一种构建膜蛋白cDNA文库的方法及其应用

摘要

本发明涉及了一种构建膜蛋白cDNA文库方法及其应用。该方法构建了用于特异性筛选膜蛋白表达的真核表达载体pSecTag－attR，该表达载体可与任意带有λ噬菌体重组位点attL的cDNA克隆文库进行克隆重组获得cDNA表达文库，转染COS－1细胞后，通过进一步免疫荧光筛选对文库中表达膜蛋白克隆进行筛选，获得膜蛋白cDNA表达文库。作为该方法的应用，C57BL/6小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA文库被建立，通过对该文库进行鉴定分析，证明该方法是一种高通量特异性筛选膜蛋白的有效方案，为描绘特定组织细胞表面膜蛋白图谱以及研究未知膜蛋白提供了一种有力的手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建构建膜蛋白cDNA文库方法，包括用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建，膜蛋白在哺乳动物细胞COS-1表面的表达及荧光筛选；并将其应用于小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白的特异性高通量筛选。

背景技术

膜蛋白是细胞质膜的重要组成部分，在质膜发挥生物学功能的过程中发挥着至关重要的作用。例如运输蛋白，连接蛋白以及一些酶类分别在细胞的物质运输与交换，细胞骨架的构成与维持以及细胞能量的产生及信号传导中发挥着重要的作用。其中，受体蛋白作为一类功能多样的蛋白，在维持细胞生存发育中必不可少；并且在淋巴细胞发挥生物学功能的过程中有着决定性作用。

淋巴细胞是机体内一群重要的免疫细胞，在机体的免疫防御、免疫稳定与免疫监视中都发挥着重要作用。主要表现在抵抗和清除病原微生物或其它异物，清除损伤或衰老的细胞，维持其生理平衡的功能以及识别和清除体内出现的突变细胞，防止发生肿瘤。淋巴细胞表面膜蛋白受体与炎症损伤触发密切相关，对淋巴细胞表面膜受体的研究与膜蛋白谱的描绘对研究淋巴细胞功能，维持机体的免疫平衡有着重要意义。

目前，对淋巴细胞表面膜蛋白的研究有一定进展，一些新蛋白的发现极大促进了对淋巴细胞功能的研究，然而仍有大量重要功能的膜蛋白未被发现鉴定，一些重要组织(如肝脏)的淋巴细胞表面膜蛋白谱的描绘尚处于空白，其根本原因是尚无大规模高通量特异的筛选膜蛋白质的方法。

目前，对膜蛋白的筛选主要有几种方法。免疫筛选方法是寻找未知膜蛋白的常用方法(Seed B，Aruffo A.Molecular cloning of the CD2antigen，the T-cell erythrocytereceptor，by a rapid immunoselection procedure.Proc Natl Acad Sci U S A1987；84：3365-3369.)，即利用一种蛋白的已知抗体或配体与该种蛋白的特异的相互作用对该未知蛋白进行检测鉴定。然而，由于需要利用已知的抗体和配体，使该种方案有很大的局限性。近年来，一种信号肽捕获技术被应用到膜蛋白的筛选研究中(Tashiro K，Tada H，Heilker R，Shirozu M，Nakano T，Honjo T.Signal sequence trap：a cloning strategyfor secreted proteins and type I membrane proteins.Science 1993；261：600-603.)，这种技术可以特异的筛选编码信号肽的膜蛋白与分泌蛋白的cDNA，然而大量存在的分泌型蛋白仍然对膜蛋白的研究产生很大的干扰。目前，仍然缺乏一种高通量特异筛选膜蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种构建膜蛋白cDNA文库方法，并将其应用于小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白的特异性高通量筛选。

技术方案：

本发明构建膜蛋白cDNA文库的方法，包括以下步骤：

A：用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建；

B：cDNA表达文库的构建；

C：cDNA表达文库稳定转染入细胞，获得稳定表达该文库的细胞株；

D：表达该文库的细胞株经荧光筛选，获得膜蛋白特异的cDNA文库。

其中所述的用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建包括以下步骤：以真核表达载体pcDNA-DEST47为模板，通过PCR扩增获得包含限制性内切酶HindIII与Xho I的酶切位点，多聚组氨酸识别位点，attR重组位点以及自杀基因ccdB的基因片段的阳性克隆，PCR获得的片段经限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切后回收，与同样经过限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切回收的包含有用于引导蛋白穿膜的信号肽Igk的分泌型载体pSecTagB连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性重组子获得用于筛选膜蛋白的真核表达载体pSecTag-attR。

所述的大肠杆菌为感受态DB3.1。

所述的膜蛋白cDNA表达文库是由克隆文库与上述pSecTag-attR表达载体经λ噬菌体特异性重组位点attL与attR进行LR重组反应获得。

所述的稳定表达该文库的细胞株是将该膜蛋白cDNA表达文库经脂质体介导转入哺乳动物细胞，经抗生素筛选获得稳定表达cDNA文库的细胞克隆库，细胞克隆库经抗多聚组氨酸抗体标记，流式分选细胞仪荧光筛选，获得特异性表达膜蛋白的cDNA文库，该文库稳定表达于该细胞。

所述的膜蛋白cDNA表达文库转入的哺乳动物细胞为COS-1细胞。

本发明用于筛选膜蛋白的真核表达载体包含信号肽Igk，多聚组氨酸识别位点以及attR重组位点。

本发明膜蛋白cDNA文库的应用，含有attL重组位点的小鼠肝脏淋巴细胞cDNA克隆文库被转入表达载体，依据上述方法，最终成功建立了小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库，经RT-PCR与流式细胞术分析鉴定，该文库具有高通量及高特异性。

