6-8道)周成血管细胞移植的不同小鼠 的肌肉中表达的人肌养蛋白的蛋白质印迹分析。正常(N)和DMD骨骼肌 (mdx)显示为对照。黑色箭号表示野生型肌养蛋白，红色箭号表示小的 肌养蛋白和蓝色箭号表示肌球蛋白重链，显示为加样对照。

图9：分离自不同心脏区域的移植物的成年小鼠心脏中成血管细 胞。分离自主动脉(A，A′)、心室(B，B′)、心房(C，C’)、游离壁(D，D’) 或间隔(E，E′)的正在生长的(A-E)或汇合(A’-E’)心肌克隆的相差显 微镜形态学。

图10：五个不同来源的小鼠心肌克隆在完全DMEM(含20％ FCS) 中的生长曲线。注意从主动脉、游离壁或心室获得的克隆具备比来自 心房或间隔的克隆具有更高的增殖率。

图11：PCR分析心脏祖细胞标记的表达。PCR分析从不同小鼠心 肌克隆细胞提取的RNA中心肌标记基因的存在：is1-1、nkx 2.5、 GATA-4/6、MEF2a和Tbx2/5。注意克隆之间nkx2.5不同的表达模式。

图12：与大鼠心肌细胞共培养的小鼠心脏中成血管细胞克隆的分 化。表达GFP的主动脉心肌克隆细胞与大鼠心肌细胞共培养五天，然 后分析肌球蛋白、MYHC(红色)的表达。细胞核被Hoechst染色。

图13：小鼠心脏中成血管细胞克隆的自发分化。表达GFP的主动 脉或游离壁小鼠心肌克隆细胞在低血清DMEM中分化五天，然后分析肌 球蛋白、MHC(红色)的存在。细胞核被Hoechst染色。

图14：小鼠心室心脏中成血管细胞克隆细胞的电生理学研究。A. 进行膜片钳测定时，小鼠搏动心室心肌克隆的图像。B.心室心肌克隆 的细胞电容(134.5+-6.8pF)。C.在电流钳模式中，生理学温度下在 1Hz作者记录的动作电位。心室心肌克隆的代表性动作电位波形。

图15：解剖移植物后正在生长的人心脏中成血管细胞。(A，B)分 离自人心脏的生长细胞的相差显微镜形态学。(C)人心脏中成血管细胞 在不同培养基中的生长曲线，V5\D：生长在DMEM中的心室活组织检查 的细胞(患者n°5)；V5\D+CM：来自相同汇合细胞的生长在补充有条 件培养基的DMEM中的相同细胞。

图16：来自2个不同患者的人心脏中成血管细胞分化为心肌细胞 和表达心肌肌动蛋白。

骨骼肌周成血管细胞(skeletal muscle periangioblasts)

方法

周成血管细胞的分离和培养

从十名经历诊断性活组织检查并随后归类为非营养不良(且未罹 患继发性肌病)的患者和六名DMD患者制备细胞，年龄范围从15至78 岁(非DMD)和3至8岁(DMD)。来自肱二头肌针吸活组织检查的肌肉样 品(100-200mg)保存在无FCS，含抗生素的DMEM中，并在解剖前4℃保 存最多24小时。在含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS(来自Sigma)中漂洗肌肉样品并 用解剖刀锐利解剖为1-2mm直径的碎片。含小血管的间质组织碎片转 移到包被I型胶原(0.1M乙酸中含1mg/ml)的培养皿上。无需清理包 绕的间充质和肌纤维碎片的血管。培养基由补充有5％ FCS、5ng/ml bFGF(Peprotec 100-18B)、2mM谷氨酰胺、0.1mMβ巯基乙醇、1％ 非必需氨基酸、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素的MegaCellDMEM(Sigma，M3942)组成。组织碎片培养7-8天。成纤维细胞样细胞 开始长出后，出现小的圆形可折射细胞。由于它们的贴壁性差(许多这 些细胞是浮动的)，因此通过温和地吸取原始培养物可容易地收集这些 细胞群并以5x10⁴个细胞/30mm皿的密度将细胞铺在胶原包被的皿上。 细胞以多克隆群生长或通过有限稀释克隆在包被I型胶原(Sigma C9791)的皿上。

可供选择地，可以用培养基(GIBCO，12440-053)替代 DMEM。α-MEM、DMEM、RPMI、F12不能支持周成血管细胞增 殖。

核型分析

分析前72小时，用Karyomax试剂盒(Invitrogen)根据厂家说明 书处理所铺1/3汇合的人perioangioblasts。对于每一核型分析，检 验5个不同的分裂中期涂布块。

端粒酶活性和端粒长度分析

使用如前描述(29)的TRAP试验测定端粒酶活性。从群体倍增时间 不同的人perioangioblasts细胞样品提取DNA后，通过如其他地方详 述(30)的用限制性内切酶AluI、CfoI、HaeIII、HinfI、MspI和RsaI 消化和在0.7％琼脂糖凝胶上电泳来测定端粒长度。凝胶变性、干燥和 中和，使用[-32P]ATP末端标记的端粒探针原位检测信号。与放射性 标记探针杂交后，用程序Telorun，其中使用用来相对于消化产物大 小而使信号强度标准化的均数算法来分析信号。

