一种红细胞快速冰箱冻存和解冻方法及其使用的冰冻保护液和洗涤液

摘要

本发明涉及一种红细胞在低温冰箱中长期保存的技术。本发明所述的红细胞冰冻保护液是一种高渗透压的，含有生物相容性大分子物质以及DMSO(二甲基亚砜)的溶液；洗涤液是由基本等渗的溶液和具有生物相容性的大分子物质组成。本发明提供的冻存液，可以使红细胞进入高渗状态而不致严重溶血。利用大分子胶体介质，配置成红细胞洗涤液，可以使红细胞脱离高渗而不致严重溶血状态。然后通过生理盐水洗涤去除大分子物质，即可以得到红细胞盐水悬液。用于相关试验，整个冻存过程大约1分钟，而解冻洗涤过程大约15分钟。红细胞的得率高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种红细胞的长期保存技术。

背景技术

现有技术均是将红细胞先悬浮在高渗透压冻存保护液中，其中主要有效成分是甘油或DMSO(二甲基亚砜)。

例如：Meryman液：57％甘油，3％乳酸钠，0.2％Na₂HPO₄，0.03％KCl。

Huggins液：79％甘油，8％葡萄糖，1％果糖，0.3％EDTA-2Na。

Krijnen液：35％甘油，2.9％山梨醇，0.63％NaCl。

Valeri液：35％甘油，2.88％甘露醇，0.65％NaCl。

其工作原理是让高渗透压甘油渗入红细胞内部，置换出其中的水份，从而减少在冻存过程中红细胞内外冰晶的形成，保护红细胞不被破坏。在红细胞解冻的过程中，由于红细胞内部的高渗状态，必须通过逐步降低红细胞洗涤液渗透压的方法，用渗透压逐渐降低的洗涤液，将红细胞内部的甘油或DMSO重新置换出来，以防止红细胞内部渗透压相对过高而造成的红细胞涨破。整个过程需要2-3小时左右。红细胞的回收率大约在70％-85％。如果将融解的冰冻红细胞直接置于生理盐水溶液中解冻，则红细胞将基本完全溶血。

例如Meryman液保存方法：

在1单位红细胞(约50ml)中加入160ml甘油保护剂，20分钟加完，室温放置30分钟后，直接放入-80℃冰箱。解冻时先在37-40℃快速融化，离心去除甘油，10分钟内缓慢加入9％高渗NaCl溶液80ml，静置3分钟后加入300ml羟乙基淀粉，混匀后，离心10分钟去上清，再加入150ml羟乙基淀粉和100ml生理盐水，1500g离心10分钟。去上清，加200ml生理盐水，1500g离心10分钟。去上清。冰冻和溶解洗涤总耗时约3小时。红细胞回收率约85％。

Huggins液保存方法：

冷冻方法同上。解冻方法使用和红细胞等体积(50ml左右)的50％葡萄糖溶液和1000ml5％果糖，离心10分钟。去上清，再加入5％果糖500ml，混匀后离心10分钟。去上清。同样方法再洗涤1-2次，至上清液中无明显溶血。耗时和回收率大体同上。

这种将红细胞先悬浮在高渗透压冻存保护液中再用不同渗透压的洗涤液逐次洗涤的方法，其主要缺点是过程比较复杂，且耗时。因此本领域迫切需要开发简单、省时的细胞保存方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的长期冰冻保存红细胞的简单方法，该方法解决了现有试剂红细胞冻存技术繁琐、耗时等问题。

本发明的目的之二是提供一种与上述冰冻保存红细胞的方法相适应的红细胞解冻方法。

同时，本发明还提供了上述方法所使用的红细胞冰冻保护液和洗涤液。

本发明利用含有DMSO(二甲基亚砜)的高渗的保存液，配置成红细胞冰冻保护液。该冰冻保护液悬浮红细胞时，可以使红细胞进入高渗状态。同时由于冰冻保护液中含有大分子胶体物质，可以相对锁住水份，降低溶质扩散速度，因此当红细胞与高浓度DMSO快速混合时，不会大量溶血。另外大分子胶体物质还可以抑制红细胞外冰晶对红细胞膜的破坏作用。整个冰冻过程大约1分钟

在解冻时，含有大分子胶体物质的洗涤溶液可以减慢红细胞脱DMSO的速度，因此可以使用不含DMSO的洗涤液直接洗涤融解的红细胞，而不会导致快速溶血。然后通过离心去除大分子胶体物质，即可配成红细胞盐水悬液用于相关试验，整个融解过程大约15分钟。红细胞的最终得率可达到90％左右。

