佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗

摘要

虽然水包油乳液是流感疫苗的有效佐剂，但仍可通过额外加入其它免疫刺激剂来增强细胞因子应答，例如γ－干扰素应答而提高其效力。因此，疫苗包含：(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；(iii)细胞因子诱导剂。

说明书

本文引用的所有文件全文纳入本文作为参考。

技术领域

本发明属于用佐剂配制疫苗来提供保护以抵御流感病毒感染的领域。

背景技术

目前常规使用的流感疫苗一般不含佐剂。参考文献1的第17和18章详细描述了这些疫苗。它们基于活病毒或灭活的病毒，灭活疫苗可以基于完整的病毒、“裂解(split)”病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平标准化疫苗剂量，疫苗通常含有约15μg HA/毒株。

流感爆发期需要大量流感疫苗，但难以增加疫苗供应从而满足如此巨大的需求。因此，除了生产更多疫苗抗原，有人提出可以使用较低含量的抗原/毒株，同时使用佐剂来弥补减少的抗原剂量。还有人提出在流行间期采用相同的方案，从而例如能覆盖更多人群而无需提高生产水平。

有人提出可将铝盐佐剂用于流感疫苗(例如，见参考文献2-5)。利用MF59水包油乳液也已见报道[6]，希龙疫苗公司(Chiron Vaccines)的商品化FLUAD^TM产品中也用了该乳液。

本发明的目的是提供佐剂配制的其它改进流感疫苗(对于流行期和流行间期使用)和它们的制备方法。

发明内容

现已发现虽然水包油乳液是流感疫苗的优良佐剂，但仍可通过额外加入一种或多种其它免疫刺激剂来提高它们的效率。所述其它试剂不仅增加血凝滴度或抗-血凝素ELISA滴度(二者衡量免疫应答的数量)，其还起到提高应答质量的作用。具体地说，现已发现所述其它试剂能改善流感疫苗引发的细胞因子应答，例如干扰素-γ应答，改善水平远胜于只使用佐剂或该试剂时所见的。已知细胞因子应答涉及宿主抵御流感(病毒)感染的防御早期和决定阶段[7]。

因此，本发明提供包含(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；和(iii)细胞因子诱导剂的免疫原性组合物。

本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合：(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；和(iii)细胞因子诱导剂的步骤。

本发明提供装有以下组分的试剂盒：(i)包含流感病毒抗原的第一试剂盒组分；和(ii)包含水包油乳液佐剂的第二试剂盒组分，其中(a)所述第一组分和所述第二组分包含细胞因子诱导剂，或(b)所述试剂盒装有包含细胞因子诱导剂的第三试剂盒组分。

水包油乳液佐剂

已发现水包油乳液特别适用于佐剂配制的流感病毒疫苗中。已知各种这样的乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴通常直径低于5μm，甚至可具有亚微米直径，用微流化仪可实现这些小尺寸，从而能提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的油滴，因为能对它们进行过滤灭菌。

本发明可使用诸如动物来源(例如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种子和谷物。坚果油的例子是最常购得的花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，可利用从霍霍巴豆(jojoba bean)获得的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易购得的，但其它谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草(teff)、黑小麦等的油也可利用。通过水解、分离和酯化合适的坚果和种子油起始物质可制备种子油中天然不存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。本领域熟知从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它方法。大多数鱼含有不难回收的可代谢油。例如，本发明可用的几种鱼油的例子是鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油，如鲸蜡。可以5-碳异戊二烯单位通过生物化学方法合成许多支链油，这些支链油通常称为类萜。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支链不饱和类萜，这是本发明特别优选的。角鲨烷是角鲨烯的饱和类似物，其也是优选的油。包含角鲨烯和角鲨烷的鱼油不难从商业来源购得，或可通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可利用油的混合物。

可根据表面活性剂的“HLB”(亲水/亲油平衡)将其分类。优选的本发明表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAX^TM为商品名出售，例如线形EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如Tergitol^TMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(triethyleneglycol monolauryl ether)(Brij 30)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；和失水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可利用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也适用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的优选用量(重量％)是：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或曲通系列的其它洗涤剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，所述乳液的组成可以是约5％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3％角鲨烯，0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”[8-10]，如参考文献11的第10章和参考文献12的第12章所详述的。MF59乳液优选包含柠檬酸离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1％)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯:生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5：2。可将吐温80溶解于PBS中获得2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm。

·角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸缓冲液。

·含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75:11:10(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括这些组分与抗原的任何比例。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。水相可含有磷酸缓冲液。

·角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(＂Pluronic^TM L121＂)的乳液。可以用磷酸缓冲盐水，pH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用＂SAF-I＂佐剂(0.05-1％ Thr-MDP、5％角鲨烯烷、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制的苏氨酰-MDP联用[13]。也可不与Thr-MDP联用，例如用＂AF＂佐剂(5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制[14]。优选微流体化。

·乳液可具有0.5-50％的油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子表面活性剂。如参考文献15所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。

·不可代谢的油(例如，轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如，卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(例如，参考文献16所述的GPI-0100，)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N，N-二(十八烷基)-N，N-二(2-羟乙基)丙二胺。

·其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳液[17]。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[18]。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[18]。

这些乳液优选在递送之时与抗原临时混合。因此，在包装或分发的疫苗中，佐剂和抗原通常分开存放，最后在使用时即时配制。抗原一般存在水性形式，从而最终可通过混合两种液体来制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比可以不同(例如，在5:1和1:5之间)，但通常是约1:1。

抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常维持在水溶液中，但其自身可能分配在油/水界面附近。进入乳液的油相的血凝素通常极少(如果有的话)。

如果组合物包含生育酚，α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚均可用，但优选α-生育酚。生育酚可采取几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚均可用。老年患者(例如，60岁或更大)所用的疫苗中优选包含生育酚，因为据报道维生素E在该患者组中对免疫应答有正面影响[19]。它们还具有抗氧化特性，从而有助于稳定溶液[21]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。现已发现琥珀酸盐在体内能与TNF-相关的配体协作。此外，已知α-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐剂[88]。

细胞因子诱导剂

本发明组合物可包含细胞因子诱导剂，现已发现该试剂与水包油乳液混合能得到出乎意料有效的免疫原性组合物，对T细胞应答有协同作用。有报道说，就耐受流感病毒抗原性漂移而言，T细胞应答优于抗体应答。此外，T细胞效应机理可能是老年患者中疫苗诱导抵御严重疾病的保护作用的重要决定因素[22]，还可能通过更强的干扰素-γ应答来降低对流感的年龄相关易感性[23]。

给予患者时，本发明组合物中所包含的细胞因子诱导剂能引发免疫系统释放细胞因子，包括干扰素和白介素。优选的细胞因子诱导剂能引发以下一种或多种细胞因子的释放：干扰素-γ；白介素-1；白介素-2；白介素-12；TNF-α；TNF-β；和GM-CSF。优选的细胞因子诱导剂引发与Th-1型免疫应答有关的细胞因子释放，例如干扰素-γ、TNF-α、白介素-2。优选刺激干扰素-γ和白介素-2。

因此，接受本发明组合物使得患者的T细胞在用流感抗原刺激时能以抗原特异性方式释放所需细胞因子。例如，从他们的血液纯化的T细胞在体外接触流感病毒血凝素时会释放γ-干扰素。本领域已知检测外周血单核的细胞(PBMC)中这种应答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献24报道了一项研究，该项研究监测了针对破伤风类毒素的抗原特异性T细胞介导免疫应答，特别是γ-干扰素应答，发现ELISPOT是区分抗原特异性TT诱导应答与自发应答的最灵敏方法，但采用流式细胞术检测胞质内细胞因子是检测再刺激作用(re-stimulating effect)的最有效方法。

合适的细胞因子诱导剂包括但不限于：

·免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸。

·3-O-脱酰基单磷酰脂质A(“3dMPL”，也称为“MPL^TM”)[25-28]。

·咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[29、30]、瑞喹莫德(“R-848”)[31]和它们的类似物；和它们的盐(例如，盐酸盐)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节见参考文献32-36。

·缩氨基硫脲化合物，例如参考文献37披露的那些。参考文献37还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

·色胺酮化合物，例如参考文献38披露的那些。参考文献38还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

·核苷类似物，例如(a)艾沙托拉滨(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：

(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献39-41所述的化合物；(f)下式所示化合物：

式中：

R₁和R₂各自独立为H、卤素、-NR_aR_b、-OH、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R₃不存在，或是H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R₄和R₅各自独立为H、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-R_d、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R_4-5：

在所示键处实现结合。

X₁和X₂各自独立为N、C、O或S；

R₈是H、卤素、-OH、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、-OH、-NR_aR_b、-(CH₂)_n-O-R_c、-O-(C_1-6烷基)、-S(O)_pR_e或-C(O)-R_d；

R₉是H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R_9a，其中R_9a是：

在所示键处实现结合。

R₁₀和R₁₁各自独立为H、卤素、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NR_aR_b或-OH；

R_a和R_b各自独立为H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、C_6-10芳基；

R_c各自独立为H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R_d各自独立为H、卤素、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-NH(取代的C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、-N(取代的C_1-6烷基)₂、C_6-10芳基或杂环基；

R_e各自独立为H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R_f各自独立地为H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；

n各自独立为0、1、2或3；

p各自独立为0、1或2；或者

(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或该互变异构体的药学上可接受的盐。

·罗唑利宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[42]。

·参考文献43披露的化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮杂乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazole quinolinone)(ABIQ)化合物[44、45]、羟邻苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[46]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物[47]。

·polyoxidonium聚合物[48、49]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。

·参考文献50披露的化合物。

·式I、II或III所示化合物，或它们的盐：

如参考文献51所述，如′ER 803058′、′ER 803732′、′ER 804053′、′ER804058′、′ER 804059′、′ER 804442′、′ER 804680′、′ER 804764′、′ER 804057′(结构如下所示)：

或ER 803022(结构如下所示)：

·氨基烷基氨基葡糖苷磷酸盐衍生物，如RC-529[52、53]。参考文献54报道了RC-529在CD⁴⁺T细胞中刺激细胞因子应答的能力。

·磷腈，例如参考文献55和56中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](“PCPP”，poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。

·含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，例如TLR4拮抗剂E5564[57、58]：

·小分子免疫增强剂(SMIP)，例如：

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；

1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；

2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；

2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；

4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；

N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；

1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；

N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。

本发明所用的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)的调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一种或多种的激动剂。优选的诱导剂是TLR7的激动剂(例如，咪唑并喹啉类)和/或TLR9的激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。这些诱导剂可用于活化先天免疫途径。

可在组合物制备期间的各阶段加入细胞因子诱导剂。例如，可将其加入抗原组合物中，然后将该混合物加入水包油乳液中。或者，可将其加入水包油乳液中，在这种情况中可以先将诱导剂加入乳液组分中再乳化，或可先乳化再加入乳液中。类似地，诱导剂可以在乳液滴内凝聚。最终组合物内细胞因子诱导剂的定位和分布取决于其亲水/亲脂特性，例如诱导剂可位于水相中、油相中和/或油-水界面处。