肿瘤发生能力

为测试可能的肿瘤形成，10只裸鼠(来自Charles River)和10 只SCID小鼠(来自Charles River)皮下注射10⁷个正常人周成血管细 胞。相同数量的小鼠类似地注射10⁷个早先用表达人小肌养蛋白的慢 病毒载体转导的DMD人周成血管细胞。12个月后，杀死小鼠并分析肉 眼可检测的肿瘤的存在。在任何注射动物中都没有检测到肿瘤。

用慢病毒载体转导细胞

如前描述(8)用表达细胞核LacZ或GFP或人小肌养蛋白的第三代 慢病毒载体转导细胞(31)。

分化试验

分别用TGF β1和BMP2处理，诱导分化为平滑肌细胞和成骨细胞， 如前所述(9)。通过将人周成血管细胞与C2C12小鼠成肌细胞共培养诱 导分化为骨骼肌细胞。人周成血管细胞以1：5比例添加并将培养物转 移至分化培养基(补充2％马血清的DMEM)。5天后，固定培养物并用抗 横纹肌球蛋白(MF20)和人lamin A/C的抗体染色。DAPI证实人细胞核 的身份。用肌球蛋白阳性细胞内人细胞核的数量除以人细胞核总数的 百分比来计算生肌分化百分比。使用分别针对MyoD和Nkx2.5的人特 异性寡核苷酸，以RT-PCR证实生物化学分化。

将细胞铺在包被基质胶的培养皿上在分化培养基中诱导人周成血 管细胞的自发骨胳生肌分化。7天后，固定培养物并用抗横纹肌球蛋 白(MF20)和Myf5的抗体染色。使用相同抗体实行蛋白质印迹分析。如 (32)描述培养用作阳性对照的人卫星细胞。

免疫印迹

如(8)描述进行蛋白质印迹分析。简言之，1.5×10⁶个细胞在 Laemli缓冲液(Tris/Hcl pH 6，8，甘油10％，SDS 2％)中90℃裂解5 分钟。用裂解缓冲液(50mM Tris/HCl，pH7.4，1mM EDTA，1mM EGTA 1％ Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))使来自对照SCID或 SCID/mdx小鼠和来自肌肉移植周成血管细胞的SCID/mdx小鼠的组织 样品均质化，并以1000r pm 4℃离心10分钟以丢弃核和细胞碎片。 用SDS PAGE分离上清。对于蛋白质印迹分析，蛋白转移至Immobilon (Amersham)膜，用含5％奶、0.2％ TritonX-100(Sigma)的PBS(封闭 液)饱和并与适当稀释度的各种抗体在4℃反应过夜。过滤器用PBS 0，2％ TritonX-100溶液洗涤3次(每次15分钟，室温)，然后与用辣 根过氧化物酶(HRP)IgG(Biorad)偶联的抗小鼠二抗以1：10000稀释 度在室温反应1小时，洗涤三次，最后用ECL免疫印迹检测系统 (Amersham)显象。

免疫荧光

人周成血管细胞在包被基质胶的盖玻片上生长，用PBS洗涤并用 4％多聚甲醛固定10分钟。来自对照SCID/mdx或移植周成血管细胞的 mdx/SCID小鼠的肌肉样品冰冻于液氮冷却的异戊烷中并用Leyca低温 恒温器切成一系列8μm厚的切片。细胞用含0.2％ Triton X-100、1％ BSA 的PBS室温下渗透30分钟，同时在无洗涤剂时孵育组织切片。细胞和 组织切片与10％驴血清在室温孵育30分钟，并与适当稀释度的一抗4 ℃孵育过夜。孵育后，样品用渗透缓冲液洗涤两次，然后与适当的偶 联FITC或TRTC的抗小鼠或抗兔IgG和Hoechst室温孵育45分钟。最 后洗涤三次后，使用含mowiol的PBS将盖玻片固定在载玻片上并在荧 光显微镜(Nikon)下分析。用X-Ga1如(8)描述对其他组织切片或细胞 进行染色。

抗体

本研究中使用下列抗体：抗肌养蛋白单克隆抗体Dys1、Dys2和 Dys3(Novocastra，NCL-Dys1，Dys2和Dys3)，稀释度1：125；抗层 粘连蛋白单克隆或多克隆抗体(Sigma L8271和L9393)，稀释度1：100； MF20抗体，稀释度1：5，抗平滑肌α肌动蛋白，稀释度1：300和抗肌 间线蛋白，1：50，来自Sigma，抗Myf5 1：200(来自Santa Cruz SC302)， 来自杂交瘤库的Pax7，稀释度1：3，人lam A/C(来自 Novocastra，NLC-lam/AC)NG2，1：250(来自William Stallcup的馈 赠)，抗PDGF受体β，1：500(来自Cell Signaling Technologies 56874)。对于FACS分析，使用下列抗体：CD44、CD34、CD45、CD49b、 CD117、CD62L(来自BD Biosciences(553133、555821、555483、555498、 555714、555544))、CD31、CD13、CD106(来自ID labs inc)、Cd146(来 自Biocytes(IDAC1400、IDAC1071、IDAC1272))。

