活性再生人工角膜移植物及其制备方法

摘要

本发明属于人工角膜制造的技术领域，具体提供了一种活性再生人工角膜移植物及其制备方法。本发明提供的人工角膜移植物包括5～30份壳聚糖，5～30份胶原，0.1～0.5份硫酸软骨素，5～10份聚乙二醇，5～25份聚乙烯醇和15～80份三蒸水。作为优选，还包括适量角膜细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白。其制备方法是先将壳聚糖、胶原和硫酸软骨分别溶于盐酸、醋酸和水，然后按比例将各组分在室温下搅拌混匀后注入模具中烘干，再用水浸泡清洗烘干后获得制品。本发明的产品生物相容性好、基质强度高、透明度好；提供的方法易操作，原材料易得不贵，能进行大规模产业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及人工角膜制造的技术领域，具体涉及一种活性再生人工角膜移植物及其制备方法。

背景技术

全球约有1000万角膜盲患者需要进行角膜移植，我国有约300万人。但是，我国每年能进行的同种异体角膜移植术仅约3000例。这主要是因为同种异体角膜为供体进行角膜移植价格较贵，难于获得供体。供体的短缺使得研制作为同种异体角膜替代品的人工角膜成为迫切需要解决的技术问题。

目前的人工角膜以非活性角膜为主，此类角膜一般由合成材料如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等制造，此类材料的植入虽可使人视力有所恢复，但视野范围极小，难以和眼周围组织相融合，植入后有异物感，容易出现角膜溶解、房水渗漏、脱出及眼内炎等并发症，影响角膜神经的长入，易于造成干眼症。

在人工角膜的改善方面，近年出现了组织工程角膜。这类角膜是在体外强化的条件下，在人工角膜材料上进行角膜细胞培养。在这方面，Griffith于1999年在美国专利U.S6,645,715中公开的“Artificial cornea”具有角膜的3种细胞，但为经过病毒转染的永生化细胞，不适合移植。其构建角膜模型是应用传统的角膜基质细胞与胶原I凝胶混合凝固后产生，具有收缩特性，机械强度不足。Dimitrijevich于1999年在美国专利U.S 6,471,958中公开的“Non-contracting tissue equivalent”也是角膜基质细胞与胶原I型凝胶混合凝固后构建角膜基质层，其后分别构建角膜上皮层和内皮层，虽然解决了传统的角膜基质细胞与胶原I型凝胶混合凝固后的收缩问题，但透明度不够。

多年来人们在异种异体的动物中寻找适宜植入人体的动物角膜，尝试从牛、猪、鸡、兔、鱼、猴等动物获取动物角膜，通过一系列生物化学处理脱去引起人体免疫排斥组织细胞和蛋白使之适与人体角膜移植。目前此方法存在的主要问题是动物角膜通过一系列生物化学处理后，质硬不透明，植入产生免疫排斥反应，引起角膜组织血管增生和眼内炎症，导致角膜移植失败。

发明内容

针对现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种生物相容性好、基质强度高、透明度好其易于制造的活性再生人工角膜移植物。

本发明的另一目的在于提供一种简单且易于工业化生产的上述角膜移植物的制备方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种活性再生人工角膜移植物，包括以下重量份的组分：

壳聚糖：                   5～30份；

胶原：                     5～30份；

硫酸软骨素：               0.1～0.5份；

聚乙二醇：                 5～10份；

聚乙烯醇：                 5～25份；

三蒸水：                   15～80份。

为使本发明具有更好的性能：

组份中还包括角膜细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白，它们在原料混合物中的最终质量浓度分别为：10ng/ml～120ng/ml、1ng/ml～100ng/ml和1ng/ml～100ng/ml；其中角膜细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)和表皮生长因子(EGF)或是它们当中两种或两种以上的混合物。

另外，上述组分中：聚乙二醇的分子量优选1000～50000；聚乙烯醇的分子量优选10000～100000。

本发明提供一种活性再生人工角膜移植物的制备方法，包括以下具体步骤：

(1)称取5～30份壳聚糖、5～30份胶原分别溶于pH<3的盐酸溶液或醋酸溶液，0.1～0.5份硫酸软骨素溶于三蒸水；

(2)再混入5～10份聚乙二醇，5～25份聚乙烯醇和15～80份三蒸水，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；

