超临界二氧化碳梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法

摘要

本发明提供一种超临界CO

说明书

技术领域

本发明涉及传统中草药领域，具体涉及超临界CO₂梯度提取当归和川芎混合物中的总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类的方法。

背景技术

当归为伞形科植物当归Angelica sinerisis(Oliv.)Diels的干燥根。当归归肝、心、脾经，药性甘、辛、温，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的作用。用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，闭经痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤，痈疽疮疡。当归是传统中药，临床应用广泛，有效部位及药理作用明确。当归发挥药效的主要有效部位为总苯酞类、总有机酸类。

川芎为伞形科植物Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，具有行气活血、祛风止痛的功效。为活血化瘀常用中药。其化学成分的研究，国内外报道较多。川芎发挥药效的主要有效部位为总苯酞类、总有机酸类、总生物碱类。

由于当归、川芎同属一科，有着伞形科植物共同的植物分类学特征，有着相似的化学成分，有着相似的功能主治，常在活血和血的处方中同时出现，常作为药对来应用，且应用十分广泛，2005版药典所载513首复方成方制剂中有49首当归与川芎同用的处方。

现有技术采用单一的方法从当归与(或)川芎中提取某一个有效部位。然而，当归与川芎混合药材的超临界提取物的药效不是来自于单一的活性化学成分，而是来自多种活性成分之间的协同作用，甚至是与某些非活性成分的协同效应或相生相克作用。任何一种成分都不能代表其全部功效。将当归与川芎的三个有效部位依次提取，可以发挥尽可能大的药效。

发明内容

为解决现有技术的提取当归与川芎混合药材的有效部位不完全且纯度不高的问题，本发明进行了合提与分提的比较研究后，采用将此药对混合进行超临界CO₂提取，依次从当归和川芎的混合药材中提取总苯酞类、总有机酸类、总生物碱类三个有效部位，并以总苯酞类、藁本内酯、总有机酸类、阿魏酸、总生物碱类、川芎嗪的含量与转移率作为评价指标，优选三个有效部位梯度提取的最佳工艺条件。经该工艺得到的提取物中总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为80～96％。

本发明的技术方案如下：

一种超临界CO₂梯度提取当归和川芎混合物中的总有效部位的方法，所述总有效部位为总苯酞类、总有机酸类和总生物碱类，所述方法包括：

a)将当归与川芎的混合药材粉末投入超临界萃取装置的萃取釜中；

b)药材先经第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分；

c)取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分；

d)取经第一、第二梯度提取后的药渣进行第三梯度超临界CO₂提取总生物碱成分；

e)合并第一、二、三梯度的超临界提取物。

其中，所述第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分的条件为：萃取温度为40～50℃，萃取压力为20～30MPa，CO₂流速为20～40L/h，萃取时间为1.5～3.0h，分离釜I温度30～50℃，压力5.0～8.0Mpa，分离釜II温度20～40℃，压力5.0～6.5Mpa；优选地，所述萃取温度为45℃，萃取压力为25MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为2.0h，分离釜I温度40℃，压力6.0Mpa，分离釜II温度30℃，压力5.0Mpa。

所述第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分的条件为：萃取温度为60～80℃，萃取压力为30～40MPa，CO₂流速为20～45L/h，萃取时间为1.0～2.0h，夹带剂为甲醇或70％～100％乙醇，分离釜I温度40～50℃，压力6～10Mpa，分离釜II温度30～50℃，压力5.0～6.5Mpa；优选地，所述萃取温度为70℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为1.5h，夹带剂为90％乙醇，分离釜I温度50℃，压力8Mpa，分离釜II温度40℃，压力5.0Mpa。

