用于预防、诊断及治疗戊型肝炎病毒的多肽,及它们作为诊断试剂和疫苗

摘要

本发明涉及对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，用于编码HEV－ORF2多肽的DNA分子，含有该DNA分子的表达载体，含有CDR多肽的抗体分子，用于编码CDR多肽的DNA分子，及它们的用途，尤其是在戊型肝炎预防、诊断及治疗方面的用途，如作为戊型肝炎的诊断试剂和疫苗。

说明书

发明领域

本发明涉及对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，用于编码HEV-ORF2多肽的DNA分子，含有该DNA分子的表达载体，含有CDR多肽的抗体分子，用于编码CDR多肽的DNA分子，及它们的用途，尤其是在戊型肝炎预防、诊断及治疗方面的用途，如作为戊型肝炎的诊断试剂和疫苗。

背景技术

戊型肝炎病毒(HEV)是作为一种肠道传染性非甲非乙型肝炎的致病因子而在1983年首先被发现的(Balayan et al.，1983.Intervirology 20：23)。戊型肝炎主要流行于亚洲、非洲、中美洲的发展中国家，发达国家中的病例主要见于外来移民或出国旅行者中，可以以散发形式存在，也可出现大流行。从五十年代到九十年代间，先后有数次由于饮水污染导致的戊型肝炎暴发流行(Visvanathan，1957.Indian J.Med.Res.(Suppl.).45：1-30；Wong et al.，1980.Lancet.2：882-885；Myint et al.，1985.Am J Trop Med Hyg.34：1183-1189；Belabbes et al.，1985.J Med Virol.16：257-263；Hau et al.，1999.Am J Trop Med Hyg.60：277-280)。HEV感染多为自限性过程，少有慢性化，但当孕妇感染戊型肝炎时后果较为严重，病死率可高达17％以上(Tsega et al.，1992.Cl in.Infec Dis.14：961-965；Dilawari et al.，1994.Indian J Gastroenterol.13：44-48；Hussaini et al.，1997.J Viral Hepat.4：51-54)。

发展血清HEV抗体检测试剂的必要性早已被广大研究人员所认识，但由于感染者或感染动物的HEV病毒分泌浓度极低而几乎不可能作为血清检测试剂的抗原来源，而迄今HEV的细胞培养的效率仍极低，同样也无法得到足够量的抗原用于检测试剂。

1991年，研究者首次获得了HEV的全长基因组序列，发现其为单股正链无包膜RNA病毒(Tam et al.，1991.Virology 185：120-131)。对HEV基因组的序列分析表明，约7.2kb的病毒基因组含有三个开放读码框架(ORF)。位于5’末端的ORF1编码病毒非结构蛋白，位于3’末端的ORF2编码病毒主要结构蛋白。ORF3的5’端与ORF1的3’端有1个碱基的重叠，3’端与ORF2有339个碱基的重叠。ORF3被认为编码另一个功能尚不明确的结构蛋白。(Tam et al.，1991.Virology185：120-131；Aye et al.，1992.Nucleic Acids Res.20：3512；Ayeet al.，1993.Virus Genes.7：95-109；Huang et al.，1992.Virology.191：550-558；Reyes et al.，1993.Arch Virol Suppl.7：15-25)。

过去HEV感染的检测主要依赖于免疫电镜技术(IEM)或免疫荧光技术，然而，这些检测技术十分繁杂，价格昂贵，而且在多数实验室难以完成。在HEV基因组克隆和测序完成之后，发展出了更灵敏的检测技术如酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白印迹试验(Western blot)和聚合酶链反应(PCR)等，用于HEV感染相关标志物的检测。

ELISA技术使用HEV重组蛋白或合成多肽作为抗原检测HEV相关抗原/抗体的存在。重组蛋白多选自HEV-ORF2和HEV-ORF3的羧基端，合成多肽选用的多为HEV-ORF2上的几个线性表位。