(3)将混合液注入模具中，烘干或置于冷冻干燥机冻干；

(4)用水浸泡清洗获得产品；

以上份数为重量份。

本方法步骤(2)中可添加角膜细胞生长因子、纤维连接蛋白和层粘连蛋白，它们的质量浓度分别为：10ng/ml～120ng/ml、1ng/ml～100ng/ml和1ng/ml～100ng/ml。

上述角膜细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β₁)和表皮生长因子(EGF)或是它们当中两种或两种以上的混合物；其用量优选10～100ng/ml。

上述步骤(2)中聚乙二醇的分子量为1000～50000，聚乙烯醇的分子量为10000～100000；

上述步骤(3)中冷冻干燥过程的程序降温范围是：0～-120度，降温程序0—-10—-20—-30—-40—-50—-60—-70—-80—-90—-100—-110—-120度。

上述任一种活性再生人工角膜移植物的制备方法，步骤(4)中的产品可进一步经激光打孔制成多孔结构。

上述激光打孔的孔径为1～300μm，孔型为线条沟槽、圆形、椭圆或梭形，孔距为100～1000μm。

本发明的作用原理为：

本发明的角膜移植物所包含的组分中，胶原是占人角膜干重的75％的成分，是人角膜细胞外基质的结构蛋白质，具有生物相容性好、生物降解性好、无抗原性、能促进角膜细胞生长等优点，但胶原在体内降解速度快、机械性能较差，使其作为角膜细胞支架的功能受到限制。

组分中的聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性的多羟基聚合物，具有良好的水溶性、无毒，最重要的是它具有与人体自然组织相近的含水量、弹性模量、低摩擦系数及较高的机械强度、丰富的孔洞网络结构、良好的生物相容性，PVA的性质随相对分子质量和醇解度的不同而变化，成膜性好，强度高，外观透明，在机体内不被胶原酶降解，可调节降解率。因此，通过改变PVA相对分子质量和醇解度调控其性能的变化。把聚乙烯醇与胶原复合，既可改善胶原的机械性能差的缺点，又可增强聚乙烯醇的细胞亲和性。

组分中的硫酸软骨素对角膜内皮细胞的粘附、生长增殖具有优良的作用，可调节细胞黏附，具有良好的细胞亲和性。它是构成角膜细胞外和细胞间基质的主要成分，具有粘弹性和大分子水合性，可促进和引导角膜细胞的生长繁殖，与胶原相结合形成的网状结构对角膜形态和正常生理状态的维持具有重要作用，通过与角膜内皮的结合，形成角膜组织表面的保护膜，控制体内自由基对角膜细胞造成的损伤。

在本发明优选的技术方案中，同时添加3种角膜细胞生长因子(成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β₁)和表皮生长因子(EGF))、整合素纤维连接蛋白与层粘连蛋白。角膜细胞生长因子与整合素之间的协同效应和用量对角膜细胞的粘连和生长繁殖可进行调控，促进角膜细胞间的正常融合及与活性再生人工角膜移植物的结合，有利于受损病变角膜的修复和重建。

活性再生人工角膜移植物的三维多孔立体结构是影响其性能的关键因素。本发明采用冷冻干燥、聚乙二醇和激光打孔致孔，构建三维多孔活性再生人工角膜移植物。聚乙二醇是一种无毒的高分子聚合物，与水有极好的互溶性，它的相对分子质量可从几千至几万。控制PEG的相对分子质量大小及用量，可调节孔的尺寸、体积和密度。在支架中形成内通多孔结构，使细胞可由支架表面向内部迁移生长。控制冷冻干燥的温度范围、程序降温和各组分配比，也可以调节孔的尺寸、体积和密度。此外，采用激光打孔，通过控制激光能量大小，设计不同孔型、孔径和孔距，可获得更为优良的三维多孔立体结构。

本发明与现有技术相比具有如下的有益效果：

(1)本发明获得的活性再生人工角膜移植物可以解决角膜等同物种子细胞不适合移植、基质强度不足及收缩、透明度差、人工角膜漏水、前后膜形成等问题。

(2)本发明获得的活性再生人工角膜移植物的含水率60％～95％，膨胀率100％～500％，透光率90％～100％，抗张强度(湿态)3～15Mpa，扯断伸长率300％～500％，折光率1.360～1.390。而现有同类材料的性能一般为：材料透光率90％～96％，材料折射率1.368～1.382(人眼角膜为1.377)；材料机械强度与人眼角膜相仿，其中湿态抗张强度4Mpa～8.6MPa；含水率55％～75％；扯断伸长率150％～300％；