第二梯度超临界CO₂提取中的夹带剂的用量为50～200ml/100g生药，优选为150ml/100g生药。

所述第三梯度超临界CO₂提取总生物碱成分的条件为：萃取温度为60～80℃，萃取压力为30～40MPa，CO₂流速为20～50L/h，萃取时间为1.0～2.0h，夹带剂为70％～100％乙醇，碱化剂为1～30％氨水溶液，分离釜I温度40～55℃，压力6～10Mpa，分离釜II温度30～40℃，压力5.0～6.0Mpa；优选地，所述萃取温度为70℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为40L/h，萃取时间为1.5h，夹带剂为无水乙醇，碱化剂为15％氨水溶液，分离釜I温度45℃，压力8Mpa，分离釜II温度35℃，压力5.0Mpa。

第三梯度超临界CO₂提取中的夹带剂的用量为50～200ml/100g生药，优选为150ml/100g生药；碱化剂的用量为20～100ml/100g生药，优选为50ml/100g生药。

另一方面，本发明提供经本发明方法得到的提取物，其中总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为80～96％。

总苯酞类的含量采用分光光度法测定，方法如下：

空白溶液的配制：精密吸取10ml甲醇，置于10ml棕色容量瓶中，作为空白溶液。

对照品溶液的配制与标准曲线的制备：精密称取藁本内酯对照品1mg，置于10ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml，置于另一10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，于322nm波长处测定吸光度A。以对照品溶液的浓度为横坐标(X)，以相应的吸光度A为纵坐标(Y)，得回归方程：Y＝50.911X-0.0027，相关系数γ＝0.9997。藁本内酯的标准曲线如图1所示。

供试品溶液的配制：精密称取当归+川芎超临界提取物100mg，以甲醇为溶剂，配制成浓度适宜的溶液，定容，摇匀，作为供试品溶液。

含量测定：取空白溶液、供试品溶液于322nm波长处测定吸光度A。计算超临界提取物中总苯酞类的含量。

总有机酸的含量采用电位滴定法(返滴定)测定，方法如下：

柠檬酸(枸橼酸)溶液的配制：精密称取柠檬酸5.2535g，置于250ml容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。

柠檬酸对照品滴定曲线的制备：精密吸取柠檬酸(枸橼酸)溶液25ml置100ml烧杯中，连接好电位计、磁力搅拌器及待测溶液，用滴定管盛装0.1mol/L氢氧化钠滴定液，进行滴定，滴定方向为“—”。滴定时记录滴定过程中用去的氢氧化钠溶液的体积数及其相对应的pH值，在滴定终点附近，应减小滴定剂的加入量。采用一阶导数法确定滴定终点：以pH变化值(ΔpH)和体积变化值(ΔV)的比值(ΔpH/ΔV)为纵坐标，pH值变化前后所用去的氢氧化钠溶液的体积的平均值(平均V)为横坐标，结果见图2。由图2可知，曲线的最高点为滴定终点，pH＝9.00，消耗氢氧化钠的体积为64.8ml，1mlNaOH(0.1mol/L)相当于8.107mg柠檬酸。

供试品溶液的制备与测定：精密称取当归与川芎混合物的超临界提取物约1g于100ml烧杯中，精密加入0.1mol/L氢氧化钠25ml，充分混和，连接好电位计、磁力搅拌器及待测溶液，用滴定管盛装0.1mol/L盐酸滴定液，滴定方向为“+”，滴定至终点。滴定的同时进行空白校正。按下式计算超临界提取物中总有机酸的含量。

式中，V₀—空白消耗的盐酸的体积，V—供试品溶液消耗的盐酸的体积，W—供试品的重量。

总生物碱的含量采用酸性染料比色法测定，方法如下：

标准曲线的制备

对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的川芎嗪对照品40mg，置于20ml具塞试管中，氯仿定容至10ml，再加入磷酸盐缓冲液(pH5.8)5ml，溴麝香草酚兰1ml，振摇，静置使分层，分别吸取下层液4.0、5.0、6.0、7.0、8.0ml，氯仿定容至10ml。空白溶液的制备：取20ml具塞试管，不加川芎嗪对照品，加氯仿10ml，再加入磷酸盐缓冲液(pH5.8)5ml，溴麝香草酚兰1ml，振摇，静置使分层，取下层氯仿层液作空白对照。

