尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。本发明所提供的试剂盒包括尿膀胱癌抗原校准品、尿膀胱癌抗原单克隆抗体包被的固相载体、尿膀胱癌抗原单克隆抗体酶标记物、上述酶作用的化学发光底物和浓缩洗涤液。该试剂盒的制备方法包括以下步骤：1)配制校准品；2)包被固相载体；3)以酶标记抗体；4)配制化学发光底物液；5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述各组分，最后将各组分组装为成品。本发明的试剂盒为膀胱癌的诊断提供重要的方法和依据。

说明书

技术领域

本发明公开了一种尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法，属于免疫分析医学领域。

背景技术

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，90％以上为移行细胞癌，膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，多发生于50-70岁之间。其中80％以上为表浅肿瘤，有10％～20％发展为浸润性膀胱癌。目前对膀胱癌诊断和术后复查主要靠膀胱镜和尿细胞学检查。膀胱镜检查虽然准确，但难以发现原位癌或扁平癌；尿细胞学检查虽无创，且特异性较好，但敏感性低，对于分期较低、分化较好的肿瘤，其敏感性仅为30％或更低，而且受诊断医师主观因素的影响较大。膀胱镜和尿脱落细胞学检查的局限性限制了对膀胱癌诊断的应用，故寻求新的诊断方法十分必要。因此许多学者在宏观、微观乃至基因水平上不懈地探索，发现了尿膀胱癌抗原(UBC)这一膀胱肿瘤瘤标物。

UBC的实质为膀胱肿瘤来源的CKs片段8和18，目前，UBC的免疫检测方法主要是酶联免疫吸附实验，但其灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。本发明采用化学发光法检测UBC，具有仪器设备简单、操作方便，灵敏度高，线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点。用本方法检测UBC，对浸润性膀胱肿瘤敏感性较酶联免疫吸附实验高，而且对早期、分化较好的肿瘤，其敏感性也较高，特异性基本和酶联免疫吸附实验相符。

本发明解决了传统检测方法敏感性不高、步骤繁琐、仪器要求高、技术要求高、患者痛苦等缺点，又较酶联免疫实验灵敏度大大提高，临床上进行该项检测能评估分级和预测膀胱肿瘤的复发，能帮助治疗和提高预后。UBC虽不能单独用于膀胱肿瘤的诊断，也不能替代膀胱镜检查，但能根据其结果适当减少和延长膀胱镜检查的次数和时间，可作为膀胱镜检查的重要辅助手段。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种使用化学发光免疫分析法定量测定尿膀胱癌抗原试剂盒，本发明还提供一种制备上述试剂盒的方法，其为：

本发明的尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒由尿膀胱癌抗原校准品、尿膀胱癌抗原单克隆抗体包被的固相载体、尿膀胱癌抗原单克隆抗体酶标记物、上述酶所作用的化学发光底物、以及浓缩洗涤液组成。

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺；所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2--二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star；所述浓缩洗涤液为Tris-HCL洗涤液或PBST洗涤液。

本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：1)配制尿膀胱癌抗原校准品；2)以尿膀胱癌抗原单克隆抗体包被固相载体；3)以酶标记尿膀胱癌抗原单克隆抗体；4)配制上述酶所作用的化学发光底物液；5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述尿膀胱癌抗原校准品、酶标记的尿膀胱癌抗原单克隆抗体、该酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液，最后将各组分组装为成品。

根据本发明的方法，所述包被固相载体包括以下步骤：

在包被缓冲液中加入尿膀胱癌抗原单克隆抗体制成工作液，将其负载于固相载体上，4℃过夜，用封闭液封闭。

其中包被缓冲液选用0.046M pH4.6的柠檬酸缓冲液。

封闭液选用PBS缓冲液。

在上述方法中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

在上述方法中，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在上述方法中，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。

