利用高速逆流色谱法纯化一枝蒿酮酸和金腰素乙的方法

摘要

本发明涉及一种利用高速逆流色谱法纯化一枝蒿酮酸和金腰素乙的方法，该方法是将分离溶剂系统置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取一枝蒿提取物溶解于上相和下相的混合溶液中，再将固定相用泵灌满色谱分离柱，然后将柱的首端与进样阀相接，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，将不同成分分别收集、浓缩、干燥，分离得到95％以上的酮酸和金腰素乙的单体化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及利用高速逆流色谱法，从含酮酸和金腰素乙的天然植物中分离和制备高纯度酮酸和金腰素乙的方法。

背景技术

近20年来发展起来的高速逆流色谱技术(High-speedcounter-current chromatography，HSCCC)是一种没有固态支撑体的液-液分配色谱技术，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作为分离柱，固定相和流动相都是液态，螺旋管自转的同时，绕一平行于自转轴的外部轴线做公转运动，借以获得足够强的离心力场，在两相中的一相得以保留的前提下，形成固定相与流动相的两相分割趋势和对流趋势，这种分割和对流的过程是连续进行的，如果把要分离的样品从螺旋管柱的入口注入，连续的分配传递过程就会在管柱里进行，从而实现连续的、高效的液-液分配过程。HSCCC分离效率高；操作简单，样品不需严格的预处理；可从极复杂的粗制样品中一步分离得到高纯度的组分；分析/分离粘度较高和易被固定相吸附的样品方面具有明显优势；可以分析/分离黄酮、生物碱、醌类、类脂等小分子化合物，也可分析/分离多肽、多糖、蛋白质等高分子化合物，适用范围比较广泛；能够明确表达中药材这种复杂体系中不同批次间的差异，稳定性和重现性好；其仪器及耗材完全国产化，成本明显低于高效液相色谱。随着天然药物的蓬勃发展HSCCC的主要研究领域集中于天然药物的分离纯化，已从几十种天然原料中分离得到数百种高纯度的单体化合物。非常适合于维药化学对照品的制备。

维药历史悠久，在其形成和发展的过程中，采阿拉伯、古希腊等民族医药之所长，并受到中医药学的影响，是我国民族医药的独立分支，历史上为西域各族人民的繁衍和昌盛做出过重要贡献。新疆自治区有维药600余种，较常用的360种左右，其中本地产资源约160种，占维药总数的27％。已收入《中华人民共和国》药典的药品有202种，其中药材115种，成方制剂87种，属于民族专用的约有30种，毛菊苣和一枝蒿是非常有代表性的药材。

维药有着独特的治病理念，是中国民族药的重要组成部分，但其应用基本局限在新疆自治区的范围内，在全国范围及世界各地的推广速度缓慢。导致这种情况的主要原因：一是生产工艺离现代医药工业优质化生产要求还有很大差距；二是原药材的主要活性成分是次生代谢物，对后天的生长环境依赖性很强，原料药来自天然，又多为人工分散采收、加工，受天气、地域差别及人为因素影响很大，原料、中间体及最终产品离规范化、标准化管理还有很大差距，缺乏严格的质量监控标准和良好的监控方法，很难保证产品质量的稳定性；三是维药产品的疗效缺乏采用现代药物临床研究常用的“随机分组”、“对照”、“双盲”、“多点观察”等科学实验方法获得的科学数据说明，难为现代医学工作者和管理机构所信服。维药现代化是维药产业可持续发展的根本出路。维药原料和成药(片剂、颗粒剂、口服液、注射剂)的质量监控是维药现代化进程中迫切需要解决的关键问题之一。而标准对照品是质量监控的重要物质基础，可供原药材种植基地监控气候、地域、采收期及人为因素等对药材质量的影响，指导种植；可供成药生产厂家指导药材的合理勾兑，控制中间体及最终产品的质量，建立相关企业标准；为指纹图谱中重要指标成分的标定及谱效关系建立提供基础。

而无论是维药还是中药的研究与开发，都严重缺乏高纯度的标准对照品，这是制约标准制订与实施的关键因素之一。目前国家质量技术监督局正在建立各种国家实物标准，天然药物的标准品是其中的重要内容。

新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)系菊科植物，产于新疆维吾尔自治区境内的天山及阿尔泰山山脉，是新疆民族药常用药材，具有解毒、抗过敏、抗菌、抗病毒及保肝等功效。临床用于肝炎、感冒、咽炎、扁桃体炎、眼炎的治疗。一枝蒿中含有黄酮类、半倍萜类、氨基酸类、甙类、多糖类、挥发油、多肽、生物碱等化合物。

