一种改进的拮抗细菌生物测定方法

摘要

本发明提供一种改进的拮抗细菌生物测定方法——双层培养基滤纸夹心法，所属的技术领域涉及生物农药研制必须采用的参试菌株生物测定方法。通过无菌滤纸平板模制作、上下层培养基制作、无菌滤纸模移入和移出、待测拮抗细菌和目标病原真菌培养、实验结果测量等简易程序进行拮抗细菌对植物病原真菌的抗菌活性测定，可合理地筛选出有应用价值的拮抗细菌。本发明属实施拮抗细菌生物测定的一种简便快捷新方法，具有技术上的创新性，该方法能真实反应菌株代谢产物的抗菌能力，具有试验稳定性好、重复性好、材料便宜、操作简便，实验周期短等优点，本发明可以实现多种拮抗细菌对多种病原真菌的大量测定，对研究拮抗细菌生防稳定性也具有很好的作用。

说明书

技术领域

本发明技术领域属于农学门类，植物保护一级学科下设的植物病理学二级学科，更具体涉及一种生物农药研制和开发中所必须的拮抗细菌生物活性测定方法。

背景技术

1、生物防治在可持续农业的发展中发挥着越来越重要的作用。生物防治的一个重要内容就是利用微生物防治病害，有益微生物中用于研究防治植物真菌病害较多的是细菌，如芽孢杆菌属(Bacillus sp)和假单孢杆菌属(Pseudomonas sp)的一些种，人们通常称之为拮抗细菌或生防细菌，众多研究证明一些细菌对植物病原真菌生长具有较强的抑制作用，与病菌对峙培养，能表现出明显的抑菌带，其代谢物质能引起病菌菌丝消解和细胞内溶，能抑制病菌菌丝生长和孢子萌发，在病害防治中显示出较好的生防效果。

2、在拮抗细菌的筛选过程中，拮抗细菌对病原菌的生物测定方法具有至关重要的作用，它是生物农药研制和开发必不可少的一个重要环节。目前采用的生物测定方法通常有拮抗菌与病菌之间平板对峙培养法；菌体直接作用测定法、三明治法；拮抗细菌无菌发酵液(细菌过滤器过滤、高温灭菌)抗菌能力测定法，其中又包括发酵液混于培养基中抑制病菌菌落生长测定法、发酵液抑制孢子萌发测定法、发酵液管碟法、发酵液滤纸片法等。我们经过多年的实验研究发现，这些方法在使用过程中存在着明显的局限性。

(1)平板对峙法，拮抗细菌与病菌之间平板对峙培养法，通常在两者之间会形成一明显的抑菌带(约3mm～18mm)，此法操作比较简便，适合于拮抗细菌的初筛，但拮抗细菌形成的抑菌带大小不仅与拮抗细菌自身分泌的代谢产物抑菌活性有关，还与菌株代谢产物在培养基上扩散能力有关，人们采用平板对峙法通常以抑菌带宽度值作为评价拮抗菌株抗菌能力的指标，而保留抑菌带宽度值大的菌株，淘汰抑菌带宽度值小的菌株。我们由此会失去一个因分泌的代谢产物在培养基扩散能力差，而代谢产物抑菌活性强的好菌株。现实中生物农药的研制常常是利用菌株代谢产物的抗菌特性。因此采用此法，并不能真正反应出拮抗细菌潜在的抗菌能力。再者用此法试验稳定性、重复性差，同一拮抗细菌点接后，菌落大小并不完全一样，抑菌带宽度值因而也会出现差异。

(2)菌体直接作用测定法，通常是在平板上涂抹拮抗细菌菌液(菌苔稀释液或含菌体的发酵液)，或利用拮抗细菌菌液与培养基混合制平板，然后在含拮抗菌的平板上接入病菌块，测定病菌菌落生长直径，采用此法，细菌可快速占领平板培养空间，对病菌生长影响极大，生测效果不明显，无法真实反应出细菌代谢产物的抗菌活性。

(3)三明治法，在两层培养基中间为一层培养基与拮抗菌菌液(含活菌体)的混合体。然后在上层培养基中接入病菌块，但此法在制作上层培养基的过程中容易使中间层培养基的菌体携入，从而影响拮抗细菌对病菌菌落的生物活性测定。而且在培养过程中拮抗细菌是在中层培养基缺乏氧气的条件下生长，势必影响细菌代谢产物的正常分泌。

