从紫锥菊提取物纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的方法

摘要

本发明公开了一种从紫锥菊提取物纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的方法。以市售3－5％的紫锥菊提取物为原料，按原料和水的质量比为1∶2－5加水溶解，过滤，加酸调节pH为1－4；将上样液加到装有非极性大孔吸附树脂层析柱中；依次用三种不同梯度的洗脱液洗脱，收集6－45柱体积洗脱液为单咖啡酰酒石酸，收集60－100柱体积的洗脱液为菊苣酸；加酸将洗脱液调节至酸的体积分数为0.05－1.0％，用95％的乙醇解吸，经减压蒸干，即可得到纯度高于70％单咖啡酰酒石酸和含量高于75％的菊苣酸，最后通过重结晶得到纯度大于95％的单咖啡酰酒石酸和菊苣酸产品。方法简单快捷，所用洗脱液成本低，能实现工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从紫锥菊提取物纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的方法。具体地说是用不同浓度酸溶液梯度洗脱同时或单个纯化单咖啡酰酒石酸和菊苣酸方法。

背景技术

紫锥菊的主要成分包括菊苣酸和单咖啡酰酒石酸，经研究菊苣酸具有免疫调节功能，抗炎作用，并能抑制透明质酸酶，抗病毒，还具有抑制HIV-1和HIV-1整合酶的作用。故目前已成为国际上受到普遍关注的一种免疫促进剂和免疫调节剂。目前已有紫锥菊提取物供应，但是其中菊苣酸的含量比较低，一般只有4％左右，这种低含量提取物限制了菊苣酸的进一步开发利用。Nigel B.Perry等人(J.Agric.Food Chem，2001，49(4)：1702-1706)利用制备色谱制得了纯度95％的菊苣酸对照品。但是制备色谱设备要求高、不易放大，成本高，试剂有毒害，故只能用于生产标准品，而不能够进行工业化生产。而单咖啡酰酒石酸是紫锥菊中的一个重要抗氧化剂，也是葡萄酒中重要的抗氧化活性物质，对于单咖啡酰酒石酸其他性质的研究还不多，是一个很有研究潜力的物质。现有技术中还没有能从紫锥菊同时提取纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从紫锥菊提取物中同时或单个纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的工艺。以避免使用昂贵的制备色谱，所用试剂对环境无污染，使高纯度菊苣酸能实现工业化生产和进一步开发利用。本发明的另一个目的还在于实现对单咖啡酰酒石酸的单个产品实现进一步的研究和开发利用。

本发明包括以下步骤：

(一)分离纯化：

(1)上样液的处理：以市售3-5％的紫锥菊提取物为原料，按原料和水的质量比为1：2-5加水溶解，过滤，滤渣用水洗涤1-2次，合并滤液，加酸调节pH为1-4；

(2)不同梯度洗脱液的配置：配置三种不同梯度的酸溶液作为洗脱液，所述三种不同梯度的酸溶液的体积分数分别是：A洗脱液＝0.05％-0.1％；B洗脱液＝0.03％-0.04％；C洗脱液＝0.01％-0.02％；

(3)上柱：将处理好的非极性大孔吸附树脂湿法装入玻璃层析柱中，先用4-8倍柱体积的A洗脱液平衡大孔吸附树脂，然后以1柱体积/2-3min的速度将上样液加到层析柱中；

(4)洗脱：依次用上述三种不同梯度的洗脱液洗脱20-30柱体积，最后用50-60柱体积的自来水洗脱；

(5)洗脱液的收集，收集6-45柱体积洗脱液为单咖啡酰酒石酸，收集60-100柱体积的洗脱液为菊苣酸；

所述作为洗脱液的酸溶液是盐酸水溶液或硫酸水溶液或醋酸水溶液。

所述大孔吸附树脂的体积与原料质量之间的比为7：1-10：1。

(二)洗脱液的吸附和解吸：

(1)单咖啡酰酒石酸洗脱液：加酸将洗脱液调节至酸的体积分数为0.05-1.0％，然后以1柱体积/2-3min的速度通过非极性的大孔吸附树脂，吸附完全后，用2-3柱体积的95％的乙醇解吸，再将洗脱液减压蒸干，即为单咖啡酰酒石酸粗产品；