可将细胞因子诱导剂与不同的药物，例如抗原(如CRM197)偶联。参考文献59概述了小分子偶联技术。或者，佐剂可以与其它药物非共价结合，例如借助疏水性或离心性相互作用。

两种优选的细胞因子诱导剂是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。

免疫刺激性寡核苷酸

免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除了dsRNA)单链。参考文献60、61和62披露了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献63-68进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[69]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN(寡聚脱氧核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献70-72讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如参考文献69和73-75。有用的CpG佐剂是CpG7909，其也称为ProMune^TM(格雷药物有限公司(Coley Pharmaceutical Group，Inc.))。

除使用CpG序列以外，还可使用TpG序列[76]。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。

免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多个连续的胸苷核苷酸(例如，参考文献76所述的TTTT)，和/或其核苷酸组成可含有>25％的胸苷(例如，>35％、>40％、>50％、>60％、>80％，等等)。例如，其可包含多个连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献76所述的CCCC)，和/或其核苷酸组成可含有>25％的胞嘧啶(例如，>35％、>40％、>50％、>60％、>80％，等等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。

免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。它们可包含少于100个核苷酸。

3dMPL

3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A)是单磷酰基脂质A中还原端葡糖胺的3位被脱酰化的佐剂。3dMPL从明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体(heptoseless mutant)制备，其在化学上类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。它活化单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，刺激几种细胞因子释放，包括IL-1、IL-12、TNF-α和GM-GSF(还可见参考文献54)。参考文献77最先描述了3dMPL的制备。

3dMPL可采取酰化程度不同的相关分子混合物的形式(例如，具有长度可能不同的3、4、5或6条酰基链)。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖的2-位碳(即，2和2’位)被N-酰基化，3’位也被O-酰基化。与碳2相连的基团如式-NH-CO-CH₂-CR¹R^1′所示。与碳2’相连的基团如式-NH-CO-CH₂-CR²R^2′所示。与碳3’相连的基团如式-O-CO-CH₂-CR³R^3′所示。代表性的结构是：

基团R¹、R²和R³各自独立为-(CH₂)_n-CH₃。n值优选在8-16之间，更优选在9-12之间，最优选10。

基团R^1’、R^2’和R^3’各自独立为：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R⁴，其中R⁴是-H或-(CH₂)_m-CH₃，其中m值优选在8-16之间，更优选10、12或14。在2位，m优选14。在2′位，m优选10。在3′位，m优选12。因此基团R^1’、R^2’和R^3’优选十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸的-O-酰基。

当R^1’、R^2’和R^3’均是-H时，3d-MPL只有3条酰基链(2、2′和3′位上各有一条)。当R^1’、R^2’和R^3’中只有两个是-H时，3d-MPL可具有4条酰基链。当R^1’、R^2’和R^3’中只有一个是-H时，3d-MPL可具有5条酰基链。当R^1’、R^2’和R^3’中无一是-H时，3d-MPL可具有6条酰基链。本发明所用3d-MPL佐剂可以是具有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但优选混合物中包含具有6条酰基链的3d-MPL，特别是要确保以重量计6酰基链形式至少占总3d-MPL的10％，例如≥20％、≥30％、≥40％、≥50％或更高。发现具有6条酰基链的3d-MPL是最有活性的佐剂形式。

因此，本发明组合物包含的3dMPL最优选形式是：

当采用混合物形式的3dMPL时，提及本发明组合物中3dMPL的用量或浓度指该混合物中混合的3dMPL诸种类。

在水性条件下，3dMPL可形成大小不同，例如直径<150nm或>500nm的胶束凝聚物或颗粒。本发明可使用任一种或二者，通过常规试验可选择较佳的颗粒。较小的颗粒因其较佳的活性而优选用于本发明(例如，足够小从而能得到3dMPL的透明水性混悬液)[78]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直径甚至可以小于100nm。然而，在大多数情况中，平均直径不会小于50nm。这些颗粒足够小，从而适于过滤灭菌。可通过动态光散射的常规技术评估颗粒直径，该技术能揭示平均颗粒直径。当说到颗粒的直径为x nm时，颗粒分布一般在该平均值附近，但以数量计至少50％(例如，≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或更多)的颗粒的直径在x±+25％范围内。

最好基本上所有3dMPL位于乳液的水相中。

疫苗中3dMPL的常见用量是10-100μg/剂，例如约25μg或约50μg。

可单独使用3dMPL，或与一种或多种其它化合物联用。例如，已知可联用3dMPL与QS21皂苷[79](包含在乳液中[80])、磷酸铝[81]或氢氧化铝[82]。

流感病毒抗原

本发明组合物包含流感病毒抗原。通常可从流感病毒颗粒制备抗原，或者可在重组宿主(例如，在利用杆状病毒载体的昆虫细胞)中表达诸如血凝素等抗原并以纯化形式使用[83、84]。然而，抗原一般来自病毒颗粒。

抗原可采用活病毒，或者更优选灭活病毒的形式。灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理：洗涤剂、甲醛、福尔马林、β-丙内酯或紫外光。灭活的其它化学方法包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它们任何的组合处理。本领域知道灭活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙烯亚胺或γ射线。INFLEXAL^TM产品是完整的病毒颗粒灭活疫苗。

如果使用灭活病毒，疫苗可包含完整的病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包含血凝素，通常还包含神经氨酸酶)。