最近的研究已发现源于HEV-ORF2的氨基端和羧基端的重组多肽片段可以自组装成病毒样颗粒(VLP)(Li et al.，1997.J Virol71：7207-7213)。虽然颗粒较小，但这些病毒样颗粒在形态上和在抗原性上与感染性病毒的衣壳蛋白均相近(Li et al.，1997.J Virol71：7207-7213；Xing et al.，1999.Virology 265：35-45)。基于这些发现，看来重组多肽组装成病毒样颗粒的基本要素与全长HEV结构蛋白组装成感染性病毒颗粒的衣壳基本相同。值得注意的是，这些发现提示ORF2编码的结构蛋白本身就已足够组装出病毒衣壳。进一步看，衣壳蛋白的形成本身可能出现在全长ORF2蛋白的从112位氨基酸到608位氨基酸的结构域的相互作用之下(Xing et al.，1999.Virology 265：35-45)。而ORF2氨基端的111氨基酸可能主要与病毒核酸进入衣壳有关，然而这一区域显然并不直接参与病毒衣壳的形成本身。

发明简述

本发明的目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其氨基末端位于第一个序列(其来源于戊型肝炎病毒第二读码框架且序列如后面所示)的225位至459位氨基酸之间，其羧基末端位于第一个序列的578位氨基酸至610位氨基酸之间。

本发明的再一目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其氨基末端位于第一个序列的374位至429位氨基酸之间，其羧基末端位于第一个序列的578位氨基酸至610位氨基酸之间。

本发明的另一目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其氨基末端位于第一个序列的394位至429位氨基酸之间，其羧基末端位于第一个序列的578位氨基酸至610位氨基酸之间。

本发明的另一目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其序列为第二个序列。

本发明的另一目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其序列为第三个序列。

本发明的另一目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其序列为第四个序列。

本发明的另一目的是提供对戊型肝炎病毒(HEV)有高度免疫活性的多肽或其二聚体或三聚体，其序列为第五个序列。

本发明同时还涉及上述多肽的同源多肽和/或衍生多肽。

本发明的另一目的是提供DNA分子，其序列编码上述之一的戊型肝炎病毒第二读码框架多肽。

本发明的另一目的是提供重组表达载体，其中包含上述DNA分子。

本发明的另一目的是提供单克隆抗体，HE1F6，或其片段，特异性地与上述HEV-ORF2多肽结合，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞系1F6分泌，所述杂交瘤细胞系的细胞保藏号为_______

本发明的另一目的是提供杂交瘤细胞系，分泌一种单克隆抗体HE1F6，该单克隆抗体可特异性地与上述HEV-ORF2多肽结合，细胞保藏号为_________

本发明的另一目的是提供上述单克隆抗体HE1F6的互补性决定区(CDR)的多肽，及含有所述CDR多肽的抗体分子或其片段。

本发明的另一目的是提供用于免疫个体免受戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，包含至少一种加在药物学上可接受的佐剂中的上述重组蛋白质。

本发明的另一目的是提供用于免疫个体免受戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，包含至少一种加在药物学上可接受的佐剂中的序列为第六个序列的多肽。

本发明的另一目的是提供用于免疫个体免受戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，包含至少一种上述DNA分子。