取上述对照品溶液及空白溶液，于415nm波长处测定其吸光度值。以对照品溶液的浓度为横坐标(X)，以相应的吸光度A为纵坐标(Y)，得回归方程：Y＝0.3304X-0.1523，相关系数γ＝0.9995。川芎嗪的标准曲线如图3所示。

供试品溶液的制备：精密称取超临界提取物100mg，置于10ml棕色容量瓶中，用氯仿稀释至刻度，精密吸取5ml，置于15ml具塞试管中，用氯仿定容至10ml，再加入磷酸盐缓冲液(pH5.8)5ml，溴麝香草酚兰1ml，振摇，取下层氯仿层液，作为供试品溶液。

含量测定：分别取空白溶液、供试品溶液，于415nm波长处测定其吸光度值，以标准曲线法计算超临界提取物中总生物碱的含量。

本发明对理化性质相差很大的三个有效部位总苯酞类、总有机酸类、总生物碱类采用超临界梯度提取。第一梯度中，由于总苯酞类成分亲脂性强，因此总苯酞类成分一般采用纯的超临界CO₂在低温低压的条件下提取，这具有其他提取方法不可取代的优势；第二梯度中，由于在高温高压下超临界提取有一定极性的总有机酸(阿魏酸)需采用适宜的夹带剂，以改变超临界CO₂的极性，以利于目标成分的提出，优化的条件萃取温度和压力较高，分离温度也较高；第三梯度中，对于极性较大的总生物碱则需加入夹带剂及碱化剂，在高温高压下超临界提取，同时采用相对较高的CO₂流速。

本发明采用超临界梯度提取，依次从当归与川芎的混合药材中提取总苯酞类、总有机酸类、总生物碱类，得到总有效部位的提取物，其中总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为80～96％。本发明所采用的提取方法工艺简单，省时，得到的提取物纯度较高。该提取物可作为当归与川芎混合药材的总有效部位进一步开发制剂产品。

附图说明

图1是藁本内酯的标准曲线；

图2是枸橼酸ΔpH/ΔV～平均V滴定曲线；

图3是川芎嗪的标准曲线。

具体实施方式

实施例1：

将当归与川芎的混合药材(1:1)粉末(40目)200g投入超临界萃取装置的1L的萃取釜中，用超临界CO₂进行梯度萃取。

药材先经第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分，萃取条件为：萃取温度为45℃，萃取压力为25MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为2.0h，分离釜I的温度和压力分别为50℃和8MPa，分离釜II的温度和压力分别为30℃和6MPa。

取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分，采用的夹带剂为90％乙醇300ml，萃取条件为：萃取温度为70℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为45℃和8MPa，分离釜II的温度和压力分别为40℃和6MPa。

取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入100ml15％的氨水溶液碱化1h后，进行第三梯度总生物碱的提取，采用的夹带剂为无水乙醇300ml，萃取条件为：萃取温度为70℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为40L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为45℃和8MPa，分离釜II的温度和压力分别为35℃和5.0MPa。

合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度法测定总苯酞类的含量得到总苯酞类的含量为38％，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总有机酸的含量得到总有机酸的含量为6％，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量得到总生物碱的含量为52％，因此得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为96％。

实施例2：

将当归与川芎的混合药材(1:2)粉末(40目)200g投入超临界萃取装置的1L的萃取釜中，用超临界CO₂进行梯度萃取。

药材先经第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分，萃取条件为：萃取温度为40℃，萃取压力为30MPa，CO₂流速为45L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为40℃和7.0MPa，分离釜II的温度和压力分别为20℃和6.5MPa。

取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分，采用的夹带剂为80％乙醇200ml。萃取条件为：萃取釜温度60℃，压力40MPa；分离釜I温度55℃，压力9MPa；分离釜II温度40℃，压力6.0MPa；CO₂流速为35L/h；萃取时间为1.0h。