可通过各种方法从含病毒的液体收集病毒颗粒。例如，纯化方法可包括利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有洗涤剂以使病毒颗粒破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

用洗涤剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵，等等)处理病毒颗粒，包括“吐温-醚”裂解方法来产生亚病毒颗粒制品，从而获得了裂解病毒颗粒。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如参见参考文献85-90等。通常利用破裂浓度(disrupting concentration)的裂解剂(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三-N-丁酯、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解可发生在最初的病毒颗粒纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。可将裂解的病毒颗粒有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品是裂解疫苗(split vaccine)。

纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品是亚单位疫苗。

流感抗原还可以病毒体形式存在[91]。

流感病毒可以是减毒的。流感病毒可以是温度灵敏的。流感病毒可以是冷适应的。这三种可能性特别适用于活病毒。

用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行间期，疫苗通常包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明还可利用流行毒株(即，对疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三价疫苗为基础。然而，取决于季节和疫苗中抗原的性质，本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本发明可起保护作用以抵御一种或多种甲型流感病毒NA亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。

可有用地包含在这些组合物中的其它毒株是耐受抗病毒治疗的毒株(例如，耐受奥塞米韦[92]和/或扎那米韦)的毒株，包括耐药性流行毒株[93]。

本发明佐剂配制的组合物特别适用于免疫接种以抵御流行毒株。能导致流行病爆发的流感毒株的特征在于：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出现超过10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中见到的毒株(例如，通常只在鸟群中发现的H5、H6或H9)，从而使得人群对该毒株的血凝素而言在免疫学上是原初的；(b)其能在人群中水平转移；和(c)其对人具有致病性。对于免疫接种抵御流行性流感，优选具有H5血凝素类型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出现的流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝1、HA进化枝1’、HA进化枝2或HA进化枝3[94]，其中进化枝1和3特别相关。

本发明组合物可包含一种或多种(例如，1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多种流感毒株，通常分别培养不同的毒株，收集病毒后混合来制备抗原。因此，本发明方法可包括混合多种流感毒株的抗原的步骤。

流感病毒可以是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得。反向遗传学技术[例如，95-99]能利用质粒在体外制备含所需基因组区段的流感病毒。该技术通常涉及表达(a)例如能从polI启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能从polII启动子编码病毒蛋白质的DNA分子，从而使得在细胞中表达两种类型的DNA能装配完整的感染性病毒颗粒。DNA优选能提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能利用辅助病毒提供所述RNA和蛋白质中的一些。优选质粒方法，从而能用不同质粒产生各病毒RNA[100-102]，这些方法还包括利用质粒来表达所有病毒蛋白质或其中一些(例如，只是PB1、PB2、PA和NP蛋白质)，一些方法利用了12种质粒。

为减少所需的质粒数，最近的方法[103]在同一质粒上组合了多个RNA聚合酶I转录盒(对于病毒RNA合成)(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA区段的序列)，在另一质粒上组合了含RNA聚合酶II启动子的多个蛋白质编码区(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感mRNA转录物的序列)。参考文献103所述方法的优选方面包括：(a)单独质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区；和(b)单独质粒上的所有8个vRNA编码区段。包含一个质粒上的NA和HA区段和另一质粒上的6个其它区段也是有利的。

除了用polI启动子编码病毒RNA区段，还可能用细菌噬菌体聚合酶启动子[104]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于polI启动子的种类特异性，细菌噬菌体聚合酶启动子对于许多细胞类型(例如，MDCK)更方便，虽然还必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。

其它技术可能采用双重polI和polII启动子来同时编码一个模板的病毒RNA和可表达的mRNA[105、106]。

因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是A/PR/8/34的6个区段，其中HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重配株)，特别是用卵培养病毒时。还可包含用于生产疫苗制备用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。通常，本发明保护抵御能人向人传播的毒株，因此毒株的基因组一般包含源自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一个RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区段。

可用卵(通常是SPF卵)或细胞培养物培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法利用含胚的鸡蛋以及从鸡蛋内含物(尿囊液)中纯化病毒。然而，近年来用动物细胞培养物培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选该培养方法。如果采用鸡蛋培养病毒，则可将病毒与一种或多种氨基酸一起引入鸡蛋的尿囊液中[89]。

细胞物质通常是哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)和犬细胞。可利用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，例如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38；等等。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞[107-110]；源自非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)肾脏的Vero细胞[111-113]；或源自人胚胎成视网膜细胞的PER.C6细胞[114]。这些细胞系可广泛购自，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)[115]、寇里尔细胞保藏中心(Coriell Cell Repositories)[116]或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER.C6可以保藏号96022940购自ECACC。作为哺乳动物细胞系的次选替代，可用禽细胞系培养病毒[例如，参考文献117-119]，包括源自鸭(例如，鸭视网膜)或母鸡，例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的细胞系，等等。例子包括禽胚胎干细胞[117、120]，包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[121]。

培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34购自ATCC，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，参考文献107披露了适应于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系(“MDCK 33016”，以DSM ACC 2219保藏)。类似地，参考文献122披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。参考文献123披露了非致瘤性MDCK细胞，包括“MDCK-S”(ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101”(ATCC PTA-6501)、“MDCK-SF102”(ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。参考文献124披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括“MDCK.5F1”细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

如果利用哺乳动物细胞系培养病毒，则组合物优选不含卵蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)和鸡DNA，从而能降低变应原性。

如果用细胞系培养病毒，则生长培养基以及用于启动培养的病毒接种物优选不含(即，经测试得到污染的阴性结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[125]。特别优选不含单纯疱疹病毒。