周成血管细胞的动脉内递送

给mdx/SCID营养不良小鼠(来自Charles River)注射大约5×10⁵个人周成血管细胞。用含氯胺酮(5mg/ml)和甲苯噻嗪(1mg/ml)的生 理盐水(10ml/kg)腹膜内注射麻醉小鼠，在腿内侧进行有限切割。通 过插入股动脉的直径0.20-mm的针注射细胞。针通过肝素化Tygon管 (Ika Labortechnik)与蠕动泵连接。这个Tygon管与含1.6x10⁶个细 胞200μl的无菌Eppendorf管通连。在10s时间内通过层流(5μl/s) 递送细胞。在这个步骤前或过程中血流不停。在操作过程中或之后没 有对血管壁的可见损伤。用缝线缝合体壁肌肉，手术钉缝合皮肤。在 注射后不同时间杀死动物。通常，以30天间隔进行三次连续注射。

基因表达谱和数据分析

使用RNeasy RNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)按照厂商 推荐从人周成血管细胞细胞群分离总细胞RNA。使用可处理RNA芯片 (Agilent RNA 6000 Nano LabChip kit)，Agilent 2100生物分析仪 测定RNA样品的浓度和纯度/完整性。根据Affymetrix提供的标准方 案进行cDNA合成，生物素标记的靶标合成，HG-U133 puls 2.0 GeneChip (Affymetrix，Santa Clara，CA)阵列杂交、染色和扫描。通过 Affymetrix GeneChip Operative软件(GCOS)1.2绝对分析算法测定 转录mRNA(信号)的量，如(33)已描述。使用整体计数选项(global scaling option)测定GCOS绝对分析中的基因的所有表达量。可选择 地，使用Robust多阵列平均(RMA)程序(34)将探针水平数据转换成表 达量。对完美匹配(PM)值进行背景校正，使用变量组标准化以及进行 log转换。使用log2转换程序将RMA产生的数据上载到GeneSpring^TM软件版本7.2。将样品中所有10以上的信号的第百分之50位的每个 信号除以所有样品中其值的中位数来完成“每个芯片”和“每个基因” 的标准化。GeneSpring^TM中低水平过滤器过滤掉低于10％样品中称作 “出现”的或其标准化表达水平在全部样品中总是在0.5至2之间的 所有那些探针组。对于监控分析，施行初始过滤程序以便使用GCOS 比较算法(33)选择在实行的至少90％的成对比较中显示出被称作“I” 或“D”改变的转录物。然后，使用带有成组配对误码率的Bonferroni 校正的ANOVA检验(t检验，置信水平0.005)，和使用Bioconductor SAM 程序包中施行的微阵列(SAM)分析的显著性分析实行监控分析。 GeneSpring高级筛选选项与不同分析产生的基因列表联合使用。在 GeneSpring^TM中使用皮尔逊相关系数和作为距离的平均连锁和连锁方 法进行分级聚类。

结果

来自原代骨骼肌活组织检查的细胞的分离和体外扩充

为了诊断，在知情同意之后，从经受活组织检查的患者获得骨骼 肌活组织检查碎片，和随后诊断为正常或患假肥大型肌营养不良。在 解剖显微镜下，剖出血管和围绕间质组织的碎片并铺在胶原包被的皿 上，如前对于小鼠中成血管细胞所述(8，9)。成纤维细胞样细胞开始长 出后，与基层粘附性差的小的圆形和可折射细胞显现(图1A)，由此通 过温和地吸取进行收集。浮动细胞以多克隆群体进行生长。各种尝试 后，设计最佳培养基支持长出的人周成血管细胞的增殖。培养基包括 补充胎牛血清和bFGF的基础培养基(图2和3)。在这些条 件下，大多数细胞群获得三角形可折射形态(图1B)并以大约36小时 的倍增时间维持大约20代的高增殖率(图1D)。对于正常细胞，增殖 率基本上与供体年龄(范围20至78岁)无关。在来源于儿童(范围3 至8岁)的DMD患者的细胞中，增殖率类似于正常细胞(图1D)。这个 增殖率致使最终数量为大约10⁹个细胞，从5-10.000个细胞长出开始。 这个数量的细胞将适于动脉内递送给年轻患者，基于与递送给营养不 良小鼠的小鼠细胞可比较的每公斤数量(8)。传代20代之后(大约25 PD)，大扁平细胞出现频率渐增。这些细胞不再分裂，并且再经少数传 代后，整个群体经历衰老。在传代早期和晚期，正常人周成血管细胞 维持二倍体核型(图1C)。当检测端粒酶活性时，在早期(VIII°)传 代时人正常周成血管细胞显示出显著的TRAP活性，在H1299参照癌细 胞中发现大约5-10％(图1E)。然而，在较后期的传代中，不再检测到 活性，因此解释了增殖性衰老的发生。与此一致，端粒长度逐渐缩短 并在到了IX°代时已经达到衰老前细胞的典型大小(图1F)。对于分离 自DMD患者的周成血管细胞同样如此。为检测肿瘤发生能力，10⁷个人 周成血管细胞皮下注射给裸小鼠和SCID小鼠。20只被注射小鼠(每组 10只)维持到注射后12个月，且它们中没有一个发展出尸体解剖时肉 眼可检测到的任何可见肿瘤。人DMD周成血管细胞显示出相同的形态 和培养特性(核型、肿瘤发生)，但它们显示出更高的增殖率(图1D)， 可能与供体年龄有关。

