一种水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706及其编码蛋白与应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻组蛋白去甲基化酶基因及其编码蛋白与应用。本发明提供了一种新的水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706，该基因失活可导致水稻花发育异常，内、外颖壳发育异常或缺失，种子变小，用western blot方法检测发现其有去除组蛋白H3K9me3和H3K9me2位点甲基化的酶活性。本发明提供了这个基因的核酸序列以及其蛋白序列与其应用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻组蛋白去甲基化酶基因及其编码蛋白与应用。本发明提供了一种新的水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706，该基因失活可导致水稻花发育异常，内、外颖壳发育异常或缺失，种子变小，用western blot方法检测发现其有去除组蛋白H3K9me3和H3K9me2位点甲基化的酶活性。本发明提供了这个基因的核酸序列以及其蛋白序列与其应用。

背景技术

组蛋白修饰相关的酶在动植物生长发育过程中起到重大作用，例如常见的杂种优势、核仁显性、春化作用、Paramutation、转基因沉默、转座子激活、基因组印记、DNA甲基化、RNA编辑以及X染色体失活等均发现有此类酶的参与。这类酶包括组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDAC)，组蛋白甲基转移酶(Histone methyltransferases，HMT)以及最近才发现的组蛋白去甲基化酶(Histone demethylase，HDM)，这些修饰酶类的功能在动物以及酵母等模式生物中研究的较为清楚，但目前在植物中特别是单子叶模式植物水稻中研究的较少。已经取得的一些成果证实这些组蛋白修饰酶对植物生长发育起着重要的作用。

组蛋白去甲基化酶(Histone demethylase，HDM)是最近几年发现的一类组蛋白修饰酶基因(Klose，R.J等，JmjC-domain-containing proteins and histone demethylation.Nat.Rev.Genet.(2006)，7，715-727.)，可以移除被甲基化修饰的组蛋白尾部的甲基，与组蛋白甲基转移酶(HMT)的功能相反。近期在人类中新发现JmjC家族成员(含有共同的Jumonji C(JmjC)结构域家族基因)具有组蛋白去甲基化酶的功能，并且有位点特异性(Klose，R.J等，Regulation of histone methylation by demethylimination anddemethylation.Nature reviews，(2007)，8，307-318)。

通过生物信息学发现水稻(Oryza sativa)JmjC家族有约20个成员，拟南芥有21个JmjC家族成员。其中先前的研究证实AtRef6基因控制拟南芥的开花时间(Noh，B等，Divergent roles of a pair ofhomologous jumonji/zinc-finger-class transcription factor proteins in the regulation ofArabidopsis flowering time.Plant Cell，(2004)，16，2601-2613.)，但并没有证实该基因具有组蛋白去甲基化酶的活性或与这种酶活性相关。Saze等通过筛选突变体，发现含有jmjC结构域的基因IBM1突变失活可引起BONSAI基因DNA甲基化增加(Saze，H等，Control of genic DNA methylation by a jmjCdomain-containing protein in Arabidopsis thaliana.Science，(2008)，New York，N.Y 319，462-465.)，证明含jmjC结构域基因IBM1可控制基因的DNA甲基化。然而到目前为止，未见有文献报道含jmjC结构域基因在水稻中的功能。

通过对本申请人突变体数据库的搜索并验证(详细过程参见具体实施方式)，OsJMJ6有两个等位突变体，分别命名为jmj6-1和jmj6-2，它们插入同一个intron的不同位置，田间表型观察发现两个等位突变体花发育异常，内、外颖壳发育异常或缺失，种子变小，经PCR检测为共分离，RT-PCR检测发现突变体中OsJMJ6基因无表达，western blot分析发现突变体中组蛋白修饰水平与野生型相比发生了很大的变化，突变体中组蛋白H3K9me2和H3K9me3修饰位点甲基化积累，而H3K9me1水平恰恰相反。已有的结果显示OsJMJ6为组蛋白H3K9位去甲基化酶，并且与水稻花发育相关。