本发明的另一目的是提供一种检测戊型肝炎病毒感染的方法，其包括用一定数量的至少一种上述多肽，与包含抗体的样本接触。

本发明的另一目的是提供一种检测戊型肝炎病毒感染的方法，其包括至少一种上述抗体分子或其片段。

本发明人经研究发现，氨基端位于第一个序列的225位至459位氨基酸之间，其羧基末端位于第一个序列的578位氨基酸至610位氨基酸之间的HEV-ORF2多肽；更好是氨基末端位于第一个序列的374位至429位氨基酸之间，羧基末端位于第一个序列的578位氨基酸至610位氨基酸之间的HEV-ORF2多肽；更好是氨基末端位于第一个序列的394位至429位氨基酸之间，羧基末端位于第一个序列的578位氨基酸至610位氨基酸之间的HEV-ORF2多肽；更好是序列为第二个序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列为第三个序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列为第四个序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列为第五个序列的HEV-ORF2多肽；更好是序列为第六个序列的HEV-ORF2多肽，通过合适的原核表达载体在大肠杆菌(E.coli)中表达出的这些HEV-ORF2多肽，去除了全长HEV-ORF2的N端部分氨基酸，同时去除了HEV-ORF2的C端部分氨基酸，从而在E.coli中表达出的重组蛋白能形成病毒样颗粒，具有高度免疫活性，并均暴露出一个与感染性病毒表面天然构相相近的构相型抗原表位，该表位可与一个识别构相表位的单克隆抗体所特异结合，这一表位的相应抗体在HEV感染的早期即可出现，因此可以作为HEV疫苗及HEV感染检测试剂。

本发明同时还利用表达出的上述重组蛋白免疫小鼠，制备出了几株HEV-ORF2特异的单克隆抗体。单克隆抗体HE3F5特异识别上述HEV-ORF2多肽上的一个线性表位，而单克隆抗体HE1F6特异识别HEV-ORF2多肽上的一个构相型表位。

本发明同时提供了一种疫苗组合物，包含序列为第六个序列的HEV重组蛋白，以氢氧化铝作为佐剂，免疫动物可产生良好抗体反应，可保护实验动物免受HEV感染。

本发明同时还提供了一个HEV抗体检测药盒，以上述重组蛋白作为抗原，检测标本中的HEV抗体。另外还使用上述单克隆抗体提供了一个HEV近期感染检测药盒。

详细描述

术语解释

除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。在本发明中，除另外指出，以下名词的含义应为：

“戊型肝炎病毒，”或“HEV，”是指一种病毒，病毒类型，或病毒类别，(I)它引起来源于水的传染性肝炎；(II)它在血清学特性上不同于甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、和丁型肝炎病毒(HDV)；(I II)该病毒含有一个同源于插入pTZKF1(ET1.1)中之1.33kb cDNA的基因组区域，所述质粒由ATCC寄存登记号67717的大肠杆菌菌株BB4携带。

如果使用有突变缺口矩阵和缺口障碍数为6或更大的ALIGN程序，得出两个氨基酸序列或两个核苷酸序列具有调准比数大于5(标准偏差单位)，则可认为他们是同源的(参见Dayhoff，M.O.，Atlas ofprotein sequence and structure(1972)Vol.5.NationalBiomedical Research Foundation，pp101-110，以及该卷增刊2.pp.1-10)。用上文所述的ALIGN程序进行最大调准时如果两个序列)或它们的一部分，最好至少有30个氨基酸长)的氨基酸大于或相当于有50％相同，则它们有更好的同源性。

如果一个多肽序列包含有权利要求1至7所述多肽序列，但其N端和/或C端带有其他非所述多肽本身的相邻序列的其他氨基酸，而得到的多肽的抗原性、免疫原性等生物学性质仍然类似，则称该多肽为权利要求1至7所述多肽的衍生多肽，其相应的DNA分子称为衍生DNA。如为利于表达而在权利要求1至7所述多肽序列的N端加上起始氨基酸甲硫氨酸或其他引导肽和/或信号肽，或在C端加上几个组氨酸以利于纯化等。

本发明所述的第一序列为：

第一个序列

1     Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met PheLeu Pro Met         16

     17    Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg ArgArg Gly Arg         32

     33    Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp ArgVal Asp Ser         48

     49    Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn ProPhe Ala Pro         64

     65    Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg Val ArgGln Pro Ala         80

     81    Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln Ala Gln ArgPro Ala Ala         96

     97    Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala Gly Ala Ala ProLeu Thr Ala        112

     113   Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp ValAsp Ser Arg        128

     129   Gly AlaIle Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr SerPro Leu Thr        144

     145   Ser Ser Val Ala Thr Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr AlaAla Pro Leu        160

     161   Ser Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr HisIle Met Ala        176

     177   Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala ArgAla Thr Ile        192

     193   Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly TyrAla Ile Ser        208

