一种重组人生长激素基因的杆状病毒及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种重组杆状病毒及其制备方法和应用。本发明构建含有人生长激素基因HGH的重组杆状病毒，可在家蚕中高效表达重组HGH蛋白，经药物实验证明所述重组HGH蛋白制品在动物体内无毒副作用，安全可靠，口服吸收效果好，可延缓衰老。本发明原料易得，生产成本低，具有重要的产业化价值，并具有作为口服药物和食品的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。

背景技术

人生长激素(HGH，Human Growth Hormone)是一种由人体自身分泌的一 种多肽，由191氨基酸残基组成的单链球状蛋白，分子量为22000道尔顿，由 脑下垂体分泌出，经由下丘脑释放，主控生长发育、免疫和人体新陈代谢。HGH 刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖，刺激软骨基质细胞增长，引起线性生长加速 及骨骼变宽；调节生长激素不足或成人的脂肪、骨代谢、心肾功能，改善运动 能力和生活质量。

HGH对脂肪组织有促进脂肪分解而使血浆游离脂肪酸升高的作用；HGH 可促进许多组织中RNA及蛋白质的合成，出现正氮平衡，使软骨、骨骼、肌 肉结缔组织及内脏皆增长。生长激素通过血液运输到肝脏并刺激肝脏产生一种 被称为类胰岛素生长因子的蛋白质分子(IGF-1)，增加软骨中胶原和其他蛋白 质、硫酸软骨素、核酸合成的作用，从而促进软骨细胞的分裂和基质增生，促 进骨骼和结缔组织的生长。除了这些促进生长的作用外，生长激素还参与机体 的代谢调控，它在减少存储于脂肪细胞中的大量油脂、促进细胞内蛋白质分子 的聚合、调控血糖水平方面都起着重要作用。因此生长激素对正在生长的机体 的整体形态和机能有多方面的影响，在成人阶段也会继续发挥作用，在修复和 维护机体不同组织的过程中充当着重要角色，但成年后其分泌随年龄增大而减 少。人到达30岁后每十年间HGH分泌就以15％的速率递减，从而引起人体老 化。尤其今日的生活环境里，各种压力、不良习惯及食物毒素所造成的危害， 使得HGH分泌量迅速减少，人类更因此加速衰老。

1920年，科学家发现生长激素。1958年，Herber Boyer潜心研究38年的 HGH利用基因重组技术成功问世，并于当年获得诺贝尔生物学奖。1996年， 美国FDA批准利用基因工程技术合成的HGH用于人体抗衰老。随着这种重组 激素的大量出现，用生长激素治疗疾病成为可能，缺乏生长激素的儿童和成人 现在可以通过补充生长激素来治疗。由于遭受某种疾病(如艾滋病)导致肌肉 萎缩和身体虚弱的患者也可以从这种补充中获益。目前HGH在激素替代疗法 中广泛使用，但因其在肠道极易代谢失去活性，市场上的HGH制剂主要是注 射剂。

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首 次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(smith，Mol Cell Biol.，3：2156.2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国 就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、 慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒 糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。杆状病毒包括 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BssNPV、EOSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、 MbMNPV、UpMNPV、S1MNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕、 野蚕等。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕杆状病毒表达系统是世 界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种重组杆状病毒及其制备方法以及其在制备 重组HGH蛋白中的应用。

本发明提供的重组杆状病毒，该病毒含有HGH基因，所述HGH基因序列 见SEQ ID NO.1所示，此重组病毒可接种家蚕，表达重组HGH蛋白。当然， 本发明的重组杆状病毒不仅可以接种家蚕，还可接种其它昆虫细胞。

在一个具体实施方式中，本发明提供的重组杆状病毒为家蚕杆状病毒。利 用本发明的家蚕杆状病毒接种家蚕，可获得家蚕生物反应器。该反应器可大规 模生产，具有资源优势和成本优势。该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址为北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号为 CGMCC No.2031，分类命名为家蚕核型多角体病毒Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，保藏日期为2007年4月28日。

一方面，本发明提供一种制备重组杆状病毒的方法，该方法包括：制备人 生长激素HGH基因；将制备的含HGH基因的融合基因导入杆状病毒中，形成 重组杆状病毒。在一个具体实施方式中，本发明提供制备重组杆状病毒的方法， 是通过PCR扩增人生长激素HGH基因，经酶切后导入转移载体获得重组转移 载体。然后使该重组转移载体与线性化杆状病毒同源重组，将外源基因插入杆 状病毒中，得到含有HGH基因的重组杆状病毒。