(3)本发明获得的活性再生人工角膜适合于角膜细胞在体内外生长，可引导角膜细胞在其中三维立体粘附生长；在体内外降解吸收的速度与角膜细胞生长速度相匹配；

(4)本发明采用冷冻干燥、聚乙二醇和激光打孔致孔，构建三维多孔活性再生人工角膜移植物。用激光打孔，通过控制激光能量大小，设计不同孔型、孔径和孔距；控制冷冻干燥的温度范围、程序降温和各组分配比也可以调节孔的尺寸、体积和密度；控制聚乙二醇的相对分子质量大小及用量，可调节孔的尺寸、体积和密度，在支架中形成内通多孔结构。

(5)根据仿生原理制备活性再生人工角膜移植物，其组份配比采用天然基质胶原、硫酸软骨素、壳聚糖整合角膜细胞生长因子(成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β₁)和表皮生长因子(EGF))、整合素纤维连接蛋白与层粘连蛋白。根据不同角膜细胞可调控组份配比，角膜细胞生长因子与整合素之间的协同效应和用量对角膜细胞的粘连和生长繁殖可进行调控，促进角膜细胞间的正常融合及与活性再生人工角膜移植物的结合，有利于受损病变角膜的修复和重建。

(6)本发明活性再生人工角膜移植物可加工塑形，可制备不同曲率和厚度的制品，成型方法易操作，原材料易得不贵，能进行大规模产业化生产。

具体实施方式：

实施例1

按重量份或质量浓度，活性再生人工角膜移植物包括下列组分

壳聚糖：10份；         胶原：10份；

硫酸软骨素：0.3份；    三蒸水:67份；

聚乙二醇(分子量1000)： 5份；

聚乙烯醇(分子量10000)：10份；

角膜细胞生长因子：     10ng/ml；

纤维连接蛋白：         60ng/ml；

层粘连蛋白：           25ng/ml；。

其中角膜细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml。

上述活性再生人工角膜移植物由以下步骤制备：(1)按上述比例称取壳聚糖、胶原和硫酸软骨素，将壳聚糖、胶原分别溶于pH<3的盐酸溶液或醋酸溶液，硫酸软骨素溶于三蒸水；(2)混合上述各组分，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入模具中烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后获得制品；(5)所得制品用激光打孔，孔径150μm，孔型线条沟槽，孔距500μm。

本发明获得的活性再生人工角膜移植物:含水率60％，膨胀率100％，透光率90％，抗张强度(湿态)3Mpa，扯断伸长率300％，折光率1.360。

实施例2

按重量份或质量浓度，活性再生人工角膜移植物包括下列组分：

壳聚糖：20份；         胶原：  25份；

硫酸软骨素：0.2份；    三蒸水：45份；

聚乙二醇(分子量4000)： 5份；

聚乙烯醇(分子量40000)：5份；

角膜细胞生长因子：     65ng/ml；

纤维连接蛋白：         70ng/ml；

层粘连蛋白：           25ng/ml；

其中角膜细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)30ng/ml，转化生长因子(TGF-β₁)15ng/ml。

上述活性再生人工角膜移植物由以下步骤制备：(1)按上述比例称取壳聚糖、胶原和硫酸软骨素，将壳聚糖、胶原分别溶于pH<3的盐酸溶液或醋酸溶液，硫酸软骨素溶于三蒸水；(2)混合上述各组分，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入模具中烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后获得制品；(5)所得制品用激光打孔，孔径300μm，孔型圆形，孔距500μm。

本发明获得的活性再生人工角膜移植物的含水率95％，膨胀率500％，透光率100％，抗张强度(湿态)15Mpa，扯断伸长率500％，折光率1.390。

实施例3

按重量份或质量浓度，活性再生人工角膜移植物包括下列组分：

壳聚糖：30份；         胶原：15份；

硫酸软骨素：0.4份；    三蒸水:37份；

聚乙二醇(分子量50000)：5份；

聚乙烯醇(分子量100000)：5份；

角膜细胞生长因子：      75ng/ml；

纤维连接蛋白：          40ng/ml；

层粘连蛋白：            55ng/ml；

其中角膜细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)30ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml，转化生长因子(TGF-β₁)25ng/ml。