如果用细胞系培养病毒，则每剂组合物优选含有少于10ng(优选少于1ng，更优选少于100pg)的残留宿主细胞DNA，虽然可以存在痕量的宿主细胞DNA。总之，本发明组合物中的宿主细胞DNA不能长于100bp。

现在，检测残留的宿主细胞DNA是生物制品的常规要求，属于技术人员的普通能力。用于检测DNA的试验通常是确认试验[126、127]。可利用数学和可定量的术语描述确认试验的性能特征，已鉴定了其可能的误差来源。已在总体上检验了该试验的诸如准确度、精密度、特异性等特征。一旦校验(例如，用已知标准量的宿主细胞DNA)及检验好某试验，可常规进行定量DNA检测。可采用三种主要的DNA定量技术：杂交方法，例如Sourthern印迹或槽印迹[128]；免疫测定方法，例如Threshold^TM系统[129]；和定量PCR[130]。技术人员熟知这些方法，虽然各方法的精确特征取决于所研究的宿主细胞，例如杂交探针的选择，扩增用引物和/或探针的选择，等等。分子装置公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是用于皮克水平总DNA的定量试验，其已用于监测生物药品中的污染DNA水平[129]。典型的试验包括在生物素化的ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗-ssDNA抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。所有试验组分均装入购自生产商的完整的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中。各种商品化生产商提供检测残留宿主细胞DNA的定量PCR试验，例如AppTec^TM实验室服务公司(Laboratory Services)、BioReliance^TM、亚瑟技术公司(AltheaTechnologies)，等等。检测人病毒疫苗中宿主细胞DNA污染的化学发光杂交试验和总DNA Threshold^TM系统的比较见参考文献131。

可采用标准纯化方法，例如层析等在疫苗制备期间除去污染性DNA。通过核酸酶处理，例如用DNA酶可促进除去残留的宿主细胞DNA。参考文献132和133披露了降低宿主细胞DNA污染的便利方法，其涉及两步处理，首先可在病毒培养期间使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒颗粒破裂期间使用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。用烷化剂，例如β-丙内酯处理也可用于除去宿主细胞DNA，该方法还可优选用于灭活病毒颗粒[134]。

优选在每15μg血凝素中含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.25ml体积含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。更优选在每50μg血凝素中含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.5ml体积含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。

优选任何残留宿主细胞DNA的平均长度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于100bp，等等。

对于用细胞系，例如MDCK细胞培养，可用悬液培养[107、135、136]或贴壁培养的细胞来培养病毒。用于悬液培养的一种合适的MDCK细胞系是MDCK 33016(保藏号为DSM ACC2219)。或者，可采用微载体培养。

优选用无血清的培养基和/或无蛋白质的培养基培养支持流感病毒复制的细胞系。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。

支持流感病毒复制的细胞系优选在37℃以下生长[137](例如，30-36℃，或约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)，例如在病毒复制期间。

在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：给培养的细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。以病毒和细胞之比为1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10(通过PFU或TCID₅₀检测)接种培养的细胞。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40℃，优选28-37℃，在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，从而增加了收集的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约0.0001-10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数(“m.o.i.”)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。

血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平使疫苗剂量标准化，一般通过单向辐射状免疫扩散(SRID)试验检测。疫苗通常含有约15μgHA/毒株，虽然在例如儿童，或流行情况下可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3×或9×剂量[138、139])一样，已使用了部分剂量，例如1/2(即，7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8[4、5]。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg，等等。具体的剂量包括，例如约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5，等等。与本发明一样，当疫苗中存在佐剂时，这些较低的剂量最有用。

对于活疫苗，通过中值组织培养感染剂量(TCID₅₀)而不是HA含量来检测给药，每种毒株的TCID₅₀一般在10⁶-10⁸之间(优选10^6.5-10^7.5)。

本发明所用的HA可以是病毒中发现的天然HA，或者可经修饰。例如，已知可修饰HA以除去致使病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，围绕HA1和HA2之间的切割位点的超碱性区域(hyper-basic region))，否则这些决定簇可阻止病毒在卵中生长。

本发明的组合物可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)，或脱氧胆酸钠，特别是对于裂解疫苗或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗涤剂。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、α-生育酚半琥珀酸酯(α-tocopheryl hydrogensuccinate)和聚山梨醇酯80各自低于1mg/ml。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。

灭活但非全细胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包含基质蛋白，从而受益于位于该抗原内的其它T细胞表位。因此，包含血凝素和神经氨酸酶的非全细胞疫苗(特别是裂解疫苗)还可包含M1和/或M2基质蛋白。如果存在基质蛋白，优选包含可检测水平的M1基质蛋白。还可存在核蛋白。

药物组合物

本发明组合物是药学上可接受的。它们通常包含除抗原、佐剂和细胞因子诱导剂以外的组分，例如，它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这些组分的充分讨论见参考文献140。

组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，这些疫苗优选基本上不含(即，少于5μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞[88、141]。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

优选包含生理盐，例如钠盐以控制张力。优选1-20mg/ml之间的氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodiumphosphate dehydrate)、氯化镁、氯化钙等。

组合物的重量克分子渗透浓度通常在200mOsm/kg-400mOsm/kg之间，优选240-360 mOsm/kg之间，更优选处于290-310 mOsm/kg范围内。以前有报道说重量克分子渗透浓度对疫苗接种所致的疼痛没有影响[142]，但最好将重量克分子渗透浓度维持在该范围内。