本发明针对化学对照品严重缺乏的问题，在已有的维药药效学研究基础上，采用近年来发展迅速的高速逆流色谱技术，同时制备一枝蒿酮酸和金腰素乙等两种代表性化学成分的方法，并采用该方法获得了高纯度(纯度95％上)的一枝蒿酮酸和金腰素乙的单体化合物；并建立以高速逆流色谱为核心技术的标准对照品制备平台，为维药化合物库的建立及国家实物标准的申请打下基础。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用高速逆流色谱法纯化一枝蒿酮酸和金腰素乙的方法，该方法是将分离溶剂系统置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取一枝蒿提取物溶解于上相和下相的混合溶液中，再将固定相用泵灌满色谱分离柱，然后将柱的首端与进样阀相接，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，将不同成分分别收集、浓缩、干燥，分离得到95％以上的酮酸和金腰素乙的单体化合物。

本发明所述的利用高速逆流色谱法纯化一枝蒿酮酸和金腰素乙的方法其特征在于按下列步骤进行：

a、取一枝蒿全草，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；

b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末，将粉末溶于二氯甲烷，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品；

c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，其体积比为2-5∶4-6∶2-5∶4-6；

d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品溶于上层和下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，根据检测器谱图接收目标成分；

e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)；流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。

步骤d在高速逆流色谱中一枝蒿酮酸的保留时间为260-400分钟，一枝蒿金腰素乙的保留时间为560-720分钟。

步骤d使用的高速逆流色谱仪流速范围为1-3ml/min，转速范围为750-900转数。

本方法适用于对含有酮酸和金腰素乙的任意一种植物的提取。

本发明所述的利用高速逆流色谱法纯化一枝蒿酮酸和金腰素乙的方法，为实现该方法本发明采取了以下设计方案：

样品的制备：

新疆一枝蒿全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取。萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末95.394g，粉末溶于1L二氯甲烷(5次)，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品5.1289g，该样品用于高速逆流色谱法(HSCCC)的分离；

溶剂系统的筛选：

取5mg粗样品溶于10ml溶剂系统中，连续震荡5分钟，静置，分层，分层时间少于30秒，分开两相后置于试管中，干燥后重新溶解于1ml甲醇中，通过HPLC对样品进行分析，目标化合物上相峰面积与下相峰面积的比值即为该化合物在两相溶剂中的分配系数(K)，溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水2-5∶4-6∶2-5∶4-6v/v，优选体积比3∶5∶3∶5，目标化合物一枝蒿酮酸和金腰素乙的K分别为2.49、5.98；

样品溶液的制备：

将500毫克粗样品溶于10ml等体积的上下相溶液中，超声使其溶解，滤去不溶物；

高速逆流色谱(HSCCC)分离过程：

首先用固定相充满“色谱柱”，开启逆流色谱仪，转数为800rpm/min，以1.5ml/min的流速注入流动相后，进10ml样品溶液。流出液通过紫外检测器检测，检测波长254nm，根据峰型手动收集流出液；

高效液相(HPLC)检测高速逆流色谱(HSCCC)的原料和产品：

粗样品和高速逆流色谱(HSCCC)分离得到的样品通过高效液相(HPLC)检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)，流速：1.0ml min^-1，检测波长：245nm，一枝蒿酮酸和金腰素乙的保留时间分别为30min、37.5min。

高速逆流色谱(HSCCC)分离得到的单体通过MS、NMR鉴定结构。

附图说明

图1为本发明高速逆流色谱分离一枝蒿酮酸和金腰素乙的图，其中1为一枝蒿酮酸，2为金腰素乙。

图2为本发明高速逆流色谱分离前的总样品图，其中1为一枝蒿酮酸，2为金腰素乙。

图3为本发明高效液相检测一枝蒿酮酸图，其中1为酮酸。

图4为本发明该校液相检测金腰素乙图，其中2为金腰素乙。

具体实施方式

实施例1

样品的制备：

a、取新疆一枝蒿全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；

b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末95.394g，将粉末溶于1L二氯甲烷(5次)，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品5.1289g，该样品用于高速逆流色谱(HSCCC)的分离；