另一方面，本发明提供一种重组杆状病毒在制备重组HGH蛋白中的应用。

另一方面，本发明提供一种利用本发明所述的重组杆状病毒制备重组HGH 蛋白的方法。该方法包括将本发明所述的重组杆状病毒接种家蚕，大量表达后， 分离纯化，冷冻干燥。

在一个具体实施方式中，将本发明所述的重组杆状病毒接种家蚕，接种后 5-7天，收集蚕体，-20℃冻存。取冻存蚕蛹样品，粉碎并离心过滤。取过滤后 的匀浆液，离心去除病毒粒子，-50℃冷冻干燥，即得HGH冻干粉。

本发明中优化的杆状病毒表达系统为家蚕杆状病毒表达系统，通过基因重 组，将HGH基因重组进家蚕杆状病毒BmBacPAK6，获得重组家蚕杆状病毒 BmBacHGH，使携带HGH基因的BmBacHGH在不同发育阶段的家蚕(幼虫、 蛹等)中繁殖，应用家蚕作为宿主的生物反应器生产HGH。同样，利用别的杆 状病毒表达系统，如AcMNPv、ApNPv、等也可按同样的方法表达生产。用基 因重组技术，将HGH基因在多角体启动子或别的病毒和真核生物的强启动子 的控制之下，通过体内或体外重组，将HGH基因整合到杆状病毒的基因组上， 得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄 (最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体，表达生产重组HGH蛋白。

本发明中最优化的方案是将HGH基因插入到pAcHLT-B杆状病毒转移载体 上，再通过体内重组将HGH基因转移到家蚕杆状病毒BmBacPAK6的基因组上， 通过噬斑筛选技术，获得携带HGH的大量重组家蚕杆状病毒BmBacHGH。将 其接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，可大量繁殖。当在蚕体内复制时，HGH基因在 多角体蛋白基因启动子控制下表达，产生HGH。在感染5-7天后收集含有HGH 的家蚕幼虫或蛹，冻存，粉碎并通过100目网离心过滤，离心去除病毒粒子， 取上清，-50℃冷冻干燥，即得重组HGH蛋白冻干粉。HGH基因得到高表达， 每个蛹体重组HGH蛋白的产量可达到0.5mg，活性大于1×10⁷IU/ml。而常规 的原核表达，其表达量是0.05-0.3mg/ml菌液。

利用此系统来生产的优点在于：

1.这一表达系统的表达效率极高，重组HGH蛋白产量可达0.5mg/虫的水 平，因而可大大降低生产成本，并进行大规模生产。

2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰， 使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的HGH具有正常 的生物学活性提供了保证。

3.用此系统生产的HGH无需经过繁复的纯化步骤，只需将表达HGH的幼 虫或蛹初步加工，即可得有生物活性的重组HGH蛋白，大大降低了生产成本。

在一个具体实施方式中，本发明利用家蚕为生物反应器，表达具有临床应 用价值的重组HGH蛋白。本方法生产的重组HGH蛋白冻干粉经口服、鼻饲、 灌胃用药具有生物活性，在大鼠、猕猴中鼻饲和灌胃试验证实重组HGH蛋白 冻干粉无毒害作用；在小鼠和果蝇口服进行的药效学实验证实其具有延缓衰老 作用。本方法适用于大规模生产，成本低，产量高，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1.重组转移质粒pAcHLT-HGH环状图谱；

图2.家蚕血淋巴样品中的重组HGH蛋白的鉴定图；

(A)SDS-PAGE电泳分离

M.分子量标准品；

1.感染野生杆状病毒BmBacPAK6的对照组；

2.感染重组病毒BmBacHGH组，箭头示重组HGH蛋白。

(B)Western blot鉴定

1.感染野生杆状病毒BmBacPAK6的对照组；

2.感染重组病毒BmBacHGH的样本组。

具体实施方式

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

1.设计引物，从重组质粒PWR-HGH中PCR扩增人生长激素HGH基 因。

2.构建pAcHLT-HGH载体。经EcoR I与Sac I双酶切的HGH基因片 段通过T4DNA酶连接克隆至经EcoR I与Sac I双酶切的pAcHLT-B杆状 病毒转移载体中，使HGH基因置于多角体蛋白(polyhedrin，ph)基因启动 子控制之下，构建成重组转移质粒pAcHLT-HGH。

3.制备含HGH基因的家蚕重组杆状病毒BmBacHGH。在事先培养的 BmN细胞中逐滴加入pAcHLT-HGH转移质粒、经线性化病毒BmBacPAK6 DNA和Dosper混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮噬斑筛选和 第二轮噬斑筛选。取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即可得到大量的含 HGH基因的重组杆状病毒BmBacHGH。

4.在家蚕幼虫和蛹中表达重组HGH蛋白。将重组病毒接种于表面消毒 过的蚕幼虫或蚕蛹，接种后5-7天，收集蚕蛹，-20℃冻存。取冻存蚕蛹样 品，粉碎并通过100目网离心过滤。取过滤后的匀浆液，离心去除病毒粒子， 取上清，-50℃冷冻干燥，即得重组HGH蛋白冻干粉。

