从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法

摘要

一种从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法，它是将猪胰脏经过绞碎后形成胰糜，后者采用提取液进行提取后经过板框过滤、超滤后，采用离子交换树脂进行吸附，洗脱液用反胶束萃取方法进行正萃取和反萃取步骤，反萃取出来的弹性蛋白酶组分经过超滤脱盐浓缩和冷冻干燥后获得高纯度的弹性蛋白酶产品。本发明制得的弹性蛋白酶产品生物活性达到1200IU/mg以上，比活超过2200IU/mg·p，产品经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，分子量约25900Da，且电泳为单一带，可以作为医药工业用弹性蛋白酶制剂的原料。本发明的工艺路线也可以用于从猪胰脏中提取纯化其他种类的蛋白酶及生物活性分子。

说明书

技术领域

本发明涉及到一种从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法，特别是采用反胶束萃取工艺直接从新鲜和冷冻猪胰脏中提取弹性蛋白酶的方法。

背景技术

弹性蛋白酶(Elastase)，又称弹性水解酶、胰弹性酶、胰肽酶E和弹性酶。弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏、皮肤、主动脉、血小板和白血球中以及酶在微生物类群中也广有分布。由动物胰脏分离纯化的弹性蛋白酶是一种肽链内切酶，由240个氨基酸残基组成，不含辅基和金属离子，分子量为25900，等电点(pI)为9.5，白色结晶。由常规分离法得到结晶弹性蛋白酶由弹性蛋白酶I和弹性蛋白酶II组成，其中弹性蛋白酶I具有分解弹性蛋白的活力，是药用制剂的主要成分，弹性蛋白酶II具有水解弹性粘蛋白的活力。

弹性蛋白酶经济价值极高。自1949年Balo和Banga首次从胰脏中分离纯化出能降解弹性蛋白的酶，并提出其含量水平与动脉粥样硬化有关以来，人们对该酶的研究一直很活跃，从而带动了该酶的分离、提取和纯化相关产业链。目前弹性蛋白酶在临床上主要用于防治动脉粥样硬化、高脂血症、高血压的药物。药用的弹性蛋白酶主要从猪胰脏中提取。目前国内外对于弹性蛋白酶的提取分离技术大致有两种，一种是从胰脏或脱水胰脏粉经提取过滤硫酸铵分级盐析法获得粗制品，再经结晶或层析等方法获得弹性蛋白酶精品；二是从胰脏提取液中用多种离子交换树脂分离精制而得。国外主要工艺是采用硫酸铵分级沉淀和层析方法获得弹性蛋白酶精品。国内对胰弹性蛋白酶制备方法的方法报道较多，有吸附法、盐析法、离子交换法、亲和层析法等。其中一种优化的工艺为：新鲜或冷冻猪胰经过两次搅碎后激活，然后用醋酸提取，提取液过离子交换树脂，经过分级沉淀得到弹性蛋白酶粉。弹性蛋白酶粉经过对氨基苯甲脒-sepharose亲和层析和DEAE阴离子交换树脂以及CMC纤维素柱层析后得到精制弹性蛋白酶。虽然整个工艺收率较低，工序较复杂，操作时间长，但其产品比活比较满意，近年来被大多厂家广泛使用，成为生化药厂的传统工艺。

中国专利200710020819.4公开了一种纯化弹性蛋白酶的方法，该方法的主要特征为胰脏干粉与水混合后得到混合液，后者经过离心或过滤后得到清夜，再经过超滤/再超滤以及阳离子树脂纯化后得到进一步提纯的弹性蛋白酶溶液，该弹性蛋白酶溶液经过冷冻干燥后获得弹性蛋白酶干粉。用该发明制备的产品的收率只有1.5×10⁵IU/kg胰脏粉。

传统吸附剂往往存在吸附效率低、非特异性吸附强、产品纯度差、后续纯化负担重；精品纯化过程中，收率和纯度往往很难兼顾，如采用分子筛层析可得到纯度较高的产品，但活性回收率低，填料昂贵成本高，不易于放大生产；另外，由于纯化工序复杂，反复过柱纯化，会进一步降低产品收率。另外，采用丙酮沉淀和真空干燥脱水虽然能够一定程度上节省能量，缩短生产时间，但是采用大量丙酮不利于操作人员的健康，同时产品活性有一定的损失。目前从1Kg猪胰脏中大约能提取4.0-4.8g弹性蛋白酶粉，总活力平均为2×10⁵IU。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用反胶束萃取工艺从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法。