组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。所含的缓冲液范围一般是5-20mM。

组合物的pH通常在5.0-8.1之间，更常见在6.0-8.0之间，例如6.5和7.5之间，或7.0-7.8之间。因此，本发明方法可包括先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。

组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。组合物优选无谷蛋白。

组合物可包含一次免疫的物质，或可包含多次免疫的物质(即，“多剂量”试剂盒)。在多剂量配置中，优选包含防腐剂。除了在多剂量组合物中包含防腐剂以外，还可将组合物置于装有用于转移物质的无菌适配器的容器中。

一般给予的疫苗剂量体积是约0.5ml，虽然可将半剂量(即，约0.25ml)给予儿童。

通常混合组合物中的抗原、佐剂和细胞因子诱导剂。

组合物和试剂盒优选保存在2℃-8℃之间。不应冷冻它们。最好避免有光直射。

本发明的试剂盒

如上所述，可以在递送时临时制备本发明组合物。因此，本发明提供装有即时混合的各组分的试剂盒。所述试剂盒将水包油乳液和抗原分别保存待用。细胞因子诱导剂可以包含在这两种试剂盒组分之一中，或者可以是第三试剂盒组分的一部分。

试剂盒内的诸组分彼此物理分离，可采用各种方法实现这种分离。例如，诸组分可处于单独的容器，例如小瓶中。然后可取出一个小瓶的内含物并将其加入另一小瓶，或者分别取出两小瓶的内含物并在第三容器中混合而混合两小瓶的内含物。

在优选的配置中，试剂盒诸组分之一存于注射器中，其它组分存于容器，例如小瓶中。可利用注射器(例如，装有针头)将其内含物注入第二容器中进行混合，然后将混合物抽入该注射器中。随后将该注射器中的混合内含物给予患者，通常利用新的无菌针头。将一种组分包装在注射器中无需利用另一注射器来给予患者。

在另一优选配置中，将两种试剂盒组分分别保存在同一注射器，例如双室注射器中，如参考文献143-150等所披露的。使用该注射器(例如，给予患者期间)之时即混合了该两室中的内含物。该配置在使用时无需单独的混合步骤。

试剂盒各组分的内含物通常均可处于水性形式。在一些配置中，某组分(一般是抗原组分而不是乳液组分)处于干燥形式(例如，冻干的形式)，另一组分处于水性形式。可以混合所述两种组分以再活化干组分，从而获得给予患者的水性组合物。冻干组分通常保存于小瓶而不是注射器内。干燥的组分可以包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置将水性乳液组分存于预填充注射器中，而将冻干抗原组分存于小瓶中。

包装组合物或试剂盒组分

本发明组合物(或试剂盒组分)的合适容器包括小瓶、注射器(例如，一次性注射器)、鼻喷雾器等。这些容器应无菌。

如果将组合物/组分存于小瓶中，所述小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选先将小瓶灭菌再加入组合物。为避免患者对乳胶过敏的问题，优选用无乳胶的塞子密封小瓶，所有包装材料最好均不含乳胶。小瓶可装有单剂量疫苗，或可装有多剂量(“多剂量”小瓶)，例如10份剂量。优选用无色玻璃制成小瓶。

小瓶可装有盖子(例如，Luer锁扣)，从而可将预填充的注射器插入盖子中，将注射器的内含物推入小瓶中(例如，重建其中的冻干材料)，再将小瓶的内含物抽回注射器中。将注射器从小瓶中取出后，装上针头，将组合物给予患者。优选使盖子位于封口或覆盖物内，从而要先除去封口或覆盖物再接触盖子。小瓶可具有盖子，从而能无菌取出其内含物，特别是对于多剂量小瓶。

如果要将某组分包装入注射器，注射器可装有针头。如果未装针头，可随注射器提供单独的针头用于装配和使用。这种针头可以是有鞘的。优选安全针头。常见的是1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器可装有可剥离标签，其上打印了批号、流感季节和内含物的有效期，从而有助于记录保管。注射器的柱塞优选具有塞子，从而能防止柱塞在抽吸期间意外掉出。注射器可装有乳胶橡胶盖子和/或柱塞。一次性注射器可含有单剂量疫苗。在装上针头之前，注射器一般装有针帽以密封顶端，所述针帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则优选给针头装有丁基橡胶罩。优选的注射器是以“Tip-Lok”^TM为商品名投入市场的那些。

可给容器做上显示半剂量体积的标记，例如以有助于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。

如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，则优选使用硼硅酸玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。

可随试剂盒或组合物装有(例如，装在同一盒子中)插页，该插页包括疫苗的细节，例如给药的使用说明书，疫苗中抗原的细节等。使用说明书还可包括警告，例如准备肾上腺素溶液以防疫苗接种后的过敏反应，等等。

治疗方法和疫苗的施用

本发明组合物适合给予人患者，本发明提供在患者体内产生免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。

本发明还提供试剂盒，或者用作药物的本发明组合物。

本发明还提供(i)流感病毒抗原；(ii)水包油乳液佐剂；和(iii)细胞因子诱导剂在制备用于在患者体内产生免疫应答的药物中的应用。

这些方法和应用产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。本领域熟知评估流感病毒疫苗接种后的抗体应答、中和能力和保护作用的方法。人类研究证明针对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用有关(血清样品血凝反应-抑制滴度约30-40时，对同源病毒感染的保护作用约为50％)[151]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单辐射免疫扩散(SRID)和/或单向辐射状溶血(SRH)检测抗体应答。本领域熟知这些试验技术。

可以各种方法给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[152-154]、口服[155]、真皮内[156，157]、透皮、经皮[158]等。