(4)拮抗细菌无菌发酵液抗菌能力测定法，包括发酵液混于培养基中抑制病菌菌落生长、发酵液抑制病菌孢子萌发，发酵液滤纸片法、发酵液管碟法等，通常用此法评价拮抗细菌发酵液的抗菌活性，但是在制备拮抗细菌无菌发酵液过程中常采用细菌过滤器过滤获得无菌滤液，在操作上不方便，易造成污染，且费用较高，而采用高温灭菌法制备的无菌滤液可能导致发酵液中部份不耐高温的代谢物失活，影响拮抗菌发酵液真实抗菌能力的发挥。此外，采用拮抗细菌无菌发酵液抗菌能力测定法还受于拮抗细菌发酵培养液培养过程中、细菌培养液培养无菌过滤和检测等诸多因素的制约，达不到快速大量测定的目的。发酵液滤纸片法，作用效果不明显，滤纸片风干时易污染。含发酵液培养基法，由于添加不同浓度的发酵液于培养基中，一定程度上会影响培养基的营养成份和凝固性，从而影响菌的正常生长。发酵液管碟法，加样量少，受管底和管壁的作用，一定程度上会影响细菌发酵液的扩散方向和扩散量，生测时形成的抑菌斑不规则，从而影响试验结果的准确性，操作上复杂、耗时耗财。

发明内容

本发明的目的提供一种改进的拮抗细菌生物测定方法，解决和克服拮抗细菌生物测定其它方法中的不足，如操作上复杂、耗时耗财，试验真实性、稳定性、重复性、准确性差等问题，根据拮抗细菌及其代谢分泌产物等特点，而提供一种操作简便、快速、材料便宜、来源方便、实验周期短、试验真实性、稳定性、重复性好的拮抗细菌生物测定新方法——双层培养基滤纸夹心法，可达到真实合理评价拮抗细菌生防效果的目的，本方法适用于多种拮抗细菌抗菌谱研究，可对多种病原菌(如枯萎病菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、玉米纹枯病菌、花生青枯病菌、柑桔溃疡病菌等)进行生物活性测定，对研究拮抗细菌代谢分泌产物生防稳定性(常温存放、紫外线照射)也具有很好的效果。本发明的新方法对合理评价拮抗细菌的生防效果、筛选有应用价值生防菌株具有重要的作用。

本发明的改进的拮抗细菌生物测定方法，采用双层培养基滤纸夹心法，将一定浓度细菌培养液或菌苔稀释液均匀涂抹于上层培养基中，拮抗细菌在上层培养基生长产生的代谢分泌物会通过滤纸层均匀扩散到下层培养基中，移去滤纸及其携带的上层培养基，下层培养基即为含拮抗细菌代谢分泌产物的平板，易于进行对多种病原真菌菌丝生长、孢子萌发及细菌生长的生物测定。

本发明的显著优点是：本发明利用拮抗细菌代谢分泌产物在培养基的扩散性(拮抗细菌代谢分泌产物在含琼脂培养基的扩散距离通常为3～18mm)、利用廉价滤纸良好的渗透性、利用细菌菌体在培养基生长不透性等原理，进行拮抗细菌对植物病原真菌生物测定方法改进和创新。该方法测定周期约为7天，测定过程中利用拮抗细菌代谢分泌产物在培养基的自然均匀扩散性，病菌菌落在含拮抗细菌代谢分泌产物的培养基上生长规则，避免了因菌株代谢产物在培养基上扩散能力差异、菌株发酵液培养和过滤等问题而带来试验结果的误差。采用双层培养基滤纸夹心法在检测过程中耗费的试材量少，由此法获得的拮抗菌株生物测定结果同利用细菌过滤器获得的拮抗细菌无菌发酵滤液(以20％～50％剂量添加至病菌培养基中)进行生物测定获得的评价结果较为吻合。实施双层培养基滤纸夹心法能真实反应菌株代谢产物抗菌能力，具有试验稳定性好、重复性好、材料便宜、来源方便、操作简便等优点，适用于多种拮抗细菌抗菌谱研究，可对多种病原菌(如枯萎病菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、玉米纹枯病菌、花生青枯病菌、柑桔溃疡病菌等)进行生物活性测定，对研究拮抗细菌代谢分泌产物生防稳定性(常温存放、紫外线照射)也具有很好的效果。本发明的新方法对合理评价拮抗细菌的生防效果、筛选有应用价值生防菌株具有重要的作用。并且本发明的方法可同时完成多个拮抗细菌的抗菌谱测定，具有新颖性、实用性和创造性，作为一种新的拮抗细菌生物测定方法，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是本发明的应用技术路线流程图。