本发明是这样来实现的，它包括反胶束萃取体系的建立和纯化弹性蛋白酶的亲和反胶束工艺，其方法步骤如下：

(1)反胶束萃取体系的建立：

建立以琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠(AOT)、十六烷基三甲溴化铵(CTB)为表面活性剂，以醇类和辛烷按1∶1-1∶10体积比混合的有机溶剂为表面活性剂溶剂的体系，组成的反胶束体系对弹性蛋白酶具有良好的亲和性和选择性，所述的醇类为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己醇，辛烷为正辛烷和异辛烷，具体操作步骤为：取弹性蛋白酶粗提液(活性为100IU/mg左右)100mL与一定体积的AOT/丁醇/异辛烷或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)/正己醇/正辛烷反胶束溶液搅拌混匀一定时间，达到萃取平衡，使反胶束与弹性蛋白酶充分作用，然后静置分相。取下层水相中样品测定弹性蛋白酶活性和蛋白含量，计算萃取率。对于反萃取步骤：吸取上层有机相(约100mL)与等体积的盐溶液混匀20分钟后，静置分相，取下层水相，测定弹性蛋白酶活性和蛋白含量，计算反萃取率。以萃取率和反萃取率分别优化反胶束种类、有机溶剂配比、表面活性剂的终浓度、正萃取时间、正萃取的盐离子浓度和pH、反萃取的盐离子种类、浓度和pH等参数。建立的适合纯化弹性蛋白酶的反胶束萃取条件为：正萃取步骤中静置分相的时间为5-30分钟，正萃取盐离子浓度为0.5-3mol/L、pH值在1-3之间，反萃取剂pH为5-10、盐离子浓度为0-0.5mol/L，反萃取剂最优为NaAc、Na₂CO₃或KAc溶液。此时反胶束溶液对弹性蛋白酶的活性回收率平均达到90％以上，弹性蛋白酶活性从100IU/mg左右提高到1200IU/mg以上，比活达到2500IU/mg p以上。

(2)纯化弹性蛋白酶的亲和反胶束工艺：

取新鲜猪胰脏，经过二次绞碎并磨浆之后，在pH8.0，25℃，0.01mol/L CaCl₂和搅拌情况下，激活2-5小时，形成胰糜。胰糜经过8倍体积0.1mol/L pH4.5HAc醋酸提取3小时之后，进行板框过滤，滤液用50-100kD和10kD超滤膜过滤后得到弹性蛋白酶粗提液。弹性蛋白酶粗提液采用强酸性阳离子交换树脂(73号树脂)对目的产物进一步浓缩和富集，同时为后续的反胶束萃取体系做准备。弹性蛋白酶粗提液中加入适量再生好的吸附剂，4℃搅拌吸附(或装柱吸附)2-4小时，过滤，得到的吸附物装柱，用pH4.0，0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤4-5柱床，再用pH4.0，适当离子强度(0.5-2mol/L)的醋酸-醋酸钠溶液洗脱1.5柱床，收集洗脱液。洗脱液直接用(1)中优化的反胶束萃取休系进行正萃取和反萃取操作。反萃取洗脱液采用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤浓缩后，进行冷冻干燥得弹性蛋白酶精品。

本发明采用对弹性蛋白酶有良好亲和性的反胶束体系从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶，工艺步骤包括预处理(激活/醋酸抽提/组合超滤)、离子交换树脂吸附、反胶束萃取(正萃取/反萃取)、超滤、冷冻干燥等。整个工艺步骤避免采用层析柱进行纯化，工艺容易放大，可方便实现自动化生产。另外，工艺操作在室温下进行，可以节省大量的能源。产品的纯度或效价高于同行水平，生物活性达到1200IU/mg以上，比活超过2500IU/mg·p。

具体实施方式

实施例1

(1)适合纯化弹性蛋白酶的反胶束萃取体系的建立：

选取AOT/丁醇/异辛烷体系为精制弹性蛋白酶的反胶束体系。选取丁醇/异辛烷有机溶剂的体积配比为1∶5进行试验。选取AOT浓度为110mmol/L进行试验。选取正萃取步骤中添加的蛋白酶溶液与反胶束溶液的比值为1∶1进行试验。选取酶溶液的溶剂为醋酸-醋酸钠(离子浓度为1mol/L、pH 4)，取弹性蛋白酶粗提液(活性为100IU/mg左右)100mL与等体积的AOT/丁醇/异辛烷反胶束溶液搅拌混匀10分钟，达到萃取平衡后静置分相。取下层水相中样品测定弹性蛋白酶活性和蛋白含量，计算萃取率，此时的萃取率达到94％。对于反萃取步骤：吸取上层有机相(约100mL)与等体积的NaAc溶液(pH8.5，0.05mol/L)混匀20分钟后，静置分相，取下层水相，测定弹性蛋白酶活性和蛋白含量，计算反萃取率。此时对弹性蛋白酶的活性回收率达到92％以上。5批重复试验的平均活性回收率达到90％以上，弹性蛋白酶活性从100IU/mg左右提高到1200IU/mg以上，比活达到2500IU/mg p以上。

(2)纯化弹性蛋白酶的亲和反胶束工艺：

取新鲜猪胰脏10Kg，经过二次绞碎并磨浆之后，在pH8.0，25℃，0.01mol/LCaCl₂和搅拌情况下，激活3小时，形成胰糜。胰糜经过8倍体积0.1mol/L pH4.5HAc醋酸提取3小时之后，进行板框过滤，滤液用50kD和10kD超滤膜过滤后得到弹性蛋白酶粗提液。弹性蛋白酶粗提液采用强酸性阳离子交换树脂(73号树脂)对目的产物进一步浓缩和富集。弹性蛋白酶粗提液中加入适量再生好的吸附剂，4℃搅拌吸附(或装柱吸附)2小时，过滤，得到的吸附物装柱，用pH4.0，0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗涤4-5柱床，再用pH4.0，适当离子强度(1mol/L)的醋酸-醋酸钠溶液洗脱1.5柱床，收集洗脱液。洗脱液直接用(1)中优化的反胶束萃取体系进行正萃取和反萃取操作。反萃取洗脱液采用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤浓缩后，进行冷冻干燥得弹性蛋白酶精品。