人周成血管细胞的表型

对Affimetrix芯片上源自正常个体的周成血管细胞的两个群体 (和来自这些之一的两个克隆)和来自Duchenne患者的两个群体的基 因组广泛分析揭示正常和DMD细胞表达周细胞标记(10)如下：

-以高水平：膜联蛋白V、碱性磷酸酶、肌间线蛋白、平滑肌α 肌动蛋白、波形蛋白，

-以中等水平：PDGF受体β、血管生成素和NG2蛋白聚糖。

相比之下，它们不表达生肌因子，Pax3、Pax7、MEF2C和MEF2D(尽 管它们以低水平表达MEF2A和B)、细胞角蛋白或神经丝(除了巢蛋白 之外)。培养细胞的免疫细胞化学和蛋白质印迹分析证实了这些结果。 差不多就像它们的小鼠对应物一样，正常和DMD群体大约10％表达平 滑肌α肌动蛋白(SMA)和肌间线蛋白，可能揭示向平滑肌自发分化(图 4a，b)。克隆也以相同百分比表达这些标记，其不随逐次传代而变化。 这提示平滑肌细胞在培养时连续产生，但是因为增殖率较慢，因此它 们保持占总细胞群的一小部分。正常和DMD人周成血管细胞也在其表 面低水平表达PDGF受体β(少数明显阳性和一些是阴性，图4c)。图 4d和e也显示了表面上表达受体(绿色)和平滑肌α肌动蛋白(红色)的 细胞的高倍放大图。人周成血管细胞的两个正常和两个DMD群的提取 物的Western印迹分析(图4h)揭示NG2蛋白聚糖和PDGF受体β都表 达。相同群体不表达MyoD，Myf5、肌细胞生成蛋白或Pax7，因而明显 不同于卫星细胞(图4g和图7)。此外，两个正常和DMD人周成血管细 胞表达碱性磷酸酶(AP)，如针对正常人周成血管细胞的图4K所示。值 得注意的是，从原代移植物长出的小的圆形细胞也表达AP(图4K插 图)。因为在成人骨骼肌中，仅周细胞是AP阳性，这个观察结果强烈 提示人周成血管细胞包括在周细胞群内。AP区分成人与胎儿小鼠中成 血管细胞(未发表观察结果)。为测试周成血管细胞是否来源于AP阳 性群体，用0.1％胶原酶(来自Sigma C9263)37℃酶促消化活组织检查 人正常骨骼肌30分钟，消化至单个细胞群，然后用激发荧光细胞分析 器分为AP阳性和AP阴性部分。然后克隆两个群体，2周后评价周成 血管细胞克隆的数量。这个实验结果表明尽管AP⁺细胞代表总单核细胞 群的大约10％，但是它们产生了比AP^-部分多10倍的克隆，表明在AP⁺部分中有大约100倍的产克隆细胞富集(图4M)。人正常和DMD周成 血管细胞的特征也在于表面抗原的表达。细胞一致地显示CD31、CD34、 CD45、CD62L、CD106、CD117、CD133阴性；它们针对CD146和CD49b 呈阳性，和针对CD13和CD44呈强阳性(图4I和图5)。所有这些结果 与来自微阵列分析的数据一致。一致表达这些标记的一致性揭示培养 条件选择了均质群体，至少是表达上述抗原的均质群体。人和小鼠周 成血管细胞之间唯一的显著性差异看来是CD34的表达，其在所有小鼠 周成血管细胞中存在，而在相应人细胞中缺乏。

来自DMD患者的周成血管细胞难以通过如上所述参数与野生型细 胞区分，除了增殖率(参见上面)。在Affimetrix芯片上进行的来自 DMD(图4j的1、2道)和正常(3-6道)肌肉的人中成血管细胞的分子表 型看来显著相似，仅少数基因差异表达：这些基因原来主要地是在DMD 细胞中似乎被上调的炎性基因，提示甚至在10PD之后，培养中的细 胞保留接触炎性细胞和分子的记忆；另一方面，少数基因如EphrinB2、 Wnt诱导蛋白1和α原肌球蛋白更多在正常细胞中表达，但是这个显 著性不清楚(图4j和图6)。这些基因主要地是在DMD周成血管细胞中 被上调的炎性基因，提示培养中的细胞保留接触炎性细胞和分子的记 忆；另一方面，极个别基因例如Ephrin B2、Wnt-诱导蛋白1和α原 肌球蛋白更多在正常细胞中表达，但是其意义还不不清楚。值得注意 的是两个周成血管细胞多克隆群体(图4j第3，4道)和来自它们之一 的两个克隆(图4j第5，6道)都表达相似的谱，进一步表明用移植物培 养方法选择的细胞群的均一性。

人周成血管细胞的分化潜能

为完成正常和DMD人周成血管细胞的体外表征，测试它们经历最 终分化为不同中胚层细胞类型的能力。差不多就像它们的小鼠对应物 那样，当用转化生长因于β(TGFβ)、胰岛素-地塞米松或骨形态发生 蛋白2(BMP2)处理时，人周成血管细胞容易地分化为平滑肌、成骨细 胞或脂肪细胞。