     209   Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr SerVal Asp Met        224

     225   Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val GlnPro Gly Ile        240

     241   Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His TyrArg Asn GLn        256

     257   Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu GluGlu Ala Thr        272

     273   Ser Gly Leu Val Met Leu CysIle His Gly Ser Pro ValAsn Ser Tyr        288

     289   Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu AspPhe Ala Leu        304

     305   Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr AsnThr Arg Val        320

     321   Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg ArgGly Ala Asp        336

     337   Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg PheMet Lys Asp        352

     353   Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile GlyArg Gly Ile        368

     369   Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu GlyGly Leu Pro        384

     385   Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly GlyGln Leu Phe TyrSer Arg Pro        400

     401   Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu TyrThr Ser Val        416

     417   Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro HisAsp Ile Asp        432

     433   Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp AsnGln His Glu        448

     449   Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg ProPhe Ser Val        464

     465   Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr AlaAla Glu Tyr         480

     481   Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val TyrVal Ser Asp         496

     497   Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln AlaVal Ala Arg         512

     513   Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg ProLeu Ser Thr         528

     529   Ile Gln GlnTyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro LeuArg Gly Lys         544

     545   Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly TyrPro Tyr Asn         560

     561   Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu AsnAla Ala Gly         576

     577   His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu GlyAla Gly Pro         592

     593   Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His SerVal Leu Ala         608

     609   Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala HisThr Phe Asp         624

     625   Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln GlyCys Ala Phe         640

     641   Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met LysVal Gly Lys         656

     657             Thr      Arg     Glu     Leu       ***661

HEV重组蛋白

HEV重组多肽

多肽414-603，序列为第四个序列，位于第一个序列的414位氨基酸至603位氨基酸。

第四个序列：

Thr Ser Val

Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp IleAsp

Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGlu

Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe SerVal

Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyr

Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAsp

Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArg

Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThr

Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLys

Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsn

Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGly

His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyPro

ValS er Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

多肽459-603，序列为第七个序列，位于第一个序列的459位氨基酸至603位氨基酸。

第七个序列：

Ser Arg Pro Phe Ser Val

Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyr

Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAsp

Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArg

Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThr

Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLys

Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsn

Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGly

His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyPro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

多肽429-603，序列为第五个序列，位于第一个序列的429位氨基酸至603位氨基酸。

第五个序列：

His Asp Ile Asp

Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGlu

Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe SerVal

Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyr

Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerAsp

Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArg

Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThr

Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLys

Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsn

Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGly

His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyPro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

多肽394-603，序列为第三个序列，位于第一个序列的394位氨基酸至603位氨基酸。

第三个序列：

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

     His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly Pro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

多肽374-603，序列为第八个序列，位于第一个序列的374位氨基酸至603位氨基酸。

第八个序列：

Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro

     Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr SerArg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val ValIle Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

     His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly Pro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

多肽225-603，序列为第九个序列，位于第一个序列的225位氨基酸至603位氨基酸。

第九个序列：

     Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln ProGly Ile

     Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr ArgAsn Gln

     Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu GluAla Thr

     Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val AsnSer Tyr

     Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp PheAla Leu

     Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn ThrArg Val

     Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg GlyAla Asp

     Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe MetLys Asp

     Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly ArgGly Ile

     Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly GlyLeu Pro

     Thr Glu LeuIle Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr SerArg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp GlyArg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

     His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly Pro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

多肽394-606，序列为第二个序列，位于第一个序列的394位氨基酸至606位氨基酸。

第二个序列：

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro LeuArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

     His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly Pro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Val

多肽394-610，序列为第十个序列，位于第一个序列的394位氨基酸至610位氨基酸。

第十个序列：

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

   Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile AlaIle Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

     His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGlyPro

     Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser ValLeu Ala

Leu Leu

多肽394-593，序列为第十一个序列，位于第一个序列的394位氨基酸至593位氨基酸。

第十一个序列：

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

     His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly AlaGly Pro

Val

多肽394-583，序列为第十二个序列，位于第一个序列的394位氨基酸至583位氨基酸。

第十二个序列：

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys GlyIle Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

