BmNPV－家蚕幼虫多基因表达系统构建方法

摘要

本发明涉及一种BmNPV－家蚕幼虫多基因表达系统构建方法，按下列步骤顺序完成：(1)将阿拉伯糖启动子(pBAD)控制的I－SceI表达盒重组到E.coli DH10B的基因组中获得新的受体菌I－SceI DH10B；(2)结合转移用供体质粒的构建；(3)cre/loxp重组位点取代BmBacmid基因组中的v－cath和chitin基因，2个I－SceI位点取代BmBacmid中的p70基因获得受体I－sceI BmMultibac；(4)利用cre－loxp重组、Tn7重组和结合转移三种方法引入外源基因；(5)常规方法制备重组Bacmid DNA并转染昆虫细胞或者注射家蚕幼虫。本发明获得BmNPV－家蚕幼虫多基因表达系统，为研究多亚基蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用以及制备病毒样颗粒奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体涉及一种BmNPV—家蚕幼虫多基因表达系统的构建方法。

背景技术

因为具有对人及哺乳动物安全、超强的多角体启动子(polh)驱动外源基因在昆虫细胞内高效表达、昆虫细胞培养方便、病毒操作简单、克隆外源片段能力大(30-50kb)、表达产物具有正确后加工等特点，杆状病毒表达系统(BES，Baculovirus Expresson System)已经成为表达真核生物基因的优秀表达系统之一。目前，利用杆状病毒表达系统表达外源基因的来源遍及病毒、细菌、真菌、动物和植物等各种生物，其应用范围涉及蛋白质结构和功能、蛋白质与蛋白质之间相互作用方面的基础研究和疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂的改良等。目前主要使用两种杆状病毒表达系统，一种为商业化的AcNPV-sf9或者AcNPV-High5系统，该系统利用重组AcNPV在离体培养细胞sf9或者High5中进行外源基因表达。另外一种就是BmNPV(家蚕核型多角体病毒)-家蚕幼虫表达系统，该系统利用重组BmNPV在家蚕活体内进行蛋白表达。家蚕饲养在我国具有悠久的历史，其培养方式简单，成本较低，其成本为细胞培养的1/10，而蛋白表达量则为培养细胞的10倍左右，因此BmNPV—家蚕幼虫表达系统在经济高效大量表达外源蛋白方面具有极为诱人的前景和优势。

但是BmNPV-家蚕幼虫表达系统也有其缺点：由于转移载体大小局限性，一个供体质粒最多只能携带4个外源基因表达盒，对于使用BmNPV-家蚕幼虫表达系统同时表达多个外源基因有很大的局限性。以生产病毒样颗粒(VLPs)为例，在昆虫细胞中通过表达2个以上的病毒结构蛋白获得VLPs一般有两种策略：其一是构建数个不同的重组杆状病毒，每个杆状病毒表达一个结构基因，再使用几种重组杆状病毒同时感染细胞，让同一细胞内同时表达几个结构蛋白，再自我组装成VLPs。另外一种方法就是通过携带多个启动子的供体质粒，同时将多个目的基因克隆到NPV基因组中，只需要一种重组杆状病毒感染昆虫细胞即可表达几个目的蛋白，然后再组装成VLPs.早期多以前一种方式为主，该方法操作比较繁琐，需要构建几个重组杆状病毒，在感染过程中因难以保证多个杆状病毒同时进入每一个细胞，可能会造成VLPs组装量较少。随着构建重组杆状病毒技术的发展，尤其同时克隆多个(2～4)表达盒技术的出现，目前多使用后一种技术获得VLPs，其操作相对简单，VLPs产出量较高，但由于BmNPV-家蚕幼虫表达系统在多基因表达方面的局限性，限制了使用其生产VLPs的广泛利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种BmNPV—家蚕幼虫多基因表达系统的构建方法，可引入多个基因到BmBacmid中，在家蚕细胞或幼虫中实现高效经济表达多个基因或者蛋白复合物，特别是为BmNPV-家蚕幼虫生产病毒样颗粒(VLPs)提供基础。