人周成血管细胞的体内研究

然后作者检测了mdx免疫缺陷小鼠中的人周成血管细胞的生肌潜 能。为这个目的，作者首先评价了人周成血管细胞注射到股动脉时恢 复为下游的骨骼肌的能力。为获得定量测定，用表达GFP的慢病毒转 导人和鼠periangiobalsts(两个群超过90％被载体转导)，然后注射 入不排斥人细胞的mdx/SCID营养不良小鼠股动脉，如Galvez等2006 年对于小鼠细胞详述。6小时后，杀死小鼠和解剖来自被注射和对侧 腿以及过滤器官如肝和脾的各种肌肉。GFP的定量PCR允许精确分析， 揭示大约10％被注射细胞恢复为下游的肌肉，小于1％恢复为对侧肌肉， 剩余细胞主要位于过滤器官(图8A)。该图表明人细胞在恢复为骨骼肌 方面比它们的小鼠对应物稍微更有效，即使差异统计上无显著意义。

作者接下来通过免疫荧光评价了人移植细胞的分布和随后人肌 养蛋白的出现。注射后，在基底层下面鉴定到人细胞核(箭号)(通过 抗人核纤层蛋白A/C抗体)表明至少一部分被注射细胞位于肌纤维内， 如图8B的肌细胞核或卫星细胞(箭号)。定位于肌纤维之间和有时在肌 纤维内部，由此表达人肌养蛋白的一组人细胞也可以在低放大率时见 到，如用抗人特异性抗体Dys3染色揭示(图8C)。连续注射三次人细 胞后，大面积注射肌肉被用表达人肌养蛋白的纤维重构(图8D，E)。当 被表达人小肌养蛋白的慢病毒载体体外转导的营养不良人周成血管细 胞注射给mdx/SCID小鼠的骨骼肌时，结果类似于正常周成血管细胞观 察到的结果(图8F，G)。蛋白质印迹分析移植肌肉中表达的人肌养蛋白 的量(图8H)并揭示了野生型和小肌养蛋白的明显蓄积，尽管不同移植 动物中有所不同。

讨论

人周成血管细胞的分离和表征

本发明中报道的数据表明有可能从健康受试者和营养不良患者的 骨骼肌活组织检查分离周成血管细胞。该细胞可以在体外扩充大约20 代(大致40倍群体倍增时间)，用病毒载体转导，然后诱导分化为骨骼 肌。当移植入营养不良无免疫活性的小鼠时，这种周成血管细胞产生 表达人肌养蛋白的大量新纤维。因此这个人细胞群满足肌肉营养障碍 的成功细胞疗法规程所需的所有标准。

此外，作者在本发明中表明周成血管细胞表达碱性磷酸酶和很多 周细胞标记，和的确来源于体内也表达AP的细胞，即周细胞(11)。因 此结论是人和小鼠周成血管细胞包括在周细胞群内并在体内占据外周 位置。它们不表达内皮标记，与从胚胎血管分离的瞬时表达Flk1、Tie2 和CD31的胚胎中成血管细胞相反。

正常和DMD周成血管细胞可以容易地从用于诊断的相同活组织 检查分离，不需要另外的外科手术。无论如何，针吸活组织检查是容 忍度好的手术，可以每隔几年重复进行。细胞来源是重要的，不仅仅 出于实施原因。有可能这些多潜能中胚层祖细胞接受一些类型的局部 定型，利于募集入它们归属的组织的细胞类型。事实上，在与小鼠成 肌细胞共培养后，并入杂合肌管的人周成血管细胞细胞核的百分比显 著高，在不同的实验中范围从30至60％。这显著高于用源自非肌肉来 源的其他类型干细胞所观察到的。

此外，本发明表明人正常和DMD周成血管细胞在适当的培养条件 下自发分化为骨胳肌管(达到群体的40％)。这和仅与成肌细胞共培养 而可被诱导分化的小鼠中成血管细胞存在显著的差异(8，9)。这个特 征可以引起惊人的治疗改善，增加肌肉营养不良患者中大块肌肉重建 的效率。

与中胚层其他干细胞的比较

由于它们的起源，作者最初认为人周成血管细胞可以代表也来源 于骨髓周细胞的间质干细胞(MSC)不同亚型的可能性(13)。然而，人周 成血管细胞与间质干细胞的详细比较表明两个细胞群在很多数量的基 因的表达方面明显存在差异。更重要的是，人中成血管细胞在用于MSC 的培养基α-MEM中不生长，由此证实这些群体的确是显著不同的。

近几年来已经从小鼠和人组织分离了很多不同类型的中胚层干细 胞并表征到不同的程度。这些包括内皮祖细胞(EPC，14)、多潜能成人 祖细胞(MAPC，15)、肌肉衍生干细胞(MDCS，16)、侧群细胞(SP， 17-19)、中成血管细胞(9)、来自肌肉内皮的干/祖细胞(20)、sinovia (21)真皮(22)和脂肪组织(23)。不同的实验步骤、不同的来源和部分 特征仍然妨碍完全了解这些细胞的异质性；对它们的起源和可能的谱 系关系了解得就更少了。已经表明许多这些细胞，例如MDSC或MAPC， 体外分化为骨骼肌，和对于MDSC，移植后还分化为营养不良肌肉。然 而，尚未分离到人MDSC。这些细胞中的一些在体外广泛生长，但是其 他的细胞例如EPC和SP却不然；另一方面EPC和SP可以在血液中递 送，而对于大多数其他细胞类型来说，尚未测试全身递送。当前，本 发明的人周成血管细胞是全部所需标准已经被确认的唯一细胞类型， 尽管其他中胚层细胞类型也可能显示出相似的特征。例如，最近表明 分离自脂肪组织的细胞可以在体外广泛生长，分化为几个组织包括骨 骼肌，而且当注射给mdx小鼠时，产生表达人肌养蛋白的纤维，甚至 在缺乏免疫抑制时(23)。这种令人惊讶的结果有待证实，因为干细胞 可以逃避免疫系统(24)，但是它们形成的纤维表达高水平的I型HLA 抗原(25)。此外，没有报道过所产生肌养蛋白量的生化分析，使得难 以与本发明直接比较。最后，据报道通常分化为骨骼肌效率低的MSC 在体外产生很多纤维，和当用Notch细胞内活性结构域转导和暴露于 某些细胞因子时，在mdx肌肉中也产生许多纤维(26)。这个似非而是 的结果错综复杂并有待于分子解释。事实上已知Notch是具有转化能 力(28)的肌生成抑制剂(27)。