His Arg Val Ala Ile Ser Thr

多肽394-578，序列为第十三个序列，位于第一个序列的394位氨基酸至578位氨基酸。

第十三个序列：

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

     Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr ThrSer Val

     Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIle Asp

     Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn GlnHis Glu

     Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro PheSer Val

     Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala AlaGlu Tyr

     Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr ValSer Asp

     Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala ValAla Arg

     Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro LeuSer Thr

     Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu ArgGly Lys

     Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr ProTyr Asn

     Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn AlaAla Gly

His Arg

多肽193C，序列为第六个序列，其第一位氨基酸为甲硫氨酸，其后为第一个序列的394位氨基酸至578位氨基酸的多肽。

第六个序列：

Met Thr Ser Val

Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His AspIleAsp

Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln HisGlu

Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe SerVal

Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala GluTyr

Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val SerA sp

Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val AlaArg

Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu SerThr

Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg GlyLys

Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro TyrAsn

Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala AlaGly

His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala GlyPro

Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro

本发明同样也涉及上述多肽的同源多肽及衍生多肽。

编码多肽的DNA分子是通过PCR方法从质粒pGEX-ORF2中扩增出来。质粒pGEX-ORF2中带有HEV-ORF2的全长编码基因。用5’端带有Nde I位点，3’端带有EcoR I位点的相应引物扩增出相应片段，插入原核表达质粒pTO-T7的Nde I/EcoR I位点中，并在大肠杆菌表达系统中进行表达。表达出的重组蛋白在N端首先是一个甲硫氨酸，其后为相应多肽序列。参见实施例1至11。

上述产生重组多肽的编码顺序也可从其他携带HEV-ORF2基因的克隆载体而来，或通过拉链PCR的方法直接人工合成而得，或是通过其他本领域内技术人员可以想见的其他方法得到。

HEV重组蛋白疫苗制备

上述HEV重组蛋白依照通常的方法制备成疫苗组合物，以提高蛋白的免疫原性。例如，在其中一个组合物，多肽193C(序列为第六个序列)吸附于氢氧化铝佐剂；在另一个组合物，多肽194-603吸附于氢氧化铝佐剂。

重组蛋白疫苗免疫方法

在一个方面，本发明提供了一种使个体免受HEV感染的方法，即给个体注入本发明的疫苗组合物，例如肌肉注射，或是皮下注射。

在该方法中使用的更好的疫苗组合物是包含HEV抗原，其序列为：

N端为一个甲硫氨酸，自第二个氨基酸开始序列为：第二个序列，或第三个序列，或第四个序列，或第五个序列，或第六个序列，或第七个序列，或第八个序列，或第九个序列，或第十个序列，或第十一个序列，或第十二个序列，或上述序列的同源序列或衍生序列。

更好的，上述疫苗组合物通过系列肌肉注射给药，例如，在0天，10天，30天给予3个剂量，或在0天，28天给予两个剂量。每个剂量可以从2μg重组蛋白到100μg重组蛋白，更好地是每个剂量5μg～10μg重组蛋白。

在细节如实施例12的方法中，用加入铝佐剂的抗原多肽414-603(N端带一甲硫氨酸)肌肉注射免疫恒河猴。三只恒河猴按0，10，30天间隔接受的3个剂量的免疫，每个剂量含10μg重组多肽414-603。通过EIA实验，在第2周时，三只猴子中的两只血清中均已可检测到明显抗体产生，另7一只在第3周也已产生抗体，在第5周时，三只猴子的血清抗体滴度均达高峰。

在第6周时，猴血清抗体滴度在1:10⁴～1:10⁵，此时用猴HEV感染性胆汁静脉注射攻击，该感染性胆汁携带大量感染性HEV病毒颗粒。攻击后定期收集血清和粪便，检测血清ALT(转氨酶)水平，检测粪便标本中排毒情况。结果连续观察2月，免疫组始终未见血清ALT水平的异常，也未检出粪便排毒。而3只未免疫对照组在攻毒30天内先后出现ALT的明显升高，黄疸，粪便排毒持续5～8周。详见实施例12。