本发明BmNPV—家蚕幼虫多基因表达系统构建方法按下述步骤实现：(1)将阿拉伯糖启动子(pBAD)控制的I-SceI表达盒重组到E.coli DH10B的基因组中获得新的受体菌I-SceI DH10B；(2)结合转移用供体质粒的构建；(3)Cre/loxp重组位点取代BmBacmid基因组中的v-cath和chitin基因，2个I-SceI位点取代BmBacmid中的p10基因获得受体I-sceI BmMultibac；(4)利用cre-loxp重组、Tn7重组和结合转移三种方法引入外源基因；(5)常规方法制备重组Bacmid DNA并转染昆虫细胞或者注射家蚕幼虫。

本发明的理论依据：细菌间结合转移能够方便地实现DNA在细菌间的传递，转移载体进入受体细菌后可以通过诱导受体细菌表达归位酶将载体线性化，同时表达重组酶将目的片段重组到合适的受体中，从而获得重组杆状病毒。Cre/loxp和Tn7特异性重组作为两种不同的重组方式，在各自辅助酶的帮助下实现同源重组，获得重组杆状病毒。这三种获得重组杆状病毒的方式不同，三者之间没有相互影响，结合使用可以实现BmNPV-家蚕幼虫的多基因表达。

有益效果：

本发明同时利用cre-loxp重组位点、Tn7重组位点和结合转移三种方法引入外源基因可以实现BmNPV-家蚕幼虫的多基因表达。本发明获得BmNPV-家蚕幼虫多基因表达系统，不但可以实现单个基因多拷贝数的表达，还可以同时表达多达12个外源基因，为研究多亚基蛋白、蛋白与蛋白之间相互作用以及制备病毒样颗粒奠定基础。

附图说明

图1是供体质粒pHTdual示意图。该质粒含有顺式激活元件oriT负责质粒pHTdual的转移，Pp10和Ppolh两个杆状病毒强启动子，能同时驱动2个目的基因表达。

图2是三种方式构建多基因表达重组杆状病毒流程图。

图3是利用可变模块将4—6个基因同时克隆到转移载体示意图。

图4是携带双荧光报告基因重组杆状病毒在BmN细胞中的表达，其中(A)是使用488nm激光观察感染72小时后的BmN细胞，(B)是同一视野下512nm激光观察感染72小时后的BmN细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；孙明主编，高等教育出版社，2006，基因工程(第十七章，病毒基因工程，姚伦广编著)；黎路林编著，华中师范大学出版社，1996，杆状病毒表达载体系统，或按照制造厂商的操作指南所建议的方法进行。

实施例1：构建杆状病毒-家蚕幼虫多基因表达系统的方法

(1)供体质粒的构建

如图1所示，顺式激活元件oriT来原于F因子，负责供体质粒的转移。具体构建过程如下：Zeocin抗性基因(Em7-ZeoR)经PCR扩增而来，其两段分别加上了2个同源臂序列(HL和HR)，2个I-SceI位点，以及BstBI，SacI，pmeI，AvrII等酶切位点。其上下游引物分别为：ZeoR—F：5’-TTCGAATA GGGATAACAGGGTAATACGCATCACTTACAACAGGGGGGACTATGAAATTATGCATTTGAGGATGCAGCACGTGTTGACAA-3’；ZeoR-R：5’-GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAAATGCAAATGTATTGTTATAGTATAATCTAATAAATATTTCATTATGTTTAAACCCTAGGAGGTCGACCCCCCTC-3’。PCR产物首先克隆T载体获得重组pSimple-Em7zeo，然后NcoI/SalI双酶切去掉Zeocin编码区，保留Em7启动子。回收后的载体和来源于相同酶切pCohygro产物hygromycin编码区相连，获得Em7启动子驱动的hygromycin表达盒。双酶切后，该Em7-Hygromycin片段与经同样双酶切pMAGICI的R6kori+oriT产物进行连接，获得中间过渡载体pHTdual-pre1。pmeI/AvrII双酶切pFBDM获得含p10和polh启动子片段，将该片段与pmeI/AvrII酶切的pHTdual-pre1相连，获得结合转移载体pHTdual。