在上述方法中，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。

在上述方法中，所述浓缩洗涤液为Tris-HCL洗涤液或PBST洗涤液。

发明人采用了辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)两个系统进行实验研究，用HRP或ALP对抗体进行标记，然后加入待测抗原使之结合，HRP或ALP催化发光底物使之分解而产生发光信号。HRP作用的底物为鲁米诺、异鲁米诺衍生物，此类物质价格便宜，基本实现了国产化，是当前在临床应用最广的一类发光剂。ALP作用的底物为1，2-二氧乙烷类衍生物(AMPPD)，它是一种新型的化学发光剂，属二氧杂环丁烷类，性能十分稳定，5℃下保存的固体AMPPD几乎不分解。本发明通过使用化学发光增强剂，增强了化学发光的强度，延长发光时间。

尿膀胱癌抗原单克隆抗体酶标记物采用辣根过氧化物酶标记尿膀胱癌抗原单克隆抗体时，使用改良过碘酸钠法进行标记；尿膀胱癌抗原单克隆抗体酶标记物采用碱性磷酸酶标记尿膀胱癌抗原单克隆抗体时，使用戊二醛法进行连接标记。

尿膀胱癌抗原单克隆抗体包被固相通过物理吸附作用完成。本发明人考察了不同缓冲体系对尿膀胱癌抗原单克隆抗体在固相上的物理吸附效率。

本发明试剂盒以其高精确度、高灵敏度、操作步骤简单、技术和仪器要求不高、成本低廉等显著优点，解决了购买进口试剂盒价格高的问题，又较酶联免疫试剂盒灵敏度高，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。

图2为分别使用本发明的试剂盒与酶联免疫试剂盒测定临床血样对比图。

具体实施方式

实施例1 尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒的制备

一、酶标抗体制备

辣根过氧化物酶标记尿膀胱癌抗原单克隆抗体采用改良过碘酸钠法制备，用酶标抗体稀释液以1：4000工作浓度稀释酶标抗体；

(1)辣根过氧化物酶标记尿膀胱癌抗原单克隆抗体的制备

取10mg HRP加1ml0.1mol/L醋酸钠或水溶解，充分混匀，约5分钟后加0.08mol/L NaIO₄，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内20分钟，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21％ NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇(AR)沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80％冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇，沉淀用PH9.6的0.05mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊或马抗人IgG(内含蛋白量20mg左右)，搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mg NaBH₄混匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50％饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01mol/LPBS3ml溶解，转入透析袋中用生理盐水透析除盐(需换液5次)，如有沉淀需离心除去，上清呈淡棕色即为酶结合物。加60％甘油PBS，—20℃以下保存。

(2)酶标抗体稀释液配方：

 

磷酸二氢钠0.2g磷酸氢二钠2.9g氯化钠8.8g水解明胶10gProclin3001.0mL食品红1.0mL

 

蒸馏水1000mL

二、尿膀胱癌抗原校准品的配制

以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入尿膀胱癌抗原纯品配制而成。制备的最终浓度为：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

三、固相包被板的制备

(1)包被

采用0.046M pH4.6的CT缓冲液与适当浓度的尿膀胱癌抗原单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

具体地，所述包被方法为：

 

柠檬酸三钠7.3g柠檬酸4.44g蒸馏水1000mL

溶解混匀后，调整pH值至4.6，加入5.0mg尿膀胱癌抗原单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110μL，4℃过夜。

(2)封闭

封闭液配方为：

 

NaH₂PO₄·2H₂O0.2gNa₂HPO₄·12H₂O2.9g牛血清白蛋白10gProclin30010g双蒸水1000mL

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为7.0，甩掉包被液后，每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，室温除湿干燥24小时。立即进行封袋，后置2～8℃保存。

四、化学发光底物液

本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

化学发光底物A液：

 

鲁米诺10mM1.7716g4-羟基联苯0.3mM0.051g4-碘苯硼酸0.05mM0.012g硼酸11.4g硼砂4.9g双蒸水1000mL

pH值为8.0～10.0

化学发光底物B液：

 

过氧化脲3.5mM0.329gNa₂HPO₄·12H₂O51.58gNaH₂PO₄·2H₂O8.74gTween200.1％1mL双蒸水1000mL

pH值为7.0～7.6

使用方法：使用前将A液与B液按1：1比例混合后使用。

五、浓缩洗涤液

辣根过氧化物酶所使用的浓缩洗涤液

 

Na₂HPO₄·12H₂O58gNaH₂PO₄·2H₂O2gNaCl160gTween-201mLProclin 3001mL

 