(B)菊苣酸洗脱液加酸将洗脱液调节至酸的体积分数为0.05-1.0％，然后将其以1柱体积/2-3min的速度通过非极性大孔吸附树脂，等吸附完全后，用2-3柱体积的95％的乙醇解吸，再将洗脱液减压蒸干，即为菊苣酸粗产品；

(三)产品的重结晶纯化：

(1)菊苣酸的重结晶：将粗提物溶于5％的乙醇水溶液，用酸调节pH在1-2的范围，将温度升高至85-95℃，再冷却至4℃进行重结晶，得到纯度大于95％的菊苣酸产品；

(2)单咖啡酰酒石酸的重结晶：将单咖啡酰酒石酸粗产品溶于5％的乙醇水溶液，用酸调节pH在1-3，将温度升高至85-95℃，然后冷却至4℃进行重结晶，得到纯度大于95％的的单咖啡酰酒石酸的产品。

本发明以价格便宜的大孔吸附树脂为载体，并用pH梯度洗脱的方法先得到纯度高于70％的单咖啡酰酒石酸和含量高于75％的菊苣酸粗品，再通过重结晶的方法，得到纯度大于95％的单咖啡酰酒石酸和菊苣酸产品。既可同时得到二种产品，也可应用于单个产品的纯化和制备，其洗脱剂为含少量酸的水溶液，洗脱成本低廉，工业废液容易处理，大孔吸附树脂重复使用10次时性能也没有明显改变，再次洗脱的溶剂为可以回收的有机溶剂，能有效的节约生产成本，能使菊苣酸和单咖啡酰酒石酸实现工业化生产和进一步的研究和开发利用。

附图说明

图1为梯度洗脱时单咖啡酰酒石酸和菊苣酸的分离曲线；

图2为原料洗脱液的色谱图；

图3为单咖啡酰酒石酸洗脱液的色谱图；

图4为菊苣酸洗脱液的色谱图。

具体实施方式

实施例1：

(一)分离纯化：

(1)上样液的处理：取3.755g 4％的紫锥菊提取物，加水18mL，超声提取30min使之溶解，减压抽虑，滤渣加4mL水洗涤，合并滤液，加入18％的盐酸1mL，使pH在1-4之间；即得上样液。

(2)不同梯度洗脱液的配置：用盐酸配置三种不同梯度的洗脱液，盐酸体积分数分别是：A洗脱液＝0.07％；B洗脱液＝0.03％；C洗脱液＝0.015％。

(3)上柱：将处理好的hpd100非极性大孔吸附树脂湿法装入50cm×1.0cm的玻璃层析柱中，大孔吸附树脂的体积为35cm³，用5倍柱体积(BV)的A洗脱液平衡大孔吸附树脂，然后每1BV/2-3分钟的速度将上样液加到层析柱中。

(4)洗脱：分别用A、B、C三种洗脱液各洗脱20BV，然后再用50BV的自来水进行洗脱，用高效液相色谱监测单咖啡酰酒石酸和菊苣酸的浓度。

(5)洗脱液的收集，收集6-45BV洗脱液为单咖啡酰酒石酸，收集60-100BV的洗脱液为菊苣酸；

(二)洗脱液的吸附和解吸：

在含有单咖啡酰酒石酸的洗脱液中加入浓盐酸，至盐酸体积比为0.5％，以1BV/2min的速度流经装有hpd100非极性的树脂的玻璃层析柱，等吸附完全后，采用2-3BV的95％的乙醇解吸，解析率在98％以上，然后将解吸液减压蒸干，得到102mg单咖啡酰酒石酸粗产品，纯度为70.74％，收率95.54％。

在含菊苣酸的的洗脱液中加入浓盐酸，至盐酸体积比为0.2％，以1BV/2min的速度流经装有中极性的树脂hpd400的玻璃层析柱，然后用95％的乙醇2BV进行解吸，将解吸液用旋转蒸发减压浓缩，得到182mg菊苣酸粗产品，纯度为77.35％，收率为97.23％。

(三)产品的重结晶纯化：

将单咖啡酰酒石酸粗产品放入5ml的离心式管中，加入1ml含乙醇5％的水溶液，将温度90℃重结晶，得到单咖啡酰酒石酸62mg，纯度为97.21％，收率为76.54％。

将菊苣酸粗产品溶于5％的乙醇水溶液，然后用酸调节pH在1-2的范围，将温度升高至85-95℃，然后冷却至4℃进行重结晶，得到菊苣酸产品141mg；纯度95.43％，收率为89.76％。