周成血管细胞临床试验的展望

在临床规程中，全身递送看来是根本的选择，因为肌内递送将需 要无数次注射。人和小鼠周成血管细胞表达白细胞通常粘附和穿过内 皮的一些蛋白(例如血管细胞黏附分子(VCAM-1)、诱导型细胞黏附分子 (ICAM-1/5/2)、白细胞选择蛋白(L-选择蛋白)、CD36、CD44、b7、b5、 b1、b2整联蛋白、整联蛋白(a1、a5和a6)、白细胞因子抗原(LFA-1)、 白介素-1受体IL-1R、基质衍生因子受体(SDF-R)和钙粘连素)，因此 当动脉内递送时可以扩散入骨骼肌间隙。这显著优于不能如此的居留 的卫星细胞；其他中胚层干/祖细胞可能会显示相同的能力，但是到目 前为止尚未测试。此外，作者最近表明预先接触Sdf-1???(基质细胞衍 生因子-1)或TNF-α，α-4整联蛋白或L-选择蛋白在小鼠周成血管细 胞中的瞬时表达使它们回复为骨骼肌增加四至五倍(42)，这是一种可 以进一步增加供体细胞定殖患者肌肉的简单方法。导管介导递送至 succlavia，隔动脉或髂动脉应该允许周成血管细胞到达并植于对于运 动或呼吸必不可少的肌肉。

细胞疗法规程的另外的考虑是体外广泛扩充可能危害分化和/或 自我更新能力，甚至产生恶性转化的风险。本发明证明了人周成血管 细胞可以广泛生长，但是不限定在体外。重要的是，人营养不良周成 血管细胞显示出与它们正常对应物相同的增殖能力，提示该疾病并未 耗尽它们的生长潜能，至少在年轻时。正常和营养不良周成血管细胞 都维持着二倍体核型，在免疫缺陷小鼠中不具有致瘤性和在体外传代 大约20代后经历衰老。人们认为周成血管细胞主要产生末期分化、有 丝分裂后和持久的肌纤维。应该如此，新一批细胞可以容易地由第二 次针吸活组织检查得到。最后，两个规程显现作为营养障碍细胞疗法 的可供选择方案：a)体外基因校正后的自体营养不良细胞或b)免疫抑 制存在下的正常供体细胞。在肌营养不良的情况下，自体细胞的基因 校正面临的问题代表是肌养蛋白的尺寸庞大；作者这里表明慢病毒载 体表达的人小肌养蛋白高效修复肌养蛋白合成，即使慢病毒载体未被 批准用于患者，和修饰的肌养蛋白的作用效力有待在大肌纤维的环境 中测试。

供体细胞移植将克服这些问题，但是面临终身需要免疫抑制，其 也可能在年轻时就开始。

总之作者表明人周成血管细胞是肌营养不良细胞疗法的理想细胞 群。事实上，金毛猎犬肌营养不良的实验表明营养不良狗的功能改善 是可能的(43)，并暗示本发明细胞的治疗应用。

心脏中成血管细胞

方法

小鼠和人心脏中成血管细胞的分离和培养

从4周龄HomoGFP小鼠(来自Charles River)分离的心脏保存在 无FCS、含抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM(Sigma，D5671)中，细分 成五个不同的区域：主动脉、心室、心房、游离壁和间隔。每一部件 在含Ca/Mg的PBS中漂洗，并用解剖刀锐利地解剖为直径1-2mm的小 片。含小血管的碎片转入包被1％明胶(Sigma G9382)的培养皿，在如 前对小鼠中成血管细胞所述的20％ FBS-DMEM加5mM谷氨酰胺和抗生素 (8，9)的存在下。这些心脏碎片根据区域培养8-15天，在成纤维细胞 样细胞开始长出后，出现小的圆形和可折射细胞。通过温和地吸取原 始培养物容易地收集这些细胞群，计数和通过有限稀释克隆在包被1％ 明胶的96多孔板上。通过相差显微镜形态学选择不同的克隆，扩充， 然后通过表面标记表达而表征。