上述活性再生人工角膜移植物由以下步骤制备：(1)按上述比例称取壳聚糖、胶原和硫酸软骨素，将壳聚糖溶于pH<3的盐酸溶液，胶原溶于pH<3的醋酸溶液，硫酸软骨素溶于三蒸水；(2)混合上述各组分，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入模具中烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后获得制品；(5)所得制品用激光打孔，孔径100μm，孔型椭圆，孔距1000μm。

本发明获得的活性再生人工角膜移植物的含水率75％，膨胀率180％，透光率98％，抗张强度(湿态)11Mpa，扯断伸长率380％，折光率1.380。

实施例4

按重量份或质量浓度，活性再生人工角膜移植物包括下列组分：

壳聚糖：15份；         胶原：25份；

硫酸软骨素:0.1份；     三蒸水:50份；

聚乙二醇(分子量20000)：5份；

聚乙烯醇(分子量20000)：5份；

角膜细胞生长因子：     90ng/ml；

维连接蛋白：           50ng/ml；

层粘连蛋白：           35ng/ml；

其中角膜细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)30ng/ml，表皮生长因子(EGF)30ng/ml，转化生长因子(TGF-β₁)30ng/ml。

上述活性再生人工角膜移植物由以下步骤制备：(1)按上述比例称取壳聚糖、胶原和硫酸软骨素，将壳聚糖、胶原分别溶于pH<3的盐酸溶液，硫酸软骨素溶于水；(2)混合上述各组分，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入模具中，置于冷冻干燥机冻干，冷冻干燥和程序升温温度范围:-100～-20度(4)用水浸泡清洗烘干后获得制品；

本发明获得的活性再生人工角膜移植物的含水率70％，膨胀率150％，透光率93％，抗张强度(湿态)13Mpa，扯断伸长率350％，折光率1.368。

实施例5

按重量份或质量浓度，活性再生人工角膜移植物包括下列组分：

壳聚糖：5份；          胶原：30份；

硫酸软骨素：0.5份；    三蒸水:80份；

聚乙二醇(分子量4000)： 10份；

聚乙烯醇(分子量60000)：25份；

角膜细胞生长因子：     120ng/ml；

纤维连接蛋白：         100ng/ml；

层粘连蛋白：           120ng/ml；

其中角膜细胞生长因子的组成为成纤维细胞生长因子(bFGF)50ng/ml，表皮生长因子(EGF)40ng/ml，转化生长因子(TGF-β₁)30ng/ml。

上述活性再生人工角膜移植物由以下步骤制备：(1)按上述比例称取壳聚糖、胶原和硫酸软骨素，将壳聚糖溶于pH<3的盐酸溶液，胶原溶于pH<3的醋酸溶液，硫酸软骨素溶于水；(2)混合上述各组分，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入模具中烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后获得制品；(5)所得制品用激光打孔，孔径1μm，孔型梭型，孔距100μm。

本发明获得的活性再生人工角膜移植物的含水率76％，膨胀率330％，透光率93％，抗张强度(湿态)8Mpa，扯断伸长率380％，折光率1.377。

实施例6

按重量份或质量浓度，活性再生人工角膜移植物包括下列组分：

壳聚糖：30份；         胶原：5份；

硫酸软骨素：0.1份；    三蒸水:15份；

聚乙二醇(分子量3000)： 5份；

聚乙烯醇(分子量80000)：5份；

角膜细胞生长因子：     50ng/ml；

纤维连接蛋白：         1ng/ml；

层粘连蛋白：           1ng/ml；

其中角膜细胞生长因子的组成为表皮生长因子(EGF)50ng/ml。

上述活性再生人工角膜移植物由以下步骤制备：(1)按上述比例称取壳聚糖、胶原和硫酸软骨素，将壳聚糖溶于pH<3的盐酸溶液，胶原溶于pH(3的醋酸溶液，硫酸软骨素溶于水；(2)混合上述各组分，在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入模具中烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后获得制品；(5)所得制品用激光打孔，孔径300μm，孔型椭圆，孔距1000μm。

本发明获得的活性再生人工角膜移植物的含水率85％，膨胀率200％，透光率98％，抗张强度(湿态)8.5Mpa，扯断伸长率400％，折光率1.373。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。