阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。本发明的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，引物为一套阪崎肠杆菌特征性引物组，一套引物组由两对引物成，一对引物为外引物，一对为内引物，本发明共有6套引物；本发明的试剂盒由一套引物、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液、显色剂和阳性对照液等组成；检测方法包括细菌DNA的提取、环介导等温核酸扩增和显色检测等。使用本试剂盒通过对样品简单的处理便可快速检测样品中阪崎肠杆菌，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、通过肉眼即可判定结果等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，又名黄色阴沟肠杆菌，为肠杆菌属的一种革兰氏阴性菌，1980年后改名为阪崎肠杆菌，是奶及奶制品加工过程及成品中近几年新发现的引起广泛关注的一种致病菌，可引起婴幼儿及成人疾病包括婴儿脑膜炎、脓血症、败血症和小肠结肠炎等，并可能引起神经功能紊乱，造成严重的后遗症和甚至死亡。2002-2003年美国某知名奶粉生产企业曾自发召回了含有阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉，此后奶粉中阪崎肠杆菌成为世界瞩目的焦点。1961年至2003年研究报告已表明阪崎肠杆菌引起婴幼儿及早产儿总体死亡率高达80％。FAO/WHO(联合国粮农组织/世界卫生组织)于2004年2月在日内瓦召开的专家咨询会上将阪崎肠杆菌列入导致婴幼儿感染、疾病和死亡的主要原因的“A”类微生物范畴，严重威胁人类(尤其是婴幼儿)的健康，并给食品(尤其是奶及奶制品)工业带来重大经济损失。

因此，各国政府对食品(尤其是奶及奶制品)中的阪崎肠杆菌都作出严格的要求。2002年美国FDA在世界范围内率先建立了阪崎肠杆菌的检测标准；我国先后发布了“奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分：分离与计数方法”(SN/T1632.1-2005)、“奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分：PCR方法”(SN/T1632.2-2005)和“奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法”(SN/T1632.3-2005)等行业标准，对大部分进口的奶及奶制品都要求进行阪崎肠杆菌的检验，并要求不得检出。因此，阪崎肠杆菌已成为许多国家食品卫生的必检项目，其检测方法正日益引起人们的关注。

经典的常规细菌生理生化检验方法全过程至少需要6～10d，检出限较低，费时费力。免疫法比较快，但单克隆抗体制备比较困难，易产生交叉反应，特异性差。而PCR或荧光定量PCR方法快速，特异、灵敏度很高，但需要昂贵的PCR仪、技术复杂、费用高，不易推广应用。荧光染色技术可以对活菌进行检测，但技术复杂，需要高端仪器。因此建立一种简便、灵敏、快速、特异的方法很有必要。

环介导等温扩增基因技术(loop-mediated isothermal amplication，简称LAMP)(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。

中国发明专利(申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6)分别公开了采用环介导等温扩增基因技术检测病菌的方法。但是，目前尚无利用环介导等温扩增基因技术检测阪崎肠杆菌的试剂盒和检测方法的报道。

发明内容

为了解决现有阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的检测方法不简便、灵敏低、时间长、特异性差的技术缺陷。本发明的一个目的是提供一种阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplication，LAMP)技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒检测方法。本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异好的特点，可广泛用于食品(尤其是奶及奶制品)、水产品、化妆品与医疗卫生等领域。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用以下的技术方案：

阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，所述的引物为一套阪崎肠杆菌特征性引物组，一套引物组由两对引物成，一对引物为外引物，一对为内引物，共有6套引物，序列分别为：

引物组一：

外引物1：GCAATATTCCCCACTGCTGC

外引物2：GGAGGGGGATAACTACTGGA

内引物1：CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT

内引物2：TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG

或引物组二：

外引物1：AGTGTGGCTGGTCATCCT

外引物2：CGGACGGGTGAGTAATGTCT

内引物1：GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG

内引物2：AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG

或引物组三：

外引物1：TGTGGCTGGTCATCCTCTC

外引物2：TGCTGCTCTGCTGACGA

内引物1：GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC

内引物2：TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG

或引物组四：

外引物1：TCCTCCCCGCTGAAAGT

外引物2：TGCCCAGATGGGATTAGCT

内引物1：GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG

内引物2：CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA

或引物组五：

外引物1：ACTTTACAACCCGAAGGCC

外引物2：AGCTAGTAGGTGGGGTAACG

内引物1：GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG

内引物2：CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC

或引物组六：

外引物1：TGTGGCTGGTCATCCTCTC

外引物2：TGCTGCTCTGCTGACGA

内引物1：GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC

内引物2：TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用以下的技术方案：

阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，该试剂盒包括上述技术方案中的任意一组引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液和阳性对照液。

作为优选，所述的引物组由体积比为1：1：4：4的20-30μM外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成。

作为优选，所述的反应液是由体积比为5：2：1：2的10×Thermopol反应缓冲液、7.5～12.5mM dNTP，100～200mM MgSO₄与25～37.5M甜菜碱组成。作为再优选，所述的10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100。