双蒸水1000mL

调整pH至7.2～7.4

使用前用双蒸水稀释20倍使用。

六、半成品及成品组成

将上述步骤所得产品分装即为半成品，经抽检合格后组装为成品，4℃保存。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，然后对包被方法进行了研究，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，找到最佳的浓度条件，并且，配制出了能够使酶标记物长期保持活性的酶标抗体稀释液。

实施例2 尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒的制备

除以戊二醛法将碱性磷酸酶与尿膀胱癌抗原单克隆抗体连接，用酶标抗体稀释液以1：2000稀释酶标记物，采用成分为Tris(24g)、HCl(15mL)、NaCl(160g)、KCl(4g)、双蒸水(1000mL)、pH值为7.4的Tris-HCl浓缩洗涤液和以CSPD为发光底物液外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的定量测定试剂盒。

实施例3～4制备本发明的尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒

除分别以塑料珠、塑料管作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的定量测定试剂盒。

实施例5 制备本发明的尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒

除以磁性颗粒作为载体，以经典戊二醛法将尿膀胱癌抗原单克隆抗体连接于磁性颗粒表面外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的定量检测试剂盒。

实施例6 本发明的试剂盒的使用方法

实施例1所述试剂盒的使用方法如下：

1)平衡所有检测试剂和样本至室温；

2)取需用量的板条；

3)每孔、管依次加入25μL校准品/待测样本；

4)每孔、管依次加入酶标记物100μL，于微量振荡器上振荡30秒使其混合均匀；

5)37℃温育60min；

6)用稀释后的浓缩洗涤液洗板5次，将固定在固相载体上的包被抗体—抗原—酶标抗体复合物与未结合物分离；

7)每孔、管加入体积为100μL的化学发光底物液，室温避光反应5min，在5～15min内利用化学发光检测仪进行检测；

8)使用Log(x)-Log(y)的双对数数据拟合方式，进行标准曲线的建立，计算实验测定结果。

实施例7 本发明的试剂盒的使用方法

实施例2所述试剂盒的使用方法除酶标记物采用碱性磷酸酶，发光底物液用量为50ul/孔，室温避光反应30min后用化学发光仪测量外，其余均与实施例6所述使用方法相同。

实施例8 本发明的试剂盒与酶联免疫试剂盒的方法学鉴定比较

本发明试剂盒按实施例5所述使用方法进行实验，酶联免疫试剂盒为外购，严格按期说明说步骤使用，两种试剂盒的性能评价指标见表1。

表1 两种诊断试剂盒的性能指标评价

由表1数据分析，本发明“尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的精密性、特异性和稳定性均达到酶联免疫试剂盒水平。并且，灵敏度显著优于酶联免疫试剂盒。

实施例9 本发明的尿膀胱癌抗原化学发光免疫分析定量测定试剂盒与酶联免疫试剂盒比较

收集医院确诊膀胱移行细胞癌患者血清50份，泌尿系良性疾病患者血清20例，正常人血清200份。分别使用本发明实施例1的试剂盒和酶联免疫试剂盒进行血样检测，统计实验结果并进行相关分析，相关系数R＝0.9456。对比实验结果见表2。

表2 本发明试剂盒与酶联免疫试剂盒的临床实验比对

由表2数据分析可知，在70份膀胱移行细胞癌患者中，用本发明试剂盒检出68份阳性，酶联免疫试剂盒检出66份阳性，本发明试剂盒的临床符合率要高于酶联免疫试剂盒；在泌尿系良性疾病患者中，本发明试剂盒出现2份阳性，酶联免疫试剂盒出现3份阳性，其中一份病人是确诊为尿道感染，另一份为肾小球肾炎，而酶联免疫试剂盒出现1份假阳性，说明在诊断膀胱移形细胞癌是要与泌尿系良性疾病鉴别诊断；在正常人血清中，本发明试剂盒出现1份阳性，而酶联免疫试剂盒出现3份阳性，再次证明本发明试剂盒的临床符合率高于酶联免疫试剂盒。综上所述，本发明试剂盒明显优于酶联免疫试剂盒，为膀胱癌患者的诊断提供更为可靠的依据。