目前已基本阐明双子叶植物花器官发育遗传调控的分子机理，但对单子叶植物花器官发育调控尚知之甚少。作为单子叶模式植物，水稻的花在单子叶植物花器官中也具有代表性。对OsJMJ706突变体的深入研究，将从新的角度来阐述水稻花发育调控的分子机理。

通过对水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706的功能研究，为探明其与植物花发育的关系以及基因转录调控机理过程中有重要的意义，另外还有望为作物遗传与育种提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是克隆一个新的水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706及其编码蛋白。

本发明是这样实现的：

申请人克隆得到水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706，该基因的具有如序列表所述的核苷酸序列之一：

序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。

本发明中的SEQ ID NO：2所示的蛋白质属於水稻组蛋白去甲基化酶JMJ706，其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。因此，本发明也包括与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有60％以上(包括60％)同源性的功能类似物。

更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1.是本发明克隆的OsJMJ706基因的基因组DNA序列，序列全长共2577bp。

序列表SEQ ID NO：2.是OsJMJ706基因的编码的蛋白质序列。

图1.是本发明克隆的OsJMJ706基因突变体的照片。图中：

A.上面是野生型ZH11，下面是两个等位突变体jmj6-1和jmj6-2；

B.与野生型(左)相比，突变体(右边两个)缺失内外稃；

C.与野生型(左)相比，突变体(右边两个)缺失内稃；

D.与野生型(左)相比，成熟的突变体种子(右边两个)缺失内稃，种子外突且比野生型小；

图2.是本发明克隆的OsJMJ706基因的结构并显示T-DNA插入位点。

图中起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出，黑色方框表示OsJMJ706基因的外显子区，方框之间的线条表示内含子，T-DNA插入在第1个内含子内。F1，R1，F2和R2分别表示用来验证共分离的引物。F3和R3为验证RNA转录水平的引物。

图3.是T1代突变体植株的共分离检测结果，引物如图2所示，NTLB5为T-DNA右端引物。图中：

A.18株突变体jmj6-1阳性检测结果，ZH11为对照。其中1、3、11、12、14、16为纯合插入突变体，表现出图1中所描述的表型；

B.20株突变体jmj6-2阳性检测结果，ZH11为对照。其中8、12、15、17、18、20为纯合插入突变体，表现出图1中所描述的表型；

图4.是RT-PCR检测野生型ZH11以及纯合(-/-)与杂合(+/-)突变体中OsJMJ706的mRNA转录情况，引物为图2所标示的F3和R3，actin作为对照。

图5.体内检测OsJMJ706组蛋白去甲基化酶的活性。提取野生型ZH11和突变体jmj6-2植物的组蛋白，以左侧所示的11种抗体进行western blot检测，底部为考马斯亮蓝染色组蛋白作为上样量对照。

具体实施方式

本发明是利用T-DNA插入突变体的技术进行基因的功能分析。在水稻T-DNA插入突变体数据库(http://rmd.ncpgr.cn/)中寻找OsJMJ706的插入突变体，找到两个等位T-DNA插入突变体，它们都插入在基因的第一个内含子内。对这两个等位突变体株系进行止常田间条件的筛选，得到了表型稳定的水稻花发育等位突变体jmj6-1和jmj6-2(见图2所示)，该突变体在正常田间条件下种植时表现为水稻花发育异常，内、外颖壳发育异常或缺失，种子变小的性状。利用已经分离得到的侧翼序列在基因组中设计引物，验证了这个T-DNA序列和突变表型是共分离的，从而可以确定这个基因的失活造成了这种突变表型的出现。