作为优选，所述的Bst DNA聚合酶每微升含8～16个活性单位。

作为优选，所述的样品预处理液是由20mM pH8.0Tris-HCl，2mM EDTA，体积百分比浓度为1.2％曲拉通X-100。

作为优选，所述的该试剂盒还包括显色剂，显色剂为荧光染料。优选荧光染料为SYBR Green I；

作为优选，所述的阳性对照液为阪崎肠杆菌标准菌株基因组DNA。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用以下的技术方案：

阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测方法，采用上述的任意一个技术方案所述的试剂盒，该方法包括以下的步骤：

1)阪崎肠杆菌DNA的提取：A、取50ul过夜培养的增菌液于eppendorf管中，1000rpm离心2min，弃上清；B、加入80ul样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；C、沸水中煮10min后立即冷却10min；D、10000rpm离心2min，上清即可作为待检的模板DNA；

2)反应体系为：2.5μL引物组、5μL反应液、1μLBst DNA聚合酶、2μL待检模板DNA或阳性对照液和14.5μLddH2O；

3)阪崎肠杆菌的环介导等温扩增：将配制好的PCR管于60～65℃反应1～1.5h，80℃终止反应；

4)分析判断反应产物结果：在反应产物中加入2.5ul荧光染料，混匀，静置5min，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

本发明所说的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication，简称LAMP)快速检测样品阪崎肠杆菌的方法是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎--环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-----焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65℃左右)条件下45至90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析、血清学分型和PCR鉴定等的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10至15天；采用本发明中的基因诊断试剂盒检测仅需2小时。并且，本发明的反应液中也可以添加了荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。

本发明的优点是(1)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高：扩增模板仅需10拷贝或更少，最低检测极限达到10CFU/ml；标本的检出率达到99％；(5)、鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的M²⁺结合，产生副产物-----焦磷酸镁乳白色沉淀，可通过肉眼观察鉴定；加入荧光染料后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，更加明显可靠；(6)、用途广：可广泛用于食品(尤其奶及奶制品)中阪崎肠杆菌的安全快速检测。

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。

实施例1 试剂盒的制备

本发明所提供的基因诊断试剂盒是由一套引物组，一套引物组包括两对引物，Bst DNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色剂与阳性对照液等组成。

(1)其中所说的引物组有6套，分别为：

引物组一：

外引物1：GCAATATTCCCCACTGCTGC

外引物2：GGAGGGGGATAACTACTGGA

内引物1：CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT

内引物2：TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG

或引物组二：

外引物1：AGTGTGGCTGGTCATCCT

外引物2：CGGACGGGTGAGTAATGTCT

内引物1：GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG

内引物2：AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG

或引物组三：

外引物1：TGTGGCTGGTCATCCTCTC

外引物2：TGCTGCTCTGCTGACGA

内引物1：GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC

内引物2：TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG

或引物组四：

外引物1：TCCTCCCCGCTGAAAGT

外引物2：TGCCCAGATGGGATTAGCT

内引物1：GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG

内引物2：CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA

或引物组五：

外引物1：ACTTTACAACCCGAAGGCC

外引物2：AGCTAGTAGGTGGGGTAACG

内引物1：GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG

内引物2：CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC

或引物组六：

外引物1：TGTGGCTGGTCATCCTCTC

外引物2：TGCTGCTCTGCTGACGA

内引物1：GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC

内引物2：TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG

引物组由1：1：4：4的20-30μM外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成；

(2)反应液为由5：2：1：2的10×Thermopol反应缓冲液、7.5-12.5mM dNTP，100-200mM MgSO4与25-37.5M甜菜碱组成；其中，10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100；

(3)Bst DNA聚合酶为Bst DNA polymerase，每微升含8-16个活性单位；

(4)样品预处理液为20mM pH8.0Tris-HCl，2mM EDTA，体积百分比浓度为1.2％曲拉通X-100组成；

(5)显色剂为荧光染料，优选SYBR Green I；

(6)阳性对照液为阪崎肠杆菌标准菌株基因组DNA。

实施例2 检测方法

被检样品：将少许食品或体液等被检样品置于增菌液中37℃培养。

(1)、对被检样品的预处理：按常规方法提取DNA基因：

A、取50ul过夜培养的增菌液于eppendorf管中，1000rpm离心2分钟，弃上清；

B、加入80ul样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；

C、沸水中煮10分钟后立即冷却10分钟；

D、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。

(2)、环介导等温扩增技术反应过程：

A、在200ulPCR管配制反应体系：引物混合物2.5ul，反应液5.0ul，Bstpolymerase Large Fragment 1ul(8U)，准备好的模板DNA(或阳性对照液)2ul，加ddH₂0 14.5ul；

B、将配制好的PCR管于65℃反应1-1.5h，80℃终止反应。

(3)、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入2.5ul荧光染料(SYBRGREENI)，混匀，静置5min，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

序列表

<110>中国计量学院

<120>阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法

<160>24

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>4

<210>5

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<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>5

<210>6

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

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<212>DNA

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