单克隆抗体HE1F6

在细节如实施例13的方法中，以重组多肽414-603为抗原，通过本领域研究人员熟知的常规单克隆抗体制备方法，筛选出了小鼠杂交瘤细胞系HE1F6及其分泌的单克隆抗体HE1F6。该单克隆抗体特异性识别HEV-ORF2多肽上一个天然构相型表位。其证据如下：(I)用所述单克隆抗体对重组多肽414-603进行蛋白印迹实验，结果未煮沸样品见重组蛋白多聚体位置显色明显，单体部分显色微弱；而煮沸样品未见显色，说明该单克隆抗体识别表位为构相依赖型表位；(II)用所述单克隆抗体对急性期人HEV血清或猴HEV血清进行阻断实验，抑制率均在50％以上，提示其所识别表位为HEV天然表位；(III)以所述单克隆抗体进行免疫捕获PCR，结果能捕获到标本中的HEV病毒颗粒，提示该单克隆抗体识别表位暴露于天然病毒表面。

本发明提供的单克隆抗体HE1F6和/或其片段可用于检测标本中HEV抗原或抗体或病毒核酸。如用于EIA试剂盒或免疫捕获PCR。

单克隆抗体HE3F5

在细节如实施例13的方法中，以重组多肽414-603为抗原，通过本领域研究人员熟知的常规单克隆抗体制备方法，筛选出了小鼠杂交瘤细胞系HE3F5及其分泌的单克隆抗体HE3F5。该单克隆抗体特异性识别HEV-ORF2多肽上一个线性表位。其证据如下：(I)用所述单克隆抗体对重组多肽414-603进行蛋白印迹实验，结果未煮沸样品见重组蛋白单体位置显色明显强于多聚体部分，煮沸样品显色依然未见减弱，说明该单克隆抗体识别表位为线性表位；(II)用所述单克隆抗体对急性期人HEV血清或猴HEV血清进行阻断实验，抑制率在30％以上，提示其所识别表位为HEV天然表位。

本发明提供的单克隆抗体HE3F5和/或其片段可用于检测标本中HEV抗原或抗体或病毒核酸。如用于EIA试剂盒或免疫捕获PCR。

实施例

实施例1：

序列为第六个序列的多肽193C基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴文翰教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pT0-T7。

引物A：5’-CAT ATG ACA TCT GTA GAG AAT GCT CA-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’

多肽193C的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例2：

多肽459-603基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG TCG CGC CCT TTT T-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’

多肽459-603的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例3：

多肽429-603基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAT GAC ATC GAC CTC G-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’

多肽429-603的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例4：

多肽394-603基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’

多肽394-603的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例5：

多肽374-603基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG AAC CTT GCT GAC ACC CTG-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’

多肽374-603的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例6：

多肽225-603基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG AAT TCA ATA ACC TCG ACG-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA TGC GGA ATG GGG GGC-3’

多肽225-603的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为:25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例7：

多肽394-607基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA CAC AGA GTG GGG GGC TAA-3’

多肽394-606的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例8：

多肽394-610基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA AAG CAA TGC TAG CAC AGA-3’

多肽394-610的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽，将其对100倍体积的1XPBS(pH7.45)在25℃下进行透析复性，其中换液3次。离心得复性上清液，再用高效液相分子筛色谱(制备型Beckman System Gold Nouveau125NMP/166NMP)进行纯化，色谱条件为：流速4ml/分钟，1XPBS(pH7.45)洗脱，UV280nm检测。

实施例9：

多肽394-593基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCTCGT C-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA GAC GGG GCC AGC ACC CAG-3’

多肽394-593的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽。

实施例10：

多肽394-583基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA GGT GGA AAT AGC AAC CCG-3’