取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入80ml1％的氨水溶液碱化1h后，进行第三梯度总生物碱的提取，夹带剂为80％乙醇200ml。萃取条件为：萃取釜温度75℃，压力30MPa；分离釜I温度50℃，压力10MPa；分离釜II温度40℃，压力6.0MPa；CO₂流速为50L/h；萃取时间为1.0h。

合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量，得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为92％。

实施例3：

将当归与川芎的混合药材(1:0.5)粉末(40目)200g投入超临界萃取装置的1L的萃取釜中，用超临界CO₂进行梯度萃取。

药材先经第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分，萃取条件为：萃取温度为50℃，萃取压力为20MPa，CO₂流速为20L/h，萃取时间为3.0h，分离釜I的温度和压力分别为30℃和6.0MPa，分离釜II的温度和压力分别为40℃和5.5MPa。

取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分，采用的夹带剂为无水乙醇400ml。萃取条件为：萃取釜温度75℃，压力30MPa；分离釜I温度45℃，压力6.0MPa；分离釜II温度30℃，压力5.0MPa；CO₂流速为20L/h；萃取时间为2.0h。

取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入200ml 30％的氨水溶液碱化1h后，进行第三梯度总生物碱的提取，夹带剂为90％乙醇400ml。萃取条件为：萃取釜温度60℃，压力40MPa；分离釜I温度40℃，压力7MPa；分离釜II温度30℃，压力5.5MPa；CO₂流速为30L/h；萃取时间为2.0h。

合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量，得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为89％。

实施例4

将当归与川芎的混合药材(1:1)粉末(40目)200g投入超临界萃取装置的1L的萃取釜中，用超临界CO₂进行梯度萃取。

药材先经第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分，萃取条件为：萃取温度为45℃，萃取压力为25MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为2.0h，分离釜I的温度和压力分别为50℃和5MPa，分离釜II的温度和压力分别为30℃和5MPa。

取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分，采用的夹带剂为甲醇100ml，萃取条件为：萃取温度为80℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为35L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为50℃和10MPa，分离釜II的温度和压力分别为50℃和6MPa。

取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入40ml15％的氨水溶液碱化1h后，进行第三梯度总生物碱的提取，采用的夹带剂为甲醇100ml，萃取条件为：萃取温度为80℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为20L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为55℃和10MPa，分离釜II的温度和压力分别为35℃和5.0MPa。

合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量，得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为90％。

实施例5

将当归与川芎的混合药材(1:2)粉末(40目)200g投入超临界萃取装置的1L的萃取釜中，用超临界CO₂进行梯度萃取。

药材先经第一梯度超临界CO₂提取总苯酞类成分，萃取条件为：萃取温度为45℃，萃取压力为25MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为2.0h，分离釜I的温度和压力分别为50℃和5MPa，分离釜II的温度和压力分别为30℃和5MPa。

取经第一梯度提取后的药渣进行第二梯度超临界CO₂提取总有机酸成分，采用的夹带剂为90％乙醇350ml，萃取条件为：萃取温度为70℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为30L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为45℃和6MPa，分离釜II的温度和压力分别为40℃和6MPa。

取经第一、第二梯度提取后的药渣，加入150ml15％的氨水溶液碱化1h后，进行第三梯度总生物碱的提取，采用的夹带剂为无水乙醇350ml，萃取条件为：萃取温度为60℃，萃取压力为35MPa，CO₂流速为40L/h，萃取时间为1.5h，分离釜I的温度和压力分别为45℃和8MPa，分离釜II的温度和压力分别为35℃和5.0MPa。

合并第一、二、三梯度的超临界提取物。采用如上文所述的分光光度法测定总苯酞类的含量，采用如上文所述的酸碱滴定(返滴定)法测定总有机酸的含量，采用如上文所述的酸性染料比色法测定总生物碱的含量，得到总有效部位(总苯酞类+总有机酸类+总生物碱类)的含量为94％。