重组杆状病毒作为一种新型的基因治疗载体的研究

摘要

长期以来，由于其宿主特异性，杆状病毒载体仅限于在昆虫细胞内表达外源蛋白。但最近的研究发现，携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能有效转导哺乳动物细胞并且可以在哺乳动物细胞中高效表达外源蛋白。由于其转导效率高、易操作、增殖滴度高、易扩增、载体容载量大、在哺乳动物细胞中不复制和生物安全性好等优点，重组杆状病毒有望成为良好的基因治疗载体。
　　 Apoptin是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白，能特异性诱导大量的肿瘤细胞和转化细胞产生凋亡，而对正常二倍体细胞无凋亡诱导作用。特异的肿瘤细胞杀伤性使Apoptin成为癌症基因治疗的一种新的工具。
　　 Duchenne型肌营养不良症（Duchenne musculardystrophy，DMD）是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性X-性连锁隐性遗传性肌病，目前尚无有效的治疗方法，基因治疗被认为是治疗该病最有希望的途径。但是现有的基因治疗载体的载体容载量少、需要复制辅助病毒和存在着生物安全性等局限性大大的限制它的临床应用。因此提高治疗基因在体内的表达效率以及选择合适的载体将是治疗DMD获得成功的关键。
　　 鉴于上述的研究背景，本研究探讨了含有Apoptin蛋白的重组杆状病毒在体外、体内的抑瘤的作用；研究了含有microdystrophin蛋白的重组杆状病毒在体内和体外的microdystrophin表达情况，比较了重组杆状病毒和重组腺病毒在体内基因治疗mdx鼠的效果。主要研究内容如下：
　　 1．重组杆状病毒BV-Apoptin的构建
　　 从质粒pVAX-Apoptin中PCR扩增全长的Apoptin片段，经酶切克隆到真核表达载体pcDNA3.1-HisB中，构建重组质粒pcDNA3.1-His-Apoptin。然后将CMV启动子驱动的编码Apoptin蛋白的整个读码框插入转移载体pFast-VSV-G中VSV-G的下游，构建转移载体pFast-G-Apoptin。将此重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌，通过蓝白斑菌落及抗性筛选，获得重组穿梭载体Bacmid-Apoptin，提取其基因组并转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒BV-Apoptin。
　　 2．重组杆状病毒BV-Apoptin的体外转导研究
　　 重组杆状病毒BV-Apoptin在细胞中有正确的定位。在人肝癌细胞HepG2中Apoptin主要定位于细胞核，在人胚肾细胞HEK-293中，Apoptin定位于细胞质中。体外转导试验表明，构建的重组杆状病毒BV-Apoptin能高效转导HepG2细胞，Apoptin的表达水平与杆状病毒的感染剂量成正相关，当感染复数越高，表达Apoptin蛋白的细胞数越多。
　　 3．重组杆状病毒BV-Apoptin在体外、体内的抑瘤作用
　　 将重组杆状病毒BV-Apoptin分别以不同感染复数转导HepG2细胞，通过DNA-Ladder和TUNEL检测细胞凋亡。结果显示，重组杆状病毒BV-Apoptin能够诱导转导的人肝癌细胞HepG2的产生凋亡，并且BV-Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的能力呈剂量依赖性。实验利用异体同源肿瘤细胞系移植的方法复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型，研究构建的重组杆状病毒BV-Apoptin的体内抑瘤效果。结果显示，注射BV-Apoptin能够明显抑制小鼠肿瘤的生长，同时也提高荷瘤小鼠的存活率。以上结果提示，重组杆状病毒BV-Apoptin有望成为治疗肿瘤的一种新的有效手段。
　　 4．重组杆状病毒BV-MICDYS的构建
　　 从载体pcDNA3.1（+）中酶切CMV启动子的表达框，插入转移载体pFast-VSV-G中VSV-G的下游，构建转移载体pFast-G-CMV；然后从质粒pBSK-MICRO酶切全长的microdystrophin基因，分别克隆到pFast-G-CMV中，构建质粒pFast-G-MICDYS。转化DH10Bac大肠杆菌，通过蓝白斑菌落及抗性筛选，获得重组穿梭载体Bacmid-MICDYS，提取其基因组并转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒BV-MICDYS。
　　 5．重组杆状病毒BV-MICDYS转导C2C12细胞
　　 将构建的重组杆状病毒BV-MICDYS以不同的感染复数（50、100、200MOI）转导C2C12细胞，转导后48h检测microdystrophin基因的表达。结果显示，重组杆状病毒BV-MICDYS能高效转导C2C12细胞，呈现明显的剂量依赖性。结果还显示，相同感染复数的Ad-MICDYS感染的C2C12细胞中microdystrophin蛋白表达数量低于相同感染复数BV-MICDYS转导的C2C12细胞中microdystrophin蛋白表达数量，说明了在C2C12细胞中，杆状病毒有着比腺病毒更高的靶基因表达水平的能力。
　　 6．体内研究重组杆状病毒BV-MICDYS在mdx TA中的转导
　　 将重组杆状病毒BV-MICDYS分别以不同的剂量（1010pfu/mL，109pfu/mL，108pfu/mL）注射到mdx TA，2周和8周后做肌肉组织冰冻切片，HE检测肌肉病理的改善情况，免疫组化检测microdystrophin蛋白的表达，同时做原位检测等长拉伸诱导损伤后TA肌肉收缩力恢复情况。试验结果表明，在注射后2周，重组杆状病毒BV-MICDYS能介导microdystrophin蛋白在小鼠体内的肌肉细胞中高效表达，并且表达水平其呈现剂量依赖性，能更好的改善肌肉病理状况。但重组杆状病毒在注射后8周，未检测到其治疗效果，显示重组杆状病毒BV-MICDYS较适用于DMD的短期治疗。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表(Abbreviation)