本发明一方面公开了一种红细胞冰冻保护液，为含有生物相容性大分子物质和DMSO的高渗溶液，大分子物质的分子量在20000-400000道尔顿之间，单一大分子物质的重量比体积百分比浓度(W/V)为2-10％。

高渗溶液是指：溶液中的溶质颗粒(包括未离解的分子和已离解的离子)总浓度明显高于正常人血浆渗透压的溶液，例如明显大于300mMol/L(渗透压单位300mOsm/L)，称为高渗透溶液。

DMSO一般浓度(W/V)为10％-40％，-20℃冰箱冻存优选15％-25％，-80℃冰箱冻存优选20％-30％，25％最佳。

本发明另一方面公开了一种红细胞冰冻洗涤液，为含有生物相容性大分子物质的基本等渗的溶液，生物相容性大分子物质的分子量在20000-400000道尔顿之间，单一大分子物质的重量体积百分比浓度为2-10％。

本发明中，生物相容性大分子物质是指：不会造成红细胞明显损害，不会明显改变红细胞生物学特点的大分子物质，一般无明显生物毒性和活性。例如聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、羟乙基淀粉、聚乙二醇、右旋糖苷、明胶、白蛋白等。

上述生物相容性大分子物质优选聚乙烯基吡咯烷酮、羟乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖苷中的一种或多种，配置冰冻保存液或洗涤液时的浓度(W/V)优选2-10％。

上述基本等渗的溶液可以是市售的各种试剂红细胞保存液，也可以根据试剂红细胞保存液的配方自行配置，渗透压要求在250-400mOsm/L(毫渗)范围内(血浆的渗透压约为313mOsm/L，约相当于7个大气压或5330毫米汞柱)。例如乳酸钠缓冲溶液，建议配方：乳酸钠3％(W/V)、磷酸二氢钠0.2％(W/V)。

本发明第三方面，公开了一种快速红细胞冻存方法：首先将新鲜红细胞压积或配成悬浮液，然后与前述的红细胞冰冻保护液混匀，移入低温冰箱保存。低温冰箱是指-20℃或更低温度如-80℃的冰箱。

较佳的，压积红细胞与红细胞冰冻保护液以体积比不超过1∶3(等于或小于1∶3)混匀，优选1∶3混匀。

本发明第四方面，公开了与上述快速红细胞冻存方法对应的解冻方法：从冰箱中取出冰冻红细胞，立即加入前述红细胞洗涤液，待冰冻红细胞融化后，轻摇混匀，离心去除上清液，再加入相对压积红细胞5倍或5倍以上体积的上述洗涤液，充分混匀，离心去除上清液，将红细胞直接配制成红细胞盐水悬液即可。

优选的，首次加入红细胞洗涤液与冰冻红细胞等体积。

融化冰冻红细胞的温度一般为20℃-37℃，优选室温或37℃。

本发明中的重量体积百分比均为以克(g)为单位的重量除以以100毫升(100mL)为单位的体积获得的百分比，例如1％即为100ml溶液中含1g。

本发明的关键在于红细胞冰冻保护液及洗涤液中加入了生物相容性大分子，正是由于生物相容性大分子的加入，使得冻存及解冻快速、简易的目的得以实现。

本发明和现有方法的最大区别在于冰冻的方法。在冰冻过程中，直接将压积红细胞置于冻存液中，混匀后即可放入低温冰箱中。将经典方法30分钟左右的操作缩短到1分钟左右。本发明的红细胞冰冻保护液，可用于长期冰冻保存红细胞，保存时间可达一年以上。

本发明和现有方法的第二点区别在于洗涤液的成份。洗涤液即用于使融解后红细胞脱离高渗状态的溶液。其作用在于保护红细胞在脱离高渗状态时不受伤害。本发明的洗涤液中没有使用高渗的盐、葡萄糖等药品，而是添加了高分子胶体物质。

本发明和现有方法的第三点区别在于红细胞融解和洗涤的方法。由于在洗涤液中添加了生物相容性大分子物质，因此只需洗涤两次，每次无需缓慢加入洗涤液，也无需放置很长时间，即可以获得红细胞盐水悬浮液用于试验。所需时间由经典方法的2个小时以上缩短到15分钟左右，红细胞的最终得率最高可大于90％，超过经典方法。