本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。流感疫苗目前推荐用于儿科和成年人免疫接种，年龄自6个月起。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(例如，≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)，年轻人(例如，≤5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，怀孕的妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奥塞米韦或扎那米韦化合物；例如磷酸奥塞米韦，参见下文)的患者，和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些团体，还可应用于更广泛的人群中。对于流行毒株，优选给予所有的年龄组。

本发明的优选组合物满足效力的CPMP标准的1、2或3条。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护作用；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5-倍。在老年人(>60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护作用；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2-倍。这些标准依据至少50位患者的标签公开研究(open label study)。

治疗可以是单剂量用药法或多剂量用药法。多剂量可以用于初次免疫接种程序表和/或加强免疫接种程序表中。在多剂量用药法中，可通过相同或不同的途径给予各种剂量，例如胃肠外致敏和粘膜加强，粘膜致敏和胃肠外加强，等等。给予多次剂量(通常是两剂量)在免疫原初患者，例如对于以前从未接受流感疫苗的人，或对于接种抵御新HA亚型的疫苗而言(例如在流行病爆发期间)特别有用。多剂量通常可间隔至少一周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周，等等)给予。

可将本发明疫苗与其它疫苗基本上同时(例如，可在医疗保健专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与以下疫苗基本上同时：麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗、肺炎球菌偶联物疫苗，等等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给予在老年患者中特别有用。

类似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，特别是有效抵御疫流感毒的抗病毒化合物(例如，奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时(例如，可在医疗保健专家的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者。这些抗病毒(化合物)包括神经氨酸酶抑制剂，例如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonic acid)，包括它们的酯(例如乙酯)和它们的盐(例如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸、乙酯、磷酸酯(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU^TM)。

概述

术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。

与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。

除非有专门表述，包括混合两种或多种组分的步骤的某方法不要求任何具体混合顺序。因此，可以任何顺序混合诸组分。如果有三种组分，则可先将两种组分彼此混合，再将该混合物与第三种组分混合，等等。

如果利用动物(特别是牛)材料培养细胞，这些材料应从不含可传染海绵样脑病(TSE)，特别是不含牛海绵样脑病(BSE)的来源获得。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。

如果将化合物作为组合物的一部分给予身体，或可用合适的前药替代该化合物。

如果将细胞物质用于重配或反向遗传学方法，优选批准用于人疫苗生产的细胞物质，例如欧洲药典概述章节5.2.3中的。

附图简述

图1-3显示了用不同组合物免疫的小鼠的Log10血清抗体滴度(ELISA)。箭头显示了包含MF59乳液的组合物。从左向右，各柱形分为：单用四种佐剂(i)到(iv)；四种CpG组合；四种R-848组合；四种ER-57组合；包含添加剂的对照；和单用两种组分(a)和(b)。因此，最左侧的箭头显示了单用MF59的结果。

图4显示了用HA刺激时获得抗原特异性细胞因子应答的CD4⁺T细胞百分比(每对的左柱)和γ-干扰素阳性的百分比(每对的右柱)。各组在X-轴上与图1-3相同。

图5显示了IgG抗H3N2毒株的GMT(AU/ml)。各对中左柱显示了IgG1；右柱显示了IgG2a。

图6显示了接受鸡蛋培养的三价抗原的小鼠中的血清抗-HA ELISA应答(2剂量后)。进行的实验分别是不含佐剂，含MF59和/或CpG7909。类似地，图7显示了同一小鼠中的抗-HA HI应答。图8显示了通过ELISA评估的抗-H3N2IgG1和IgG2a比例。

图9显示了细胞因子阳性细胞数量，以总CD4+细胞％表示。显示了两只独立小鼠的应答。用不含佐剂或用佐剂(1)、(2)或(3)配制的裂解疫苗“A”或“B”免疫小鼠。

本发明实施方式

在MDCK细胞上分别培养流感病毒毒株Wyoming H3N2(A)、New-Caledonia H1N1(A)和Jiangsu(B)。制备三价表面糖蛋白疫苗，用其在第0天和第28天以两种剂量(0.1和1μg HA/毒株)免疫免疫原初的Balb/C小鼠。在第42天采集小鼠的血液并用该血进行各种试验：HI滴度；通过ELISA测得的抗-HA应答；和以抗原特异性方式释放细胞因子的CD4⁺T细胞水平，包括单独检测释放γ-干扰素的那些细胞水平。对于IgG1或IgG2a，专门检测IgG应答。

用于免疫的组合物(除了阴性对照)包含以下之一：(i)MF59乳液，以1:1的体积比与抗原溶液混合；(ii)氢氧化铝，以1mg/ml使用并包含5mM组氨酸缓冲液；(iii)磷酸钙，以1mg/ml使用并包含5mM组氨酸缓冲液；或(iv)由聚(丙交酯-共-乙交酯)50:50共聚组合物形成的微粒，内部粘度0.4(“PLG”)，含吸附的抗原。此外(再次除了阴性对照)，组合物包含以下组分之一：(a)具有硫代磷酸酯主链的免疫刺激性CpG ODN；或(b)R-848。

分别检验了这六种组分，只有MF59乳液在两种剂量均始终提高了针对所有三种毒株的HI滴度。对于H1N1毒株，滴度比无佐剂对照高10倍以上。对于H3N2毒株，(滴度)增加在抗原剂量较低时>5倍，而在剂量较高时>10倍。对于乙型流感病毒毒株，(滴度)增加在抗原剂量较低时>3倍，而在剂量较高时>5倍。