人心脏中成血管细胞分离自进行心房瓣膜机能失调手术患者的活 组织检查，基本上如上对小鼠心肌meosangioblasts所述。

小鼠心脏中成血管细胞分化试验

通过将成年小鼠心脏中成血管细胞克隆与大鼠新生心肌细胞共培 养诱导分化为心肌细胞。以1：5比例添加心脏中成血管细胞并将培养 物转入分化培养基(补充2％马血清的DMEM)。5天后，固定培养物并用 抗肌球蛋白(MF20)的抗体染色。Hoechst染色证实细胞核的身份。通 过计算肌球蛋白染色(红色)阳性的绿色GFP-心脏中成血管细胞数量 来计算心肌分化百分比。使用对于Nkx2.5、GATA4/6、is1-1、mef2a 和Tbx2/6小鼠特异性的寡核苷酸，用从不同的心脏中成血管细胞克隆 提取的RNA，通过RT-PCR证实生物化学分化。

人心脏中成血管细胞分化试验

通过细胞暴露于5μM5-氮胞苷或小鼠或人心脏中成血管细胞与新 生心肌细胞共培养诱导分化为心肌细胞。为了群间区分，使用小鼠或 大鼠新生心肌细胞。

小鼠心肌细胞电生理

在35℃进行小鼠心脏中成血管细胞的电生理学研究。使用膜片钳 技术的全细胞模式记录膜电流并且也测定电容(Hamill OP et al.， 1981)。由Clampfit 8.1和Origin7.0版本得到数据分析和图。

心肌细胞增殖分析

小鼠心脏中成血管细胞以5×10³个细胞/cm²的密度铺在不同的培 养基上并平均每三天传代。每次传代，用血细胞计数器一式三份计算 细胞数量。对于心肌克隆的生长曲线，细胞最初以1×10⁴个细胞/cm²铺在完全DMEM中并每五天传代。每次传代，用血细胞计数器一式三份 计算细胞数量。

结果

小鼠心脏中成血管细胞

小鼠心脏中成血管细胞的分离和体外扩充

如上所述收集成年心脏、解剖并铺板。成纤维细胞样细胞开始长 出后，出现小的圆形和可折射细胞。这些细胞与基层粘附性差，因此 通过温和地吸取进行收集。通过最后稀释将浮动细胞克隆在包被1％明 胶的板上(无滋养层)。这种情况下使用的生长和克隆培养基是含20％ 血清的完全DMEM。在这些条件下，一些克隆在亚汇合条件下产生三角 形、可折射形态(图9A-E)或在汇合条件下产生鹅卵石图案(图9A’ -E’)，维持传代大约25代的培养基增殖率，倍增时间大约72小时(图 10)。增殖率随克隆的解剖来源而变化：主动脉、心室和游离壁衍生的 克隆比来源于心房或间隔的克隆生长得快(图10)。在主动脉克隆的最 好的情况下这个增殖率从10.000个细胞长出开始，产生大约1×10⁹个细胞的最终数量。传代25代之后，大扁平细胞出现频率渐增。这些 细胞不再分裂，和再经少数传代后，整个群体经历衰老。用流式细胞 术和PCR基因表达进一步表征成年小鼠心肌克隆(表I和II和图11)， 和通过免疫染色(图12、13和表III)和电生理学(图14)分析它们分化 为心肌细胞的能力。

小鼠心脏中成血管细胞表面标记和基因表达的表征

流式细胞术分析来自不同心脏区域的成年心肌克隆在细胞表面干 细胞标记的表达。所有克隆是CD34、CD31、Sca-1、c-kit和CD44阳 性和CD45阴性(表I)。

表I：小鼠心脏中成血管细胞的表面标记

 

CD45CD34CD44CD31Sca-1c-kit主动脉E8-+++++心室J2-+++++

此外，从正在生长(ND，未分化)或分化5天后(DIF，分化的，表 II)的不同小鼠成年心肌克隆细胞提取RNA。进行RT-PCR分析前面其 他组中所述的涉及心脏发育或分化的不同基因的表达(表II和图11)。

表II：小鼠心脏中成血管细胞的心脏基因

 

主动脉 ND主动脉 DIF心室 ND心室 DIFIs1-1++++Nkx2.5++++Gata4++++Gata6++++Mef2aMef2c++Tbx2++++Tbx5++++Tbx6++

图11表明心脏特殊转录因子例如MEF2和Tbx5表达彼此不同的克 隆。

小鼠心脏中成血管细胞的分化潜能

当小鼠心脏中成血管细胞用转化生长因于β(TGFβ)、胰岛素-地 塞米松或骨形态发生蛋白2(BMP2)处理时，其不能容易地分化为平滑 肌、成骨细胞或脂肪细胞。相比之下，当这些成年心肌克隆与大鼠新 生心肌细胞共培养诱导心肌分化时，更高数量的主动脉克隆细胞表达 肌节肌球蛋白，表明这些细胞具有经历心肌生成的有效能力(达到 90％，图12)。此外，出乎意料地，当主动脉或FW克隆细胞暴露于心 肌分化培养基(低血清)时，大约70-80％细胞自发分化为肌球蛋白阳性 心肌细胞(图13)。作者也观察到差异取决于心肌克隆分离的区域(表 III)。

表III：小鼠心脏中成血管细胞的分化

 

细胞克隆主动脉E8心室J2心房K1游离壁B8间隔G3自发心肌分化>90％>90％<1％<1％<1％共培养诱导的心 肌分化～90％ ～80％ ～70％ ～20％ ～10％