多肽394-583的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽。

实施例11：

多肽394-578基因的表达质粒构建：

以HEV-ORF2基因(香港大学吴教授赠送)为模板，用引物A和B，对多肽414-603基因进行PCR扩增。PCR条件为：94℃ 1分钟、57℃ 1分钟、72℃ 50秒，35个循环(BioMetra T-Gradient)。上述PCR产物经过琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱(华舜公司)纯化后，用NdeI/EcoRI克隆入质粒载体pTO-T7。

引物A：5’-CAT ATG CAG CTG TTC TAC TCT CGT C-3’

引物B：5’-GAA TTC TTA CCG ATG CCC AGC GGC ATT-3’多肽394-578的表达和纯化：将表达质粒转化入表达菌株Ecoli.ERR2566，挑取单克隆，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基37℃振荡培养过夜至OD₅₅₀＝1.0，用终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：25℃，190rpm，6小时。离心收集菌体，用细菌裂解液(50mM Tris-HCl pH7.2，5mM EDTA，300mM NaCl)悬浮，超声破碎菌体，离心收集包涵体，用含有2％ Triton X-100的溶液I(20mMTris-HCl pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)悬浮，离心收集包涵体，再分别用2M、4M、8M的尿素进行分级变性处理。其中4M尿素变性上清液含有绝大量高纯度的目的多肽。

实施例12

重组蛋白193C(序列为第六个序列)疫苗免疫恒河猴实验

取3只3-5岁龄的恒河猴作为疫苗组分别编号为1、2、3#，免疫程序为0.5ml疫苗(含10ug重组蛋白疫苗193C、0.75mg Al(OH)₃用PBS调PH至6.5)按0、10、30天三角肌单点注射，每周采血使用检测重组蛋白414-606间接ELISA法检测其IgG抗体产生情况(表1)，如表1所示，恒河猴大多在第二周产生IgG抗体，第五周达高峰。

表1 重组多肽193C免疫恒河猴的血清抗体反应

 

01w2w3w4w5w6w1#--10³10⁴10⁴10⁵10⁵2#---10²10³10⁴10⁴3#--10³10⁴10⁴10⁴10⁴

HEV攻击保护实验

在疫苗组注射重组蛋白193C疫苗6周后，再取3只3-5岁龄的恒河猴作为对照组分别编号为4、5、6#，病毒攻击程序为每只恒河猴静脉注射0.5ml胆汁(感染HEV的恒河猴胆汁1:8稀释，免疫RT-PCR半定量检测HEV-RNA达每ml病毒量在10⁸左右)，在注射含HEV的胆汁后4天开始，每天收集粪便免疫RT-PCR检测HEV-RNA，每周2次(周一、五)采血检测血清抗HEV IgG抗体(2种试剂检测，1种是用重组蛋白193C包被自己建立的间接ELISA试剂盒(193C)，另一种试剂是已通过中国药品生物制品检定所的质控血清的厦门新创科技有限公司(新创)的试剂盒，其抗原为西班牙YES公司的包括ORF2和ORF3的人工合成多肽抗原)、谷丙转氨酶(ALT)和HEV-RNA。病毒攻击观察2个月，在这期间疫苗组3只恒河猴粪便均未见有排毒，血清ALT未见升高，新创试剂盒检测抗HEVIgG抗体阴性，而193C试剂盒检测抗HEVIgG抗体为持续阳性，抗体滴度维持无明显变化，说明由193C疫苗免疫产生的抗体能够很好的中和阻断HEV的感染；而对照组4#恒河猴在攻毒后第4天开始粪便排毒，并持续至第50天才停止，血清ALT从第27天开始升高(90u)，第35天达到高峰(>400u)，第45天下降至正常未再升高，血清抗HEV IgG抗体：新创试剂盒检测结果为第31天开始检出，第35天即达高峰并持续，193C试剂盒则从第21天开始检出，第28天即达高峰，第38天开始有下降趋势；对照组5#恒河猴在攻毒后第4天开始粪便排毒，并持续至第50天才停止，血清ALT从第27天开始升高(56u)，第35天达到高峰(>400u)，第45天下降至正常未再升高，血清抗HEV IgG抗体：新创试剂盒检测结果为第28天开始检出即达高峰并持续，193C试剂盒则从第17天开始检出，呈缓慢持续升高趋势；对照组6#恒河猴在攻毒后第4天开始粪便排毒，并持续至第34天才停止，血清ALT从第7天开始升高(67u)，反复轻度升高至第24天即下降至正常未再升高，血清抗HEV IgG抗体：新创试剂盒检测结果为第31天开始检出，第36天即达高峰并持续，193C试剂盒则从第21天开始检出，第28天即达高峰。