图2是本发明的技术原理图。

图3是本发明的几种拮抗细菌对香蕉枯萎病菌离体抑菌活性生物测定过程图，其中：

A部分是：注无菌滤纸模制作：用直径为12cm的滤纸(如高速101型)平铺于直径为切8.9cm玻璃培养皿中，超出宽度约1.5cm的滤纸边缘使之皱褶，并置于平皿中高压灭菌，无菌滤纸平板模成形备用；

B部分是：注在下层培养基上移入滤纸模：在直径为8.9cm玻璃培养皿中加入10ml的下层培养基，厚度为3～4mm，凝固后，在下层培养基上方移入无菌滤纸模，皱褶处贴于培养皿皿壁，平板处浸湿并紧贴于培养基；

C部分是：注在滤纸模上制上层培养基：在无菌滤纸模上加入10ml的细菌培养基为上层培养基，凝固后待用，上层培养基通过滤纸模与下层培养基分隔；

D部分是：注培养待测拮抗细菌：吸取100μl细菌液(一定浓度含细菌菌体培养液)均匀涂抹于上层平板中，于适宜细菌生长的条件下培养(如28℃，黑暗)，培养48h后，在下层培养基上标记上层培养基上均匀长满拮抗细菌的范围；

E部分是：注下层培养基培养香蕉枯萎病菌：拮抗细菌培养48h后，细菌分泌的代谢产物会通过滤纸层向下层培养基均匀扩散，移出含上层培养基的滤纸，下层培养基作为对目标病菌的生物测定试材，在含细菌分泌的代谢产物的下层培养基中央接入待测病菌，于病菌适宜生长的条件下培养。病菌生长适宜天数后，在试验下层培养基中测量病原真菌菌落直径。真实评价拮抗细菌对病菌的生测效果，正确筛选出抑菌效果好的拮抗菌株。

图4是示枯草芽孢杆菌、菌株1、2、3、4、5与香蕉枯萎病菌对峙培养(7d)图。

图5是香蕉枯萎病菌在含33％菌株1、2、3、4、5培养滤液的PDA平板中生长情况(7d)图。

图6是香蕉枯萎病菌在含菌株1、2、3、4、5代谢产物的PDA平板中生长情况(7d)图。

具体实施方式

(1)制作适合病原真菌生长的下层培养基和适合拮抗细菌生长的上层培养基。

(2)制作无菌滤纸平板模：用直径为12cm的滤纸(如高速101型)平铺于直径为8.9cm玻璃培养皿中，超出宽度约1.5cm的滤纸边缘使之皱褶，并置于平皿中高压灭菌，无菌滤纸平板模成形备用。

(3)制作下层培养基：在直径为8.9cm玻璃培养皿中加入10ml的下层培养基，厚度为3～4mm，凝固后待用。

(4)移入无菌滤纸模：在下层培养基上方移入无菌滤纸模，皱褶处贴于培养皿皿壁，平板处浸湿并紧贴于培养基。

(5)制作上层培养基：在无菌滤纸模上加入10ml的细菌培养基为上层培养基，凝固后待用，上层培养基通过滤纸模与下层培养基分隔。

(6)培养待测拮抗细菌：吸取100μl细菌液(一定浓度含细菌菌体培养液)均匀涂抹于上层平板中，于适宜细菌生长的条件下培养(如28℃，黑暗)，培养48h后，在下层培养基上标记上层培养基上均匀长满拮抗细菌的范围。

(7)移出无菌滤纸模：拮抗细菌培养48h后，细菌分泌的代谢产物会通过滤纸层向下层培养基均匀扩散，移出含上层培养基的滤纸，下层培养基作为对目标病菌的生物测定试材。

(8)培养目标病原真菌：在含细菌分泌的代谢产物的下层培养基中央接入待测病菌，于病菌适宜生长的条件下培养。

(9)试验结果测量：病菌生长适宜天数后，在试验下层培养基中测量病原真菌菌落直径。以不接种拮抗菌的处理为空白对照，计算病原菌生长抑制率。

(10)筛选拮抗细菌：通过实验结果分析比较拮抗细菌的抗菌能力，完成拮抗细菌生物活性测定，真实评价拮抗细菌对病菌的生测效果，正确筛选出抑菌效果好的拮抗菌株。

请参阅图1、图2、图3所示，本发明实施例1之方法依序包括：获得和培养待测拮抗细菌、获得和培养目标病原真菌、制作无菌滤纸平板模、制作下层PDA培养基、移入无菌滤纸模、制作上层NA培养基、培养拮抗细菌、移出无菌滤纸模、培养目标病原真菌、试验结果测量、筛选拮抗细菌，其中获得和培养待测拮抗细菌、获得和培养目标病原真菌属于常规的植物病理研究法，在此不再描述，其特征在于：