(2)受体菌I-SceI DH10B构建

首先将可诱导阿拉伯糖启动子驱动的I-SceI表达盒引进DH10B基因组中。质粒pML 104含有由半乳糖启动子(Plac)控制的重组酶基因red和gam，经CaCl₂转化进DH10B。将DH10B/pml 104于30℃培养至OD₆₀₀约为0.2，加入IPTG(0.4mM)继续培养30分钟，以诱导重组酶RED和GAM表达。质粒pML294含有插入umuC基因HindIII位点的I-sceI表达盒和带FRT侧翼序列的卡钠霉素抗性基因(ParaBAD-I-SceI-FRT-npt-FRT：umuC)，EcoRI/KpnI双酶切切下该片段，再电转化进IPTG诱导过的DH10B/pML 104感受态细胞，卡那霉素抗性筛选出阳性菌落。在重组酶作用下，ParaBAD-I-SceI-FRT-npt-FRT片段被同源重组进DH10B基因组的umuC位相。接着将pcp20转化进阳性菌落，于30℃培养2小时。由于温度敏感型质粒pcp20能够表达FLP位点特异性重组酶，其表达的Flp重组酶能够切除掉DH10B基因组中的npt表达盒(kn^R)，获得无卡那霉素抗性菌落，最后通过42℃培养去掉pcp20，获得能够表达I-SceI的目的菌株I-SceI DH10B。

(3)受体BmBacmid的改造

原始BmBacmid只有Tn7转座位点，缺乏其他二种引入外源基因的方式，因此必须对BmBacmid进行改造。首先使用同源重组方式在BmBacmid的v-cath和chitin位相引入Cre/LoxP位点。以pVgRxR为模板，设计引物扩增出含FRT序列的Zeocin表达盒，引物分别为：FRTZeoup：aGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTTTAAACtgcagcacgtgttgac和FRTZeodown：aGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGATATCgaggtcgacccccctc(大写字母为FRT序列)，PCR产物克隆到pMD18T载体，获得重组载体pMD18T-FRT-Zeocin-FRT。然后以BamHI/SphI切下FRT-Zeocin-FRT片段，用T₄DNA聚合酶补平后，克隆到同样平末端化的pUCDM的pmeI/BamHI位点之间，获得重组质粒pUCDM-FRT-zeocin-FRT。接着将该载体以SacII/BstBI切下含Cre/LoxP位点的片段FRT-zeocin-FRT-loxP备用。设计引物以BmBacmid为模板，扩增出v-cath和chitin基因.引物分别为：CHTINup：AGTATACGCG TTGAGCAAGTCGCCGTTATCGG和CATHdown：AGTATACCCTGAAAAATCCGTCCTCTCCCC(下划线为BstZ17I位点)。PCR产物克隆到pMD18TSimple，获得pMD18TS—VC，用SacII/BstBI切开载体，和原来的FRT-zeocin-FRT-loxP相连，获得重组载体pMD18TS-VC/loxp-frt-zeocin。用BstZ17I切下片段，电转化进行DH10BmBacmid/pML104中，获得zeocin阳性菌落，经PCR验证后转化进pcp20去掉zeocin抗性基因，获得引进loxP位点的BmMultibac。

由于供体质粒pHTdual中已经含有p10启动子，为了避免在构建重组BmBacmid时出现意外重组，BmBacmid中自身存在的p10启动子必须去掉，同时在BmBacmid中引入2个I-SceI位点。以pFBDM为模板，PCR扩增出抗性基因Gm^R，设计引物在其两侧分别引入50nt同源重组臂和18bp的I-SecI位点。上下游的引物序列分别为Gm-F：5’-TACGCATCACTTACAACAGGGGGGACTATGAAATTATGCATTTGAGGATGTAGGGATAACAGGGTAATCT ATTAATATTCCGGAGT-3’(斜体表示50nt同源左臂，下划线为I-SceI)；Gm-R(5’-AATAAATGCAAATGTATTGTTATAGTATAATCTAATAAATATTTCATTATA GGGATAACAGGGTAATGGCGTTGTGACAATTTAC-3’(斜体表示50nt同源右臂)。PCR产物电转化进经IPTG诱导的DH10B/BmMultibac/pML104中，在重组酶的作用下，Gm表达盒及2个I-SceI位点经同源重组取代BmMultibac的p10及p74基因。Gm抗性和蓝白斑筛选获得的蓝色菌落经过PCR验证后获得阳性菌落命名为I-sceIBmMultibac。提取I-sceI BmMultibac DNA电转化进入受体菌I-SceI DH10B，获得I-SceI DH10B/I-sceIBmMultibac。