声明

第1章 文献综述

前言

1.1杆状病毒-一种新型的基因治疗载体

1.1.1基因治疗的诞生与发展现状

1.1.2基因治疗的方法

1.1.3基因治疗的载体

1.1.4基因治疗的应用

1.1.5关于基因治疗的安全性的研究

1.1.6基因治疗的主要障碍研究

1.1.7基因治疗的前景

1.1.8杆状病毒简介

1.1.9杆状病毒表达系统的优点

1.1.10杆状病毒作为基因治疗载体的研究概况

1.2凋亡素(Apoptin)

1.2.1 Apoptin的来源及其分子生物学特性

1.2.2 Apoptin诱导肿瘤细胞的凋亡

1.2.3 Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制

1.2.4 Apoptin在肿瘤治疗上的进展和应用前景

1.3 DMD疾病及其研究进展

1.3.1 DMD疾病简述

1.3.2 Dystrophin基因及其蛋白

1.3.3 DMD治疗研究的动物模型

1.3.4 DMD的发病机制学说

1.3.5 DMD的治疗方法及进展

第2章 研究目的与意义

第3章 材料与方法

3.1试验材料

3.1.1毒株与细胞

3.1.2菌种与质粒

3.1.3主要药品及试剂

3.1.4培养基与抗生素及其配制

3.1.5缓冲液

3.1.6实验动物

3.2实验方法

3.2.1限制性内切酶酶切反应

3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测

3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化

3.2.4外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3.2.6连接产物的转化

3.2.7质粒的制备与鉴定

3.2.8质粒转染(脂质体介导转染法)

3.2.9构建重组杆状病毒的操作流程及示意图

3.2.10重组穿梭载体(Bacmid)的构建

3.2.11重组穿梭载体(Bacmid)的提取

3.2.12重组杆状病毒获得

3.2.13重组杆状病毒转导体外培养的细胞

3.2.14间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的体外表达

3.2.15 Western blotting检测目的蛋白在真核细胞中的表达

3.2.16流式细胞仪检测重组杆状病毒转导目的基因的表达

3.2.17重组杆状病毒BV-Apoptin介导的细胞凋亡检测

3.2.18动物试验

3.2.19数据统计

3.2.20技术路线

第4章 结果和分析

4.1表达凋亡素(Apoptin)蛋白的重组杆状病毒BV-Apoptin的构建

4.1.1 Apoptin基因的PCR扩增

4.1.2重组质粒pcDNA3.1-His-Apoptin的构建

4.1.3含凋亡素的重组杆状病毒Bac-Apoptin的构建

4.1.4重组杆状病毒BV-Apoptin获得及纯化

4.2重组杆状病毒BV-Apoptin转导体外培养的肿瘤细胞

4.2.1 Western-blot检测重组杆状病毒BV-Apoptin转导HepG2细胞后Apoptin的表达

4.2.2间接免疫荧光检测重组杆状病毒BV-Apoptin转导后Apoptin的表达及其定位

4.2.3流式细胞仪检测检测重组杆状病毒BV-Apoptin转导HepG2细胞后Apoptin的表达

4.3重组杆状病毒BV-Apoptin体外诱导细胞凋亡

4.3.1重组杆状病毒对HepG2细胞形态的影响

4.3.2 DNA Ladder检测分析结果

4.3.3重组杆状病毒BV-Apoptin诱导细胞凋亡的TUNEL染色观察

4.4重组杆状病毒BV-Apoptin抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长

4.4.1治疗最佳剂量和接种治疗时间间隔的确定

4.4.2抑瘤实验模型建立情况

4.4.3荷瘤小鼠临床症状及剖检结果

4.4.4治疗后各实验组肿瘤生长趋势

4.4.5重组杆状病毒治疗后的抑瘤率

4.4.6重组杆状病毒BV-Apoptin治疗后小鼠存活情况

4.4.7移植瘤切片组织形态及凋亡检测

4.5表达Microdystrohpin蛋白的重组杆状病毒BV-MICDYS的构建

4.5.1含Microdystrophin的重组杆状病毒Bac-MICDYS的构建

4.5.2重组杆状病毒BV-MICDYS获得及纯化

4.6重组杆状病毒BV-MICDYS转导体外培养的C2C12小鼠成肌细胞C2C

4.6.1 Westem-blot检测杆状病毒转导后C2C12细胞中microdystrophin的表达

4.6.2免疫组化检测杆状病毒转导后的C2C12细胞中microdystrophin的表达

4.6.3流式细胞仪检测杆状病毒感染后的C2C12细胞中microdystrophin表达

4.7重组杆状病毒BV-MICDYS对mdx小鼠的治疗效果研究

4.7.1重组杆状病毒BV-MICDYS肌肉注射治疗TA的效果检测

4.7.2杆状病毒治疗后mdx鼠TA等长收缩力的测定

第5章 讨论与结论

5.1讨论

5.1.1选择杆状病毒作为基因治疗载体的依据

5.1.2 VSV-G修饰的重组杆状病毒的构建

5.1.3杆状病毒转导哺乳动物细胞可能机制探讨

5.1.4肿瘤与细胞凋亡

5.1.5 Apoptin的细胞内定位与诱导凋亡特异性

5.1.6重组杆状病毒BV-Apoptin作用后肿瘤细胞凋亡的检测

5.1.7重组杆状病毒BV-Apoptin对移植瘤的抑制作用

5.1.8 microdystrophin基因特点及治疗DMD的功效

5.1.9 microdystrophin蛋白在体外转导效率的探讨

5.1.10重组杆状病毒治疗后肌肉功能改善的探讨

5.1.11重组杆状病毒在DMD治疗中的前景探讨

5.2结论

参考文献

致谢

附录