(1)制作适合病原真菌生长培养基(以常规的PDA培养基为例)和适合拮抗细菌生长培养基(以常规的NA培养基为例)。

(2)制作无菌滤纸平板模：用直径为12cm的滤纸(如高速101型)平铺于直径为8.9cm玻璃培养皿中，超出宽度约1.5cm的滤纸边缘使之皱褶，并置于平皿中高压灭菌，无菌滤纸平板模成形备用。

(3)制作下层PDA培养基，在直径为8.9cm玻璃培养皿中加入10ml的PDA培养基为下层培养基，厚度为3～4mm，凝固后待用。

(4)移入无菌滤纸模：在下层培养基上方移入无菌滤纸模，皱褶处贴于培养皿皿壁，平板浸湿并紧贴于培养基。

(5)制作上层NA培养基：在无菌滤纸模上加入10ml的NA培养基为上层培养基，凝固后待用，NA培养基通过滤纸模与PDA培养基分隔。

(6)培养待测拮抗细菌：吸取100μl细菌液(一定浓度含细菌菌体的培养液)均匀涂抹于上层平板中，于适宜细菌生长的条件下培养(如28℃，黑暗)，培养48h后，在下层培养基上标记上层培养基上均匀长满拮抗细菌的范围。

(7)移出无菌滤纸模：拮抗细菌培养48h后，细菌分泌的代谢产物会通过滤纸层向下层PDA培养基均匀扩散，移出的含上层培养基的滤纸模，保留含细菌分泌的代谢产物的下层培养基作为生物测定试材。

(8)培养目标病原真菌：含细菌分泌的代谢产物的下层PDA培养基中央接入菌龄一致的待测病菌菌饼(直径为5mm)，于适宜病菌生长的条件下培养(如28℃，黑暗)。

(9)实验结果测量：病菌生长4～7d后测量菌落直径，以不接种拮抗菌的处理为空白对照，设多个重复，计算病菌菌丝生长抑制率。

(10)筛选拮抗细菌：通过实验结果分析比较拮抗细菌的抗菌能力，完成拮抗细菌生物测定，真实评价拮抗细菌对病菌的生测效果，正确筛选出抑菌效果好的拮抗菌株。以下是本发明的具体实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例

拮抗细菌对香蕉枯萎病菌抑菌活性比较

一、材料与方法

1、拮抗细菌平板对峙对病菌的拮抗作用

采用PDA平板对峙生长法，点接待测的活化细菌(具有初步抑菌活性，来源于土壤)5株，并在相距2cm处接入直径为0.5cm香蕉枯萎病菌(4号小种)菌丝块，28℃黑暗对峙培养4d和7d后，测量各拮抗细菌的抑菌带宽度，比较各菌株的抑菌活性及其稳定性，每处理4个重复。

2、拮抗细菌发酵液对病菌菌丝生长的抑制作用

用无菌水洗下待测拮抗菌菌落，混匀后吸取100μl细菌液转接于盛有150ml NB培养液的250ml三角瓶中培养3d后(28℃，140rpm)，取细菌发酵液无菌过滤后按1：2比例与PDA培养基(45℃)混匀后倒入直径为9cm的培养皿中制成平板。冷凝后于平板中央接入直径0.5cm病菌块，置28℃黑暗培养。以加相同量的NB液体培养基为对照，每处理4个重复。分别于培养4d、7d后用十字交叉法测量病菌菌落直径，计算平均直径，比较各菌株的抑菌活性。

3、拮抗细菌培养代谢产物对病菌菌丝生长的抑制作用

采用双层培养基滤纸夹心法，先于培养皿中倒入10ml PDA培养基为下层培养基，待培养基冷凝后。将预先准备好的直径12cm无菌滤纸(高速101型)轻轻紧贴于PDA平板上，再向滤纸上倒入10ml PDA培养基为上层培养基。吸取100μl细菌液均匀涂抹于上层平板中，28℃黑暗下培养48h后，撕去含拮抗细菌的上层培养基滤纸，并在下层培养基中央接入病菌块，再于28℃黑暗条件下培养4d、7d后用十字交叉法测量病菌菌落直径，计算平均直径，比较各菌株的抑菌活性。以不接种拮抗菌发酵液的处理为对照，每处理4个重复。