(4)外源基因的引入

如图2所示，首先利用结合转移方法获得重组杆状病毒：将目的基因克隆到供体载体pHTdual并转化进BUN20，供体菌BUN20/pHTdual于含50μg ml^-1的Hygromycin和12.5μg ml^-1四环素的LS(低盐)培养基中培养。受体菌I-SecIDH10B/I-sceI BmMultibac/pML 104于含50μg ml^-1壮观霉素，50μg ml^-1卡那霉素的LS培养基中培养。培养过夜后离心收集细菌，然后用含0.4mM IPTG的LS培养基分别以1:100和1:200的比例稀释供体和受体菌，于30℃培养2h至OD600约为0.2。按1：1比例混合供体和受体菌。先37℃静置培养混合菌2小时，再150rpm摇床培养2小时，最后将菌液稀释1000倍，涂布于含50μg ml^-1的卡那霉素，50μg ml^-1的hygromycin的LS平板上，置42℃培养过夜，挑取阳性克隆37℃振荡培养获得重组BmBacmid。利用cre-loxp位点特异性重组引入外源基因：如图3所示，由于供体质粒pUCDM可以克隆多达4个基因，通过这种方式可以将另外4个基因引入前述所构建的重组BmBacmid之中。首先使用常规方法将目的基因克隆到供体pUCDM中，获得携带多个目的基因的重组供体。将能表达cre-loxp重组酶的质粒pBADHisCre转化进受体菌I-SceI DH10B/I-sceI BmMultibac中，加阿拉伯糖诱导重组酶产生，然后将重组载体转化进受体菌I-SceI DH10B/I-sceI BmMultibac中，经过抗性筛选获得重组菌落。接着利用Tn7转座方式引入外源基因：由于供体质粒pFBDM可以克隆多达4个基因，通过这种方式可以将另外4个基因引入前述所构建的重组BmBacmid之中，具体操作方法见Bac-to-Bac使用手册。这样即可以在同一BmBacmid中引入多达12个外源基因。

(5)重组杆状病毒的产生

按照常规碱裂解方法从大肠杆菌中制备重组BmBacmid DNA，然后使用脂质体转染方法将重组Bacmid DNA转染进BmN细胞，或者直接注射家蚕幼虫，5～7天后即可以收获重组病毒粒子和进行蛋白表达和纯化分析。

实施例2：携带双荧光报告基因重组病毒的构建及其表达

(1)重组供体质粒的构建

根据实施例1中(1)步骤制作方法获得供体载体pHTdual，pDsRed2-1经BamHI/NotI酶切，回收红色荧光蛋白基因DsRed片段，克隆到载体pHTdual，得到重组质粒pHTdual-DsRed。pIRES-gfp经SmaI/XhoI酶切，回收绿色荧光蛋白基因gfp片段，克隆到载体pUCDM得到重组质粒pUCDM-gfp。

(2)受体菌受体菌I-SceI DH10B的构建；(3)受体BmBacmid的改造；(4)获得重组BmBacmid；(5)重组病毒产生的方法分别按照实施例1中的(2)、(3)、(4)、(5)步骤制作。

(6)重组病毒在细胞中的表达

如图4(A)、(B)所示，Bacmid-Red-gfp分别转染BmN细胞，具体转染方法参考Lipofectamine 2000产品说明。转染BmN细胞72h后，在荧光显微镜下进行荧光观察。488nm观察绿色荧光，512nm观察红色荧光。Bacmid-Red-gfp转染的BmN细胞在单个细胞中同时发射出绿色荧光和红色荧光，或者单个细胞完全不发光，表明利用本系统构建的重组BmBacmid DNA仍然保持着对BmN细胞的感染性，多基因表达系统BmMultiBac可以同时表达多个基因。