下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容：

实施例1.HGH基因的扩增

以HGH基因为模板设计一对引物，上游引物含EcoR I酶切位点，下游引 物含Sac I酶切位点，引物设计如下：

上游引物P1：5’GGGAATTCAGTTTCCTAC-TATACCAC 3’(SEQ NO.2)；

下游引物P2：5’TTGAGCTCCTAGAAGCC-ACAGCTGCC 3’(SEQ NO.3)。

从重组质粒PWR-HGH(上海生化所吴祥甫老师惠赠)中PCR扩增人生长 激素HGH基因。以重组质粒PWR-HGH为模板，94℃预变性5min后，94℃ 变性1min；57℃退火1min；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩 增得到目的HGH基因片段。

实施例2.构建含HGH基因的pAcHLT-HGH载体

经EcoR I与Sac I双酶切的HGH基因片段通过T4DNA酶(MBI)连接 克隆至经EcoR I与Sac I双酶切的pAcHLT-B杆状病毒转移载体(购自BD Biosciences Pharmingen)中，使HGH基因置于多角体蛋白(polyhedrin，ph) 基因启动子控制之下，构建成重组转移质粒pAcHLT-HGH(如图1)，经酶切分 析以及测序鉴定基因序列正确。在家蚕表达体系中重组蛋白HGH以融合蛋白 的形式表达。

实施例3.家蚕重组杆状病毒BmBacHGH的制备

取5μl重组转移质粒pAcHLT-HGH DNA和6μl经线性化病毒 BmBacPAK6DNA(购自上海生化细胞所)，加入100μl无血清的TC-100培养 基(购自GIBCOBRL公司)混匀。取6μl Dosper(宝灵曼公司)加入100μl 无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm平皿中的BmN细胞(购自 上海生化细胞所)用无血清的TC-100培养基洗涤两次，并逐滴加入 pAcHLT-HGH转移质粒和Dosper混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一 轮噬斑筛选。取5μl上清感染35mm平皿中的Bm N细胞，1小时后弃去上清 加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染BmN 细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以HGH 基因作模板用随机引物探针标记试剂盒(宝灵曼公司)标记探针，杂交方法按 照《分子克隆》(科学出版社，1995)。

取阳性克隆的上清进行第二轮噬斑筛选。取阳性克隆的上清感染家蚕细胞 扩增。即可得到大量的含HGH基因的重组杆状病毒BmBacHGH。该病毒感染 家蚕细胞后，在显微镜下细胞呈发病状。该重组杆状病毒已提交中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2007年4月28日，保藏 编号为2031。

实施例4.重组HGH蛋白的表达及鉴定

约10⁶pfu重组病毒通过接种针感染每条五龄蚕，接种后约120小时幼虫或 蛹几乎全部发病，采取蚕体液和蛹体，经高速离心(12000rpm，30min)，取上 清测血淋巴中重组HGH蛋白的表达。蛋白样品于15％SDS-PAGE上进行电泳 分离。结果显示：在约27KDa处感染重组病毒的血淋巴样品有一明显条带(图 2，A)，大小与重组HGH蛋白的理论值相当，而在感染野生病毒的对照蛋白样 品中并不存在这一条带。为了验证这一特异性蛋白是否可以与HGH抗血清发 生特异性免疫反应，我们进行了Western blot印迹反应，如图2(B)所示，2为 感染重组病毒BmBacHGH的家蚕样本，显示该蛋白条带可以与HGH抗血清发 生特异性反应，由此可以判断该蛋白为重组HGH蛋白。

实施例5.重组HGH蛋白生物活性测定

将HGH标准品配制成自2.5μg/ml至62ng/ml一系列浓度的溶液，参照分 子克隆一书所示方法进行ELISA检测。4℃过夜的条件下蛋白样品被包被到96 孔上，用PBST洗涤后用含1％BSA的PBS溶液封闭，37℃1h；HGH抗血清 按1∶3000稀释后，与包被蛋白37℃孵育2h；PBST溶液洗涤3次，每次5-10min； 加入1∶2000稀释的二抗(兔抗HGH抗血清，购自sigma公司)37℃孵育1h； OPD柠檬酸钠缓冲液显色后测OD492，并以此建立标准曲线表示蛋白浓度与吸 光度的关系。细胞表达蛋白样品与蚕血淋巴在同样的条件下进行ELISA，分别 测得OD492值，根据标准曲线可以计算样品中重组HGH蛋白的含量和效价。。 每个蛹体重组HGH蛋白的产量可达到0.5mg，活性大于1×10⁷IU/ml。