本发明最大的特点是使用了大分子胶体物质作为红细胞冰冻保存和解冻洗涤的保护剂，因此在冰冻和解冻的操作中，对操作的要求较低，可以快速完成整个操作。

试剂红细胞属于珍稀资源，在输血领域有着十分重要的作用。免疫血液学试验的水平高低，在很大程度上依赖试剂红细胞品种的多少和质量的高低。但由于保存和溶解方法复杂，耗时，使得临床发现的许多珍稀红细胞资源难以得到有效的保存和充分的利用。本发明使得稀有试剂红细胞资源的保存和应用变得十分方便，快捷。因此将有效的提高稀有红细胞资源的利用率，节约试验时间，进而间接提高免疫血液学试验的水平，对输血的有效性和安全性的提高以及血液免疫学研究提供有力的支持。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1不同DMSO浓度下红细胞冰冻保存方法的效果(-20℃冰箱)

实验方法：

1.配置红细胞冻存液及洗涤液。

2.冰冻方法：将1ml压积红细胞和3ml冰冻保护剂分别加入10ml试管中，缓慢颠倒试管数次混匀，置-20℃冰箱保存4小时。

3.解冻方法：取出冰冻红细胞(共4ml)加入4ml解冻洗涤液，置室温或37℃解冻。待完全融解后缓慢颠倒试管数次混匀，4000rpm离心3分钟，去尽上清液。另加解冻洗涤液5ml，缓慢颠倒试管数次，直至将试管底部的压积红细胞完全悬浮。4000rpm离心3分钟，去上清液，加生理盐水7ml配制成红细胞悬液，混匀，解冻记录时间。

4.测定红细胞得率：将上述红细胞盐水悬液经3000rpm离心2分钟后去尽上清液，剩余的压积红细胞即为试验组，另取1ml未经冰冻的压积红细胞为对照组，两组均加生理盐水至2ml，用反复冻融法使红细胞完全溶血，4000rpm离心3分钟去除细胞膜，取溶血液待检。用多功能分光光度计检测540nm光吸收值，用盐水将对照组倍比稀释，制作标准曲线，对照标准曲线将试验组溶血液中检测到的光吸收值(OD值)换算成红细胞浓度。

红细胞冻存液配方：(以下百分比均为W/V％)

  序  号  DMSO浓度  右旋糖苷或者羟乙基  淀粉或者PVP浓度  乳酸浓度 Na₂HPO₄ 浓度  1  10％  10％  3％ 0.2％  2  15％  10％  3％ 0.2％  3  20％  10％  3％ 0.2％  4  25％  10％  3％ 0.2％  5  30％  10％  3％ 0.2％  6  35％  10％  3％ 0.2％  7  40％  10％  3％ 0.2％

红细胞洗涤液配方：(以下百分比均为W/V％)

 右旋糖苷或者羟乙 基淀粉或者PVP浓度  乳酸浓度 Na2HPO4 浓度 10％  3％ 0.2％

实验结果：如表1所示

表1不同DMSO浓度，存-20℃冰箱，各步骤损失的红细胞比例和红细胞回收率

*所有试验解冻时间均在20分钟之内。

实施例2不同DMSO浓度下红细胞冰冻保存方法的效果(-80℃冰箱)

实验方法同实施例1，仅将冰箱换为-80℃冰箱。红细胞冻存液及洗涤液配方也与实施例1相同。

实验结果：如表2所示

表2不同DMSO浓度，存-80℃冰箱，各步骤损失的红细胞比例和红细胞回收率

*所有试验解冻时间均在20分钟之内。

实施例3不同大分子物质冰冻红细胞方法的影响

实验方法同实施例1。

红细胞冻存液配方：(以下百分比均为W/V％)

  序  号  DMSO浓度  右旋糖苷  浓度  羟乙基淀粉  浓度  PVP  浓度  乳酸浓度  Na₂HPO₄  浓度  1  20％  10％  3％  0.2％  2  20％  5％  3％  0.2％  3  20％  2％  3％  0.2％  4  20％  10％  3％  0.2％  5  20％  5％  3％  0.2％  6  20％  2％  3％  0.2％

 7  20％  10％ 3％  0.2％ 8  20％  5％ 3％  0.2％ 9  20％  2％ 3％  0.2％

红细胞洗涤液配方：(以下百分比均为W/V％)

  序  号  右旋糖苷  浓度  羟乙基淀粉  浓度  PVP  浓度  乳酸浓度  Na₂HPO₄  浓度  1  10％  3％  0.2％  2  5％  3％  0.2％  3  2％  3％  0.2％  4  10％  3％  0.2％  5  5％  3％  0.2％  6  2％  3％  0.2％  7  10％  3％  0.2％  8  5％  3％  0.2％  9  2％  3％  0.2％

实验结果：如表3所示

表3不同大分子物质在2％～10％浓度间对冰冻红细胞方法的影响(以下百分比均为W/V％)

*所有试验解冻时间均在20分钟之内。