实施例2：

(一)分离纯化：

(1)上样液的处理：取2000g4％的紫锥菊提取物，加水5200mL，搅拌使之溶解，减压抽虑，滤渣加400mL的水洗涤，合并滤液，加入50％的盐酸500mL，即得上样液。

(2)不同梯度洗脱液的配置：用硫酸配置三种不同梯度的洗脱液，硫酸体积分数分别是：A洗脱液＝0.05％；B洗脱液＝0.03％；C洗脱液＝0.01％。

(3)上柱：将处理好的大孔吸附树脂湿法装入玻璃层析柱(100cm×8.0cm)中，大孔吸附树脂的体积为13500cm³，用5倍柱体积(BV)A洗脱液平衡大孔吸附树脂，然后以3-10分钟每1BV的速度将上样液加到层析柱中。

(4)分别用A、B、C三种洗脱液各洗脱20BV，然后再用50BV的自来水进行洗脱，用高效液相色谱监测单咖啡酰酒石酸和菊苣酸的浓度，收集6-45BV的洗脱液为单咖啡酰酒石酸部分，收集60-100BV的洗脱液为菊苣酸部分。

(二)洗脱液的吸附和解吸：

在含有单咖啡酰酒石酸的洗脱液中加入洗脱液体积比0.15％的硫酸，以1BV/3min的快速流经装有非极性的树脂如hpd100的玻璃层析柱，然后用95％的乙醇2BV进行洗脱，将洗脱液用旋转蒸发减压浓缩，得到53.80g单咖啡酰酒石酸粗产品，纯度为71.25％，收率95.83％

将含菊苣酸的洗脱液按体积比加入0.2％硫酸，以1BV/3min的快速流经装有中极性的树脂如hpd100的玻璃层析柱，然后用95％的乙醇2BV进行洗脱，将洗脱液用旋转蒸发减压浓缩，得到103.02g菊苣酸粗产品，纯度为75.83％，收率为97.65％。

(三)产品的重结晶纯化：

将单咖啡酰酒石酸粗产品重结晶，得到35.56g产品，纯度为96.21％，收率为85.54％。将菊苣酸重结晶，得到纯度为96.63％的产品78.10g，收率为94.34％。

实施例3：

(一)分离纯化：

(1)上样液的处理：取3000g4％的紫锥菊提取物，加水8000mL，搅拌使之溶解，减压抽虑，滤渣加450mL的水洗涤，合并滤液，加入50％的盐酸500mL，即得上样液。

(2)不同梯度洗脱液的配置：用醋酸配置三种不同梯度的洗脱液，醋酸体积分数分别是：A洗脱液＝0.1％；B洗脱液＝0.04％；C洗脱液＝0.02％。

(3)上柱：将处理好的大孔吸附树脂湿法装入玻璃层析柱(100cm×8.0cm)中，大孔吸附树脂的体积为1350cm³，用5倍柱体积(BV)A洗脱液平衡大孔吸附树脂，然后以3-10分钟每1BV的速度将上样液加到层析柱中。

(4)分别用A、B、C三种洗脱液各洗脱20BV，然后再用50BV的自来水进行洗脱，用高效液相色谱监测单咖啡酰酒石酸和菊苣酸的浓度，收集6-45BV的洗脱液为单咖啡酰酒石酸部分，收集60-100BV的洗脱液为菊苣酸部分。

(二)洗脱液的吸附和解吸：

在含有单咖啡酰酒石酸的洗脱液中加入洗脱液体积比0.15％的醋酸，以1BV/3min的快速流经装有非极性的树脂如hpd100的玻璃层析柱，然后用95％的乙醇2BV进行洗脱，将洗脱液用旋转蒸发减压浓缩，得到81.48g单咖啡酰酒石酸粗产品，纯度为70.85％，收率96.22％

将含菊苣酸的洗脱液按体积比加入0.2％醋酸，以1BV/3min的快速流经装有中极性的树脂如hpd100的玻璃层析柱，然后用95％的乙醇2BV进行洗脱，将洗脱液用旋转蒸发减压浓缩，得到156.09g菊苣酸粗产品，纯度为74.94％，收率为97.48％。

(三)产品的重结晶纯化：

将单咖啡酰酒石酸粗产品重结晶，得到55.01g产品，纯度为95.71％，收率为87.75％。将菊苣酸重结晶，得到纯度为96.97％的产品116.05g，收率为93.78％。