实施例6.重组HGH口服药物的制备及动物实验

蚕蛹在接种BmBacHGH前经70％食用酒精浸泡3min，进行表面消毒。感 染5-7天，收集蚕蛹，-20℃冻存。取适量冻存蚕蛹样品，用二级胶体磨粉碎 并通过100目网离心(600rpm，10min)过滤。取过滤后的匀浆液，12000rpm 离心20-60min，取上清，再30000rpm离心30-90min，去除病毒粒子，离心结 束后，取上清，真空冷冻干燥机中冷冻干燥(-50℃)，制成冻干粉。

辅料制造：正常9日龄蚕蛹，用70％食用酒精浸泡3分钟进行表面消毒。 经低温(0～-20℃)粉碎匀浆，过100目网筛(600rpm×30min)，取上清液冷 冻干燥(冻干条件与HGH原料相同)。冻干粉留样检定，其余冷藏于4℃，检 定合格后作为辅料。

根据HGH含量，按比例加入辅料使HGH含量在13μg/100mg以上。充分 混匀后填装胶囊，包装后为成品。以下动物实验，剂量均是HGH的实际含量 计算。

实施例7.重组HGH口服药物的毒性实验及药效实验

实验动物：猕猴(Macaca mulatta)由福建省计划生育科学技术研究所非人 灵长类实验中心提供，实验动物质量合格证(生产猕猴)：闽实动质准第12号。 猕猴16只，体重3.6～5.8kg，雌雄各半，随机分为4组，重组人生长激素(HGH) 低、中、高三个剂量组分别100-300μg、400-800μg、1100-1300μg/kg/d，， 另设蒸馏水作溶剂对照组，采用鼻饲灌胃给药，连续给药52天，剖杀8只动物 (雌雄各半)，其余动物停药30天作恢复期观察，分别对给药期和恢复期各剂 量组猕猴体重、进食量、呼吸、血压、心电图、血液学、尿液、血液生化学、 脏器系数等各项指标进行检测，结果表明，各用药组上述检测指标与用药前比 较均未见明显异常。对各组猕猴主要脏器进行病理组织学检查，未发现有毒理 意义的组织学改变。猕猴灌胃给予重组人的生长激素(HGH)高剂量，连续 52天，未发现明显毒性反应，多项检测均属正常。

长毒实验：SD大鼠灌胃给药重组人生长激素胶囊1250μg/kg/d，连续60 天，结果显示：毒性反应为血糖含量增高，停药30天恢复正常水平，毒性反应 系可逆性。重组HGH蛋白的大鼠灌胃实验结果显示，无毒副反应的安全剂量 为250μg/kg/d以下。急毒结果显示，重组HGH对NIH小鼠和SD大鼠经灌胃 给药的最大耐受量均大于3300ug/kg。

小鼠的重组HGH给药的药效学实验(参见表1)：小鼠口服给予该胶囊50 天后与空白对照组相比，低剂量组(0.05g/日/60kg)心脏脂褐素含量下降22％， 肝脏SOD比活力提高16％，中剂量组(0.1g/日/60kg)心脏脂褐素含量下降13 ％(P＜0.05)，肝脏SOD比活力提高19％(P＜0.01)，高剂量组(0.3g/日/60kg) 心脏脂褐素含量下降12％(P＜0.05)，肝脏SOD比活力提高28％(P＜0.001)。

果蝇实验结果表明与空白对照组相比(参见表2)，低剂量组雄性果蝇平均 寿命延长了11％(P＜0.05)，中剂量组雄性果蝇平均寿命延长了12％(P＜0.05)， 半数死亡时间延长8天，雌性果蝇平均寿命延长8％，高剂量组雄性果蝇平均 寿命延长了14％(P＜0.05)，半数死亡时间延长7天，雌性果蝇平均寿命延长 10％。

  空白对照组   低剂量组   中剂量组   高剂量组   心脏脂褐素   (μg/g湿组   织)   7.02±0.4   5.48±0.35   6.11±0.41   6.18±0.37   肝脏SOD比   活力(Nu/ml)   58.0±16.4   67.3±18.1   69.02±17.5   74.24±17.1

表1.小鼠的不同剂量重组HGH蛋白的药效结果

表2.果蝇的不同剂量重组HGH蛋白的药效结果

可见，该重组HGH蛋白制品在动物体内无毒副作用，安全可靠，口服吸 收效果好，可延缓衰老。

SEQUENCE LISTING序列表

<110>浙江中奇生物药业股份有限公司

<120>一种重组人生长激素基因的杆状病毒及其制备方法与应用

<130>081003-I-CP-NZJ

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>654

<212>DNA

<213>HGH

<400>1

atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg    60

cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg   120

ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc   180

tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc   240

tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag   300

ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg   360

agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta    420

aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg    480

actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac    540

gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag    600

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<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>引物P1

<400>2

gggaattcag tttcctacta taccac                 26

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>引物P2

<400>3

Ttgagctcctagaagccacagctgcc                   26