实施例1：突变体植株共分离检测及表达分析

1、水稻材料

本实施例所采用的水稻(Oryza sativa ssp.)原始野生型材料为中国公开推广应用的一个水稻品种“中花11”粳稻品种(ZH11)，也是水稻T-DNA插入突变体数据库(http://rmd.ncpgr.cn/)使用的一个受体材料。为查找OsJMJ706的T-DNA插入突变体，申请人用OsJMJ706基因序列(见本发明克隆的基因序列如SEQ IDNO：1所示)在水稻T-DNA插入突变体数据库(http://rmd.ncpgr.cn/)网站分析工具(http://rmd.ncpgr.cn/blast.cgi？nickname＝)进行BLAST分析(Zhang J等，a rice mutant databasefor functional analysis of the rice genome.Nucl.Acids Res.，2006，34：D745-748)，找到两个等位突变体，原始编号为03Z11F083和05Z11D089，为方便起见，申请人重新命名为jmj6-1(03Z11F083)和jmj6-2(05Z11D089)。

2、T-DNA插入侧翼序列与突变表型的共分离检测

为了研究T-DNA的遗传分离，分别种植带有T-DNA插入标记的两个等位突变体家系水稻jmj6-118株和jmj6-2 20株的T1代植株(见图3)并分析其T-DNA插入的基因型。将从总共38株T1代(见图3)的水稻幼嫩叶中提取的基因组DNA用作基因型分析，以确定它们的纯合或杂合性。水稻基因组DNA抽提方法为常规抽提方法，参考(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)。PCR反应条件：94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，总共进行35个循环。下述编号分别为F1、R1、F2、R2的引物以及NTLB5(如图2所标示)用于PCR反应。

引物F1：

5’--TTACCTTAGACCGGGCCAC--3’

引物R1：

5’--GGCGGATTCAGATTGAGGAT--3’

引物F2：

5’--TGACTTGGTTGGGACTTGCC--3’

引物R2：

5’--TGACTTGGTTGGGACTTGCC--3’

引物NTLB5(T-DNA边缘特异性引物)：

5’--AATCCAGATCCCCCGAATTA--3’

如图2的示意图所示引物F1、F2是来源于OsJMJ706基因内含子的正向引物，引物R1、R2是来源于基因内含子的反向引物。引物NTLB5也是来源于T-DNA区域边缘特异性引物。引物NTLB5分别和R1、R2组合扩增得到约0.5Kb的PCR片段，只有这种扩增片断的T1代植物是纯合子，这是因为通过引物F1和R1或F2和R2组合扩增由于片段太大而不能扩增DNA片段(T-DNA插入片段约14kb)。但是，野生型植物能够利用引物F1和R1或F2和R2组合来得到单个0.4kb左右的PCR片段，这是由于在基因组中没有T-DNA插入，而杂合的T1植物可分别得到0.5kb和0.4kb的PCR扩增物。

实验结果如图4所示。对于jmj6-1来说，图中1、3、11、12、14、16为纯合插入突变体，2、4、5、6、7、8、10、11、13、17、18为杂合体。9、15为野生型。对于jmj6-2来说，8、12、15、17、18、20为纯合插入突变体，2、4、5、6、7、9、11、14、16、为杂合体。1、3、10、13、19为野生型。这些结果显示，T-DNA已经被共分离至下一代。将T1代的子代种植得到T2代，分析后发现，纯合突变体不再分离，表型一致，杂合子出现3：1的表型分离，PCR检测表明T-DNA的插入与突变表型共分离。由此证明，这两个等位突变体是由于T-DNA插入造成的单位点隐性突变。

3、对OsJMJ706两个等位突变体的表型分析

两个等位突变体与野生型相比，发现突变体花发育异常，内、外颖壳发育异常，有些缺失内颍，并且种子变小，但不影响种子萌发，应该是胚乳发育受到影响。

4、表达分析检测突变体mRNA转录情况

为了检测等位突变体jmj6-1和jmj6-2植株中目标基因的表达量，申请人用RT-PCR方法(参见：《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)对野生型ZH11和突变体jmj6-1和jmj6-2植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自上述三个水稻材料剑叶期的叶片，RNA抽提用试剂是购自Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAse I 2u，10x DNAse I buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：取①配制的混合液1 10μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mMMg2+1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃ 2分钟，②94℃1分钟，③58℃ 1分钟，④72℃1分钟，⑤从②—④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。RT-PCR用到的OsJMJ706基因的引物(如图2所标示)为：