实施例13：单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞系的产生

取6~8周龄雌性Balb/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐剂乳化的5μg414-603重组抗原(总体积50μl)。15天后，进行二次基础免疫取相同量的抗原用福氏不完全佐剂乳化，肌肉注射。30天后，尾静脉加强注射5μg不加佐剂的抗原，并于加强免疫后72~96小时，杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液(悬于RPMI 1640培养基中)，细胞记数板细胞记数。按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，混合后离心，利用聚乙二醇(PEG 1500)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。将细胞悬液与等体积的饲养细胞混合后，分置于96孔细胞培养板中(200μl/孔)。3天后，用HT培养基半保留换液。7天后，用414-603重组抗原包被板进行ELISA检测96孔细胞培养板中杂交瘤细胞上清培养液。对于EIA检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化。

ELISA检测法

于37℃下使100μl 414-603重组抗原(经HPLC纯化，溶解于0.05mol/L碳酸包被缓冲液中，浓度约为0.3μg/ml)，在12K辐射的96聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小时，再置于4℃过夜(0.05mol/L碳酸缓冲液的组成为：20.02g Na₂CO₃、2.52g NaHCO₃加去离子水至1升，pH为9.5)。用PBS-吐温(PBS-吐温的组成为：8.0gNaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl和0.5ml吐温20，加去离子水至1升，pH为7.4)洗滴定板以除去未结合的抗原蛋白。然后用200μl/孔的封闭液(封闭液的成分：于PBS溶液中加入2％明胶、0.2％络蛋白和2％蔗糖)37℃封闭2小时。甩净、拍干后真空封闭，4℃保存。

检测时，于每孔中加入100μl细胞培养液上清；每块96孔微量滴定板设一阳性对照，加入100μl小鼠多抗血清(1:100稀释使用)；另设一阴性对照，加入100μl HT细胞培养液。37℃温浴30分钟，用PBS-吐温洗5遍，拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM IgG)，37℃温浴30分钟，取出后用PBS-吐温洗5遍，拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为：13.4₂HPO₄·12H₂O、4.2g柠檬酸·H₂O和0.3g过氧化氢，用去离子水中调节体积为700ml；底物液B成分为：0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml)，37℃显色10分钟，加入50μl终止液(2M H₂SO₄去离子水定容至700ml)终止反应，并于酶标仪上检测各孔的OD₄₅₀，通常OD₄₅₀值高于阴性对照2倍以上者可视为阳性。

单克隆抗体腹水的获得及纯化

取10周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐剂，每只0.5ml。2~7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度至2×10⁵~2×10⁶个/ml，每只小鼠注射0.5ml。7~10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。3000rpm离心15分钟，吸取中间澄清部分的液体，一0.45μm的小孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。

将处理好的腹水用0.02mol/L、Ph 7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa₂HPO₄，19ml 0.2mol/L NaH₂PO₄，加生理盐水至100ml)对倍稀释，搅拌下逐滴缓慢加入ASA(硫酸铵浓度达到50％饱和度)，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入ASA使硫酸铵浓度达到33％饱和度，4℃静置过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入ASA(硫酸铵浓度达到50％饱和度)，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中，装入透析带中，放入50~100倍含20mmol/L NaCl，pH 7.8的120mmol/L Tris-HCl缓冲液中4℃搅拌下脱盐12小时左右，期间更换3次以上透析液。取出后分装-20℃保存。