多肽小分子在制备防治缺血性脑血管病药物中的应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，是一种多肽小分子在制备防治缺血性脑血管病药物中的应用。本发明研究发现，从溶组织阿米巴的分泌液中提取的多肽活性分子以及多肽剪接体具有防治缺血性脑血管病的药理作用。本发明经小鼠局灶性脑缺血模型的药理试验，结果表明，本发明的五肽和三肽能显著降低小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤面积，并显著改善小鼠缺血后的神经行为。与同类蛋白药物相比，该多肽小分子脑保护作用强；而且由于分子量小，易于通透血脑屏障，具有显著的脑通透性优势。因此，本发明提供的多肽小分子具有在制备防治缺血性脑血管病药物中良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及多肽小分子在制备防治缺血性脑血管病药物中的应用。

背景技术

缺血性脑血管病(缺血性脑卒中)是世界上发病率、死亡率、致残率最高的疾病之一，极大威胁着人类、特别是老年人的健康和生活质量，已经成为全球社会健康资源的巨大负担。临床上以缺血性脑卒中死亡率和致残率已在神经系统疾病中占首位。目前国内外应用于治疗缺血性脑血管病的有效药物很少。因此，深入开展缺血性脑血管病的药物防治研究具有重要意义。

一种抗炎性反应的多肽，又称单核细胞移动抑制因子(MLIF)，是从无菌培养的溶组织内阿米巴中发现的五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)。体外培养和体内实验证明该肽能抑制人单核细胞、多形核白细胞的移动。溶组织内阿米巴通过产生该抗炎症多肽，影响细胞因子分泌，限制炎症的发生，逃避宿主免疫。文献报道，这种五肽分子不仅可以直接作用于炎症细胞，也可通过干扰炎性细胞因子的分泌影响炎症反应的过程，对MIP-1α、MIP-1β等炎症趋化因子有显著的抑制作用，同时还能够抑制IL-1β、TNF-α等炎症细胞因子分泌以及相应受体的表达。

迄今为止，尚未见该多肽用于脑血管疾病的报道。

发明内容

本发明研究发现，这种从溶组织阿米巴的分泌液中提取的五肽活性分子以及多肽剪接体具有防治缺血性脑血管病的药理作用。

本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的五肽在制备防治缺血性脑血管病药物中的应用。

同时，本发明对该五肽剪接体的研究，也发现了这一五肽中最后三个氨基酸组成的三肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，同样具有防治缺血性脑血管病的活性。

本发明经小鼠局灶性脑缺血模型的药理试验，结果表明，该五肽分子和三肽分子能显著降低小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤面积，并显著改善小鼠缺血后的神经行为。与同类蛋白药物相比，该多肽小分子脑保护作用强；而且由于分子量小，易于通透血脑屏障，具有显著的脑通透性优势。

本发明的多肽小分子可以按常规药剂学制备成注射剂、片剂或胶囊剂。

本发明提供的多肽小分子具有在制备防治缺血性脑血管病药物中良好的应用前景。

具体实施方式

实施例1：多肽小分子的制备方法

1、五肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：Met-Gln-Cys-Asn-Ser

2、三肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：Cys-Asn-Ser

以上五肽和三肽分子由上海生工生物科技公司合成，纯度在95％以上。

实施例2：多肽小分子用于治疗缺血性脑血管病的动物实验

小鼠线栓法制作局灶性脑缺血模型的药理实验是验证药物具有防治缺血性脑血管病作用常用的动物实验(Yin XM，Luo Y，Cao G，Bai L，Pei W，KuharskyDK，Chen J.Bid-mediated mitochondrial pathway is critical to ischemic neuronalapoptosis and focal cerebral ischemia.J Biol Chem.2002 Nov1；277(44)：42074-81.)，因此用其验证该多肽分子对实验性动物脑缺血的保护作用。

1、动物

C57/6BL小鼠，雄性，体重20～24g，每组10只/笼群养，共分8组。购于中国科学院上海实验动物中心(动物合格证号：中科沪动管字99—003号)。饲养于清洁级动物房。

2、药物

将实验小鼠进行分组：

药物1组：给予五肽0.5mg/kg。

药物2组：给予五肽1.0mg/kg。

药物3组：给予三肽0.5mg/kg。

药物4组：给予三肽1.0mg/kg。

空白组：给予与药物实验组等量的生理盐水进行假手术。

模型组：给予与药物实验组等量的生理盐水进行脑缺血再灌注手术。

3、实验方法

将小鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分枝。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4—0尼龙线，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血1小时后尾静脉给药。继续缺血1小时后再灌注。假手术组除不插线外，其余步骤同上。

(1)药物对小鼠脑缺血再灌注模型行为学评分的影响

存活鼠再灌注24后，观察小鼠行为变化，进行行为评分。参考Zea Longa的5分制评分标准：0分，正常，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。结果表明：空白对照组，模型组，药物一组，药物二组，药物三组，药物四组的行为学评分(分)依次为：0；3.0±0.71；2.0±0.82；1.5±0.24；2.5±0.97；1.8±0.45。其中，除空白组，药物二组较其他组的行为学评分最低。从行为学评分上表明药物二组的治疗效果最佳，即当给予五肽的剂量为1.0mg/kg时，对小鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用。见表1。

(2)药物对小鼠脑缺血再灌注模型脑梗塞面积的影响

存活鼠再灌注24后，快速断头取鼠大脑。在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2％TTC溶液中，37℃孵育30分钟。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。用求积仪(C63图象分析系统)测出各区面积，并计算梗塞区占整个冠面的百分比(％)。结果表明：模型组的脑梗塞面积(％)为35.0±5.8，药物一组的脑梗塞面积(％)为23.6±4.7，药物二组的脑梗塞面积(％)为15.3±7.9，药物三组的脑梗塞面积(％)为28.5±4.4，药物四组的脑梗塞面积(％)为19.9±8.1。其中，药物二组侧脑组织梗塞面积明显小于其他，且与各组相比有显著性差异(P<0.01)。即当给予五肽的剂量为1.0mg/kg时，对小鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用。见表2。

表1 实验各组小鼠脑缺血再灌注后的行为学评分(x±s)

与模型组相比，^**P<0.01，^*P<0.05

表2 实验各组小鼠脑缺血再灌注后的脑梗塞面积(x±s)

与模型组相比，^**P<0.01

                       SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>多肽小分子在制备防治缺血性脑血管病药物中的应用

<130>说明书，权利要求书

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2