引物F3：

5’--GTGGTTGAGCAGGGCAGTTC--3’

引物R3：

5’--TTGATGGAACAAGCGTATGAAAG--3’

表达分析结果如图4所示，结果显示在野生型和杂合突变体(+/-)植株中可以检测到OsJMJ706的转录本，而在两个纯合等位突变体(-/-)中检测不到其转录本，表明花发育异常的突变表型是由OsJMJ706基因的插入突变失活所引起的。

实施例2：突变体体内组蛋白修饰情况分析

由于OsJMJ706基因含有Jumonji家族特有的jmjC和jmjN结构域，并且已有报道其人类同源基因JMJD2家族基因有组蛋白H3K9以及H3K36位点的去甲基化酶活性，为检测OsJMJ706基因是否具有去甲基化酶的活性，申请人利用western blot方法(参考《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)对野生型ZH11和突变体jmj6-2体内组蛋白修饰情况进行了检测。具体步骤如下：

1、组蛋白抽提方法

分别取播种后40天左右的野生型ZH11和突变体jmj6-2的叶片4-5片，液氮研磨后放入3倍体积的组蛋白抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5；2mM EDTA；0.25M HCl；5mM2-mercaptoethanol；0.2mMPMSF)中充分混匀，经12000g，4℃离心10分钟后，吸取上清于另一新离心管，按体积加入三氯乙酸至终浓度为25％，17000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀用丙酮洗涤三次，晾干后溶解于上样缓冲液(62.5mMTris-HCl，pH6.8；2％ SDS；25％ glycerol；0.01％ Bromophenol Blue；10％ β-mercaptoethanol)中，经浓度为15％的SDS-PAGE电泳可检测抽提效果，电泳采用Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN3电泳槽系统，按照其说明书进行操作。

2、利用不同组蛋白修饰的抗体对野生ZH11和jmj6-2进行western blot分析

将提取好的组蛋白进行western检测，western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统，按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2％(质量体积比)小牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L，pH7.5)对膜封闭两小时以上，然后以体积比1:10000加入不同的抗体室温孵育两小时左右。所用抗体为：Upstate公司购买的抗H3K9ace(07-352)、H3K9me2(07-441)、H3K9me3(07-442)、H3K27me2(07-322)、H3K36me2(07-274)、H3K4me1(07-436)和H3K4me3(07-473)抗体，以及Abcam公司购买的抗H3K9me1(ab9045)、H3K36me1(ab9048)、H3K36me3(ab9050)和H3(ab1791)抗体(括号内为货号)。倒掉一抗后，用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1:10000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购自SouthernBiotech公司)，室温孵育1-2小时，然后用PBS洗膜三次，每次15分钟，使用SuperSingnal Pico(购自Pierce公司)试剂盒按说明书操作方法进行X光片显影，经扫描仪扫描X光片后分析结果。

结果如图5所示，从考马斯亮蓝染色和以H3抗体进行western的结果来看，野生型ZH11和突变体jmj6-2蛋白质上样量基本相同，在这种情况下，相对于野生型来讲，突变体jmj6-2在以下几个位点的组蛋白修饰水平未发生明显的变化：H3K9ace、H3K27me2、H3K36me2、H3K4me1、H3K4me3、H3K36me1和H3K36me3，而H3K9me2和H3K9me3修饰水平明显升高，H3K9me1修饰水平有所降低，说明OsJMJ706具有H3K9me2和H3K9me3位点去甲基化酶的活性，由于突变体中此基因的失活，导致突变体组蛋白H3K9me2和H3K9me3位点甲基化积累，从而在用western blot检测时表现为比野生型高，而H3K9me1水平恰恰相反。这一结果有力的证明OsJMJ706的体内组蛋白H3K9位去甲基化酶的活性。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ706及其编码蛋白与应用

<130>

<141>2008-08-08

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2577

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2577)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2577)

<223>

<400>1

<210>2

<211>858

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2