小鼠心肌mesangioblasts的功能研究

为估计小鼠成年心脏中成血管细胞的功能性，在生理学温度下 (35-37℃)对心室心肌克隆细胞进行电生理实验。图14A显示在进行测 定时，分离的心室心肌细胞搏动。这些细胞的电容可与从新鲜分离的 小鼠心肌细胞获得的电容相比(134.5+-6.8 pF，n＝12)，如图14B所 示。有趣的是，当记录这些细胞的动作电位时，波形图案类似于从新 鲜分离的左心室肌细胞得到的图案(图14C)。

因此，心室心肌表现节律性的收缩活动和适当的离子通道。它们 似乎以与心室心肌细胞相同的方式运转。

人心脏中成血管细胞

人心脏中成血管细胞的分离和表征

从人心室、心房、主动脉活组织检查按照方法中描述的规程分离 人心脏中成血管细胞。如图15(A，B)所示，这些细胞具有与小鼠心脏 中成血管细胞相似的形态学并能够在不同培养基存在下高速生长(图 15C)。

人心脏中成血管细胞表达CD31、CD44、CD34和CD117，但是不表 达CD45，也不表达CD133(表IV)。

表IV：人心脏中成血管细胞的表面标记

 

CD31CD34CD44CD45CD117CD133心室++++主动脉++++心房++++

作者也研究了这些细胞基因表达模式(表V)。

表V：人心脏中成血管细胞的心脏基因

 

Nkx2.5Is1-1Gata4Mef2ATbx2Tbx5心室+++++主动脉+++++心房+++++

人心脏中成血管细胞是nkx2.5、gata4、tbx2/5和mef2A阳性， 但是is11是阴性。

人心脏中成血管细胞的分化潜能

通过与大鼠新生心肌细胞共培养诱导心肌分化：分化和表达心脏 肌动蛋白的人细胞达到35％(表VI)。此外，这些细胞在5-氮胞苷(5μM) 存在下可以分化为心肌细胞(图16和表VI)。

表VI：人心脏中成血管细胞的分化率

 

％5-aza共培养自发心室5535无主动脉3519无心房2112无

讨论

小鼠心脏中成血管细胞

在本发明中，作者表明有可能从成年小鼠心脏的不同区域分离心 脏中成血管细胞样干细胞。以前Anversa或Chien已经报道了从成年 心脏获得干细胞的可能性，但是本工作的目标是获得来自不同心脏区 域的，具有不同分化和功能性的显著不同的心脏干细胞。作者从主动 脉、心室、心房、游离壁和间隔分离了心脏中成血管细胞，它们可以 生长达到25代并表达干细胞表面标记如Sca-1或c-kit和心脏基因如 nkx2.5或gata4。不同心脏干/祖细胞中标记表达的比较分析在下面表 VII中显示：

表VII

 

标记CPCACSC成心细胞小鼠心脏SchneiderAnversaChienCossuCD45----CD31 - -？ + CD34---+Sca-1++++c-kit-+++GATA4++++Nkx2.5 -+ ？ + NEF2C + + ？ - Is1-1 ？ ？ + +

此外，这些小鼠成年心脏中成血管细胞不仅能够在与心肌细胞共 培养时分化，而且在分化培养基(低血清)存在下也可以分化。它们可 以表达肌节肌球蛋白连同几个心脏标记，如上表(表I和II)所示。通 过电生理学方法，作者表明了这些成年心脏细胞具有电流的功能性通 道和类似于心室肌细胞的运转。由此作者具备了研究心脏分化机制和 心脏疾病的治疗性应用的有力的工具。

人心脏中成血管细胞

本发明证明了从来自成年人活组织检查的移植物分离人心脏干细 胞的可能性，不仅来自心房，而且来自心室或主动脉区域。细胞可以 在体外生长和扩充。当与大鼠新生心肌细胞共培养时，它们具备体外 分化为心肌细胞的能力。它们的电性能，以及它们在体内分化的能力 仍然未知。人心脏中成血管细胞，如上表(表IV和V)所示，表达心脏 定型所需的所有表面标记和心脏基因，类似于小鼠心脏中成血管细胞。 这使得它们适于治疗罹患心脏紊乱的人类患者。

对心脏中成血管细胞临床试验的展望

到目前为止，胚胎干细胞作为心脏细胞疗法工具的用途受到可能 的致瘤性和需要免疫抑制的限制，尽管这些细胞产生功能性心肌细胞 的效率很高(44-46)。成年心脏中高生肌潜能的心脏中成血管细胞的发 现打开了治疗人类患者的新的可能性。电子显微照片和组织学已经证 明这些细胞在心室壁的定殖和它们随后在体内分化为心肌细胞。这引 起显著但是不完全的机能恢复。有趣的是，心脏中成血管细胞不显现 出能够迁移到坏死区内部几个mm以上。冠状动脉结扎引起大的透壁梗 塞，且细胞不能治愈全部区域，除非新血管生成和/或坏死组织的除去 允许逐步迁移。在病变像肌肉营养障碍中，坏死区域散在于再生或表 面上健康的区域中，中成血管细胞移植引起高效率组织修复(43)。因 而不引起严重的心脏组织坏死的其他心脏疾病，如过度增大可能是用 心脏中成血管细胞进行细胞治疗的更好目标。

本发明的从成年小鼠心脏分离心脏中成血管细胞的方法已经用于 分离其在人类中的对应物，有利于可用于自体治疗的定型的人心脏祖 细胞的产生。

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