再看各组合，对于乙型流感病毒，使用0.1μg抗原时，只有两种组合在第42天使HI滴度增加超过3倍(与无佐剂的对照疫苗相比)，这两种组合是基于MF59的组合。

对于H1N1毒株，除CpG/PLG组合以外的所有含CpG的组合使HI滴度增加至少5倍，当使用MF59/CpG组合时增加超过10倍。其它基于MF59的组合显示增加>5倍。

对于H3N2毒株，再次是所有含CpG的组合(除CpG/PLG组合以外，其使滴度增加>3倍)使HI滴度增加至少5倍。MF59/R-848和明矾/R-848组合(使滴度)增加>3倍。

因此，总体上，选项(i)-(iv)中用于增加HI滴度的最佳佐剂是水包油乳液。(a)或(b)中较佳的添加剂是CpG，虽然单用CpG并未提高HI滴度。最佳组合均以水包油乳液为基础。

图1-3显示了15组的抗-HA ELISA应答；1组无佐剂；3组含(a)和(b)；4组含(i)-(iv)；8组含(i)-(iv)/(a)-(b)的各组合。箭头显示可包含MF59水包油乳液的3种组合物。马上可以看出基于乳液的组合物获得最佳抗-HA应答。

图4显示了获得最佳T细胞应答的佐剂。再次马上可以看出基于乳液的组合物获得最佳应答。对于单用(a)和(b)，T细胞应答中等，当它们与MF59混合时观察到最佳结果。用MF59/CpG组合获得最高水平的γ-干扰素-分泌细胞，以星号表示。利用MF59/CpG组合获得的γ-干扰素-分泌细胞数目优于单用任一种组分。

虽然单用MF59佐剂主要引发Th2-型应答，但γ-干扰素分泌增加显示加入CpG使应答向Th1型转变。据报道，Th1-型应答能提高异源亚型免疫力(heterosubtypic immunity)[159]。检测IgG型时也观察到向Th1-型应答转变。如图5所示，单用MF59显示IgG1应答(Th2)强，而IgG2a应答(Th1)低。CpG显示IgG1和IgG2a应答弱。相反，MF59/CpG组合显示IgG2a应答占优势。

其它实验利用从卵培养的病毒制备的纯化表面糖蛋白，其中将MF59/CpG组合改进为利用不同的免疫刺激性寡核苷酸，即(c)CpG7909。如图6-8所示，这些实验所得的结果与以前的实验一致。具体地说，图6显示向抗原中加入MF59使抗-HA血清ELISA IgG滴度急剧增加，而单独加入CpG7909未获得相当的提高。类似地，加入CpG7909未显著地进一步提高用MF59获得的滴度。血清HI滴度基本上观察到相同的模式(图7)。然而，观察抗体应答的质量时，加入CpG7909增加了Th1-相关同种型的相对比例(图8)。

抗体数据与对抗原再激活(restimulation)特异性起反应的CD4T细胞的细胞因子分布良好相关。MF59再次导致Ag反应性T细胞(Ag-responding Tcell)的频率增加。加入CpG7909并未极大增加反应性T细胞的总体百分比，但改变了这些应答细胞产生的细胞因子的组成。因此，包含CpG7909时，产生IFN-γ的Ag-特异性T细胞比例较高，而产生IL-5的细胞比例较低。

在其它实验中，获得了两种可商品化购得的无佐剂裂解病毒颗粒三价流感疫苗(“SPLIT(A)”和“SPLIT(B)”)，将它们用于免疫小鼠。稀释疫苗从而获得0.2μg各HA的剂量。疫苗是无佐剂的，或用以下佐剂配制：(1)氢氧化铝，(2)MF59乳液，或(3)MF59乳液和免疫刺激性CpG寡核苷酸。用这些疫苗肌肉内免疫8组雌性Balb/C小鼠，8周龄，在第0天和第28天(注射)50μl剂量。在第14天和第42天获得血清，分析抗-HA滴度(IgG)、HI滴度和T细胞。

下表I给出了第42天针对各病毒的血清IgG抗体滴度(ELISA)。表II是HI血清抗体滴度。图9显示了小鼠的T细胞应答。利用纯化的表面糖蛋白疫苗可以看出，MF59获得的结果优于明矾，但向MF59中加入CpG寡核苷酸一般能获得更好的T细胞应答。例如，向MF59“裂解(A)”中加入CpG获得的抗原特异性T细胞比例高于单用MF59获得的。

因此，对于流感疫苗，包括表面糖蛋白疫苗和裂解疫苗，水包油乳液是优秀的佐剂，但通过额外加入免疫刺激剂，例如CpG可以提高其引发细胞因子应答，特别是γ-干扰素应答的能力。

水包油乳液使得针对异源变体流感毒株的中和作用提高，因而即使疫苗毒株与流行毒株不匹配，该疫苗也可诱导保护性免疫力[160]。现已证明加入细胞因子诱导剂可获得能维持良好HI滴度并增强T细胞和细胞因子应答的疫苗。HI滴度与流感病毒的血清中和作用相关，因此维持HI滴度高是有用的，特别是对于群体原初的或可逃避宿主细胞因子应答的毒株[161]。T细胞和细胞因子应答增强涉及宿主抵御流感(病毒)感染的防御早期和决定阶段，因而有用[7]，其还可能通过诱导更强的干扰素-γ应答来降低流感的年龄相关敏感性[23]。因此，组合水包油乳液和细胞因子诱导剂是有利的。

应该知道，本发明只是借助实施例得到了描述，可以作出改进而仍维持在本发明的范围和公司中。

表I

表II

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