二、结果与分析

采用平板对峙培养法，待测的5株细菌(菌株1～5)与病菌对峙培养4d后的抑菌带宽度分别为0.83cm、0.86cm、0.81cm、0.98cm和0.75cm，以菌株4抑菌带宽度值最大，抑菌带宽度值由大至小依次是4>2>1>3>5，共有2个显著性差异水平；两者对峙培养7d后的抑菌带宽度分别为0.25cm、0.50cm、0.23cm、0.48cm和0.48cm，以菌株2抑菌带宽度值最大，抑菌带宽度值由大至小依次是2>4＝5>1>3，有2个显著性差异水平，这是由于随着对峙培养时间的延长，病菌继续朝拮抗菌方向生长，表现为抑菌带宽度在不断缩少。用平板对峙法筛选拮抗细菌，优点是操作简便，时间短，4d可以看出初步结果，适合拮抗细菌的初步筛选。但是采用此法在不同时间测量抑菌带宽度，获得的结果差异较大，试验结果不稳定，菌株间表现的差异不明显。

表1  平板对峙法测定拮抗细菌对香蕉枯萎病菌生长影响

采用培养基带毒法，香蕉枯萎病菌在含待测的5株细菌(菌株1～5)培养发酵液中的PDA平板中培养4d，病菌菌落直径分别为2.10cm、1.69cm、1.70cm、1.96cm和1.21cm，各菌株的抑菌活性由大至小分别为5>2>3>4>1，有3个显著性差异水平；香蕉枯萎病菌在含待测的5株细菌(菌株1～5)培养发酵液中的PDA平板中培养7d，病菌菌落直径分别为3.27cm、2.60cm、3.08cm、3.12cm和2.08cm，各菌株的抑菌活性由大至小分别为5>2>3>4>1，有4个显著性差异水平。采用培养基带毒法，检测细菌培养发酵滤液的抑菌活性，是一种较为理想的方法，能真实反应菌株之间的抗菌活性大小，但是试验过程中较为繁琐，试验周期较长，有的菌株间差异不明显。

表2 培养基带毒法测定拮抗细菌对香蕉枯萎病菌生长抑制效果(含拮抗细菌无菌发酵液PDA培养基)

采用双层培养基滤纸夹心法，香蕉枯萎病菌在含待测的5株细菌(菌株1～5)代谢产物的PDA平板中培养4d，病菌菌落直径分别为1.10cm、0.81cm、0.88cm、1.00cm和0.70cm，各菌株的抑菌活性由大至小分别为5>2>3>4>1，有5个显著性差异水平；香蕉枯萎病菌在含待测的5株细菌代谢产物的PDA平板中培养7d，病菌菌落直径分别为1.51cm、0.98cm、1.29cm、1.50cm和0.88cm，各菌株间差异明显，各菌株的抑菌活性由大至小分别为5>2>3>4>1，有4个显著性差异水平。由于拮抗细菌代谢分泌产物在培养基中通过自然力作用，均匀扩散性，病菌菌落在含拮抗细菌代谢分泌产物的培养基上生长规则，两次测量结果一致。试验结果误差小，稳定，在操作上方便，各菌株间差异明显，试验4～7d可以看出与表2结果较为吻合。

表3双层培养基滤纸夹心法测定拮抗细菌对香蕉枯萎病菌生长影响

三、拮抗细菌几种测定方法效果评价

1、平板对峙法：拮抗菌和病菌共培养需5～7d，操作简便，但抑菌活性不稳定，试验误差大，拮抗菌株间表现的差异最不明显。

2、培养基带毒法：拮抗菌发酵液培养2～3d，离心液无菌过滤后，无菌检测需2～3d，制带毒培养基，观察有无细菌感染需2～3d，培养病菌4～7d，拮抗菌株间表现的差异较为明显。但过滤膜价格高，操作最为耗时耗财，有时过滤操作不当和无菌检测不全面易导试验失败。

3、双层培养基滤纸夹心法：拮抗菌培养1～2d，培养病菌4～7d，拮抗菌株间表现的差异最为明显。易操作，且试验材料中滤纸便宜。待试验的下层培养基常温下存1个月，平板中拮抗细菌代谢产物的抗菌活性仍然稳定，可检测多种拮抗细菌对多种病原真菌抑菌活性，适合多种拮抗细菌抑菌谱的研究。