c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，其体积比为2∶6∶2∶6；

d、将溶剂系统配置于分液落斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b粗样品150mg溶于3ml上层和3ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后将柱的首端与六通进样阀相接，开启速度控制器，使其主机转动，转速达到750r/min，开始以1.0ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入步骤b粗样品150毫克的混合溶剂，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，在高速逆流色谱中一枝蒿酮酸的保留时间为260分钟，一枝蒿金腰素乙的保留时间为560分钟，根据检测器自外谱图接收目标成分，分离得到的酮酸和金腰素乙的纯度都在95％以上；

e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。

实施例2

a、取新疆一枝蒿全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；

b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末95.394g，将粉末溶于1L二氯甲烷(5次)，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品5.1289g，该样品用于高速逆流色谱(HSCCC)的分离；

c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，其体积比为3∶6∶3∶6；

d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品500mg溶于10ml上层和10ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后将柱的首端与六通进样阀相接，开启速度控制器，使其主机转动，转速达到900r/min，开始以3ml/min流速泵入流动相，由进样阀进入步骤b提取粗样品500mg的混合溶剂，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，在高速逆流色谱中一枝蒿酮酸的保留时间为320分钟，一枝蒿金腰素乙的保留时间为600分钟，根据检测器自外谱图接收目标成分，分离得到的酮酸和金腰素乙的纯度都在95％以上；

e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)。流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。

本方法适用于对含有酮酸和金腰素乙的任意一种植物的提取。

实施例3

a、取新疆一枝蒿全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；

b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末95.394g，将粉末溶于1L二氯甲烷(5次)，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品5.1289g，该样品用于高速逆流色谱(HSCCC)的分离；

c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，其体积比为4∶5∶4∶5；

d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品200mg溶于5ml上层和5ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后将柱的首端与六通进样阀相接，开启速度控制器，使其主机转动，转速达到800r/min，开始以2.0ml/min流速泵入流动相，再将流动相泵入柱，由进样阀进入步骤b提取粗样品200mg的混合溶剂，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，在高速逆流色谱中一枝蒿酮酸的保留时间为300分钟，一枝蒿金腰素乙的保留时间为620分钟，根据检测器谱图接收目标成分，分离得到的酮酸和金腰素乙的纯度都在95％以上；

e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。

本方法适用于对含有酮酸和金腰素乙的任意一种植物的提取。

实施例4

a、取新疆一枝蒿全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；

b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末95.394g，将粉末溶于1L二氯甲烷(5次)，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品5.1289g，该样品用于高速逆流色谱(HSCCC)的分离；

c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，其体积比为3∶5∶3∶5；

d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品300mg溶于4ml上层和4ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后将柱的首端与六通进样阀相接，开启速度控制器，使其主机转动，转速达到880r/min，开始以2.5ml/min流速泵入流动相，再将流动相泵入柱，由进样阀进入步骤b提取粗样品300mg的混合溶剂，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，在高速逆流色谱中一枝蒿酮酸的保留时间为380分钟，一枝蒿金腰素乙的保留时间为700分钟，根据检测器谱图接收目标成分，分离得到的酮酸和金腰素乙的纯度都在95％以上；

e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)。流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。

本方法适用于对含有酮酸和金腰素乙的任意一种植物的提取。

实施例5

a、取新疆一枝蒿全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；

b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粉末95.394g，将粉末溶于1L二氯甲烷(5次)，超声溶解，过滤，合并，浓缩得粗样品5.1289g，该样品用于高速逆流色谱(HSCCC)的分离；

c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成，其体积比为5∶6∶5∶6；

d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品350mg溶于6ml上层和6ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后将柱的首端与六通进样阀相接，开启速度控制器，使其主机转动，转速达到850r/min，开始以1.5ml/min流速泵入流动相，再将流动相泵入柱，由进样阀进入步骤b提取粗样品350mg的混合溶剂，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，在高速逆流色谱中一枝蒿酮酸的保留时间为400分钟，一枝蒿金腰素乙的保留时间为720分钟，根据检测器谱图接收目标成分，分离得到的酮酸和金腰素乙的纯度都在95％以上；

e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温35℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-40min，A∶B(30∶70，v/v)到A∶B(70∶30，v/v)，60min时，A∶B(70∶30，v/v)。流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。

本方法适用于对含有酮酸和金腰素乙的任意一种植物的提取。

本发明提供了一种从天然产物粗提取物中同时分离得到两种化合物的高速逆流色谱方法(HSCCC)，该方法主要用于在制备高纯度化学对照品和化学样品的制备，具有高效，低成本，样品无损失，样品分离量大等特点。