本发明构建膜蛋白cDNA文库的方法，膜蛋白文库的筛选标记为抗多聚组氨酸的荧光抗体，膜蛋白文库的筛选的方法为流式细胞筛选技术。

有益效果

与已有方法相比，本发明提出了一种膜捕获的方法，即利用真核哺乳动物细胞作为表达载体，以Igk先导肽作为蛋白穿膜的信号肽，以多聚组氨酸作为荧光筛选的标记，将cDNA文库编码蛋白向胞外引导，当含有疏水跨膜序列的蛋白穿过细胞膜时，即被细胞膜捕获并固定于膜表面，随后这些细胞被抗多聚组氨酸抗体荧光标记，由流式分选细胞计数仪分选，从而获得了一个高特异性的膜蛋白cDNA文库。该文库通过抗标签蛋白抗体对膜蛋白进行筛选，而不依赖膜蛋白特异的抗体或配体分子；同时，由于分泌型蛋白不含有疏水跨膜片段，文库中可排除分泌型蛋白的干扰；大大提高了筛选效率和筛选特异性，是一种大规模高通量特异的筛选膜蛋白质的方法。

附图说明

图1为attR重组位点片段的PCR扩增的电泳图谱，该片段包含酶切位点，多聚组氨酸识别位点，attR重组位点以及自杀基因ccdB的基因片段，泳道1为DNA marker，泳道2，3为两个独立的克隆。

图2为pSecTag-attR重组载体的构建流程

图3为小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的荧光筛选过程

图4为小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的免疫荧光染色分析，A，B，C，D分别为未转染COS-1细胞，转染后细胞，第一轮流式细胞仪筛选后细胞以及第二轮筛选后细胞。

图5为小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的RT-PCR分析，泳道1-8分别为对基因TLR2，TLR3，TLR4，NKG2A，NKG2D，Bcl-2，Bcl-xl及b-actin的PCR检测。

图6为小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的流式细胞术分析

具体实施方式

实施例1：真核表达载体pSecTag-attR的构建

以真核表达载体pcDNA-DEST47为模板，通过PCR扩增获得包含限制性内切酶HindIII与Xho I的酶切位点，多聚组氨酸识别位点，attR重组位点以及自杀基因ccdB的基因片段，预计长度1800bp，如图1所示，2，3位两个独立的阳性克隆。参数为：94℃40秒，58℃30秒，72℃3分钟，循环30次，末次延伸7分钟。pSecTag-attR重组载体的构建流程如图2所示：PCR获得的片段经限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切后回收，与同样经过限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切回收的包含有用于引导蛋白穿膜的信号肽Igk的分泌型载体pSecTagB连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DB3.1，筛选阳性重组子。该表达载体具有阳性重组子委托上海英骏生物技术有限公司测序，结果与报到序列一致。

实施例2：小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的构建及筛选

2.1小鼠肝脏淋巴细胞总蛋白cDNA表达文库的构建

小鼠肝脏淋巴细胞cDNA克隆文库保存于含有attL重组位点的pDONR207载体中，经λ噬菌体特异性重组位点attL与attR进行LR重组反应，克隆文库中的基因重组进入真核表达载体pSecTag-attR，得到淋巴细胞总蛋白cDNA表达文库，文库载体转化大肠杆菌感受态DH5扩增，文库滴度达到10⁹pfu/ml。

2.2表达文库在COS-1细胞中的表达

cDNA表达文库通过脂质体介导的方法转染至COS-1细胞。首先，COS-1细胞培养在含10％小牛血清的DMEM培养基中，按每孔3×10⁵细胞的量在六孔板中接种指数生长期的COS-1细胞，37℃5％CO2培养细胞至约80％汇片。表达文库载体大量提取纯化后，以5ug/孔的比例由lipofectamine 2000接到转染至COS-1细胞，48h后进行加压筛选，筛选抗生素zeocin浓度为1000mg/L。一周后，获得抗性的细胞被用于膜蛋白文库的荧光筛选。

2.3小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的荧光筛选

表达有小鼠肝脏淋巴细胞cDNA文库的COS-1细胞被消化，清洗后用荧光标记的抗多聚组氨酸抗体进行孵育，表达有膜蛋白的细胞克隆胞外端带有多聚组氨酸标签，为荧光阳性细胞。如图3所示，约有5％的细胞克隆表面有膜蛋白的表达，经过流式分选细胞仪分选，表达膜蛋白的细胞克隆阳性率达到98％以上。抗多聚组氨酸抗体的免疫荧光染色(见图4)同样证明两轮筛选过后，98％以上细胞表达有跨膜蛋白。该文库是一种膜蛋白特异性的小鼠肝脏淋巴细胞cDNA文库。

实施例3：小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的鉴定

3.1小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的RT-PCR分析

对表达有小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA文库的COS-1细胞进行扩增培养，Trizol法提取细胞总RNA，逆转录后的cDNA用不同的检测引物进行PCR鉴定，结果如图5所示，所有检测的膜蛋白(TLR2，TLR3，TLR4，NKG2A，NKG2D，Bcl-2，Bcl-xl)均在文库中有所表达，证明该文库具有高通量，而非膜蛋白-actin则没有表达。证明该文库具有高特异性。

3.2小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库的流式细胞术分析

对表达有小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA文库的COS-1细胞进行扩增培养，收集细胞，大鼠血清封闭，将COS-1细胞与针对小鼠淋巴细胞表面不同受体的抗体进行孵育，如图6所示，与RT-PCR分析结果一致，所检测的典型淋巴细胞膜蛋白受体分子全部在文库中被检测到，证明该文库建立的方法适用于对膜蛋白的高通量筛选。