放射性配基N

摘要

放射性配基N

说明书

技术领域

放射性配基N₂S₂-Memantine和脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，属于核医学分析检测技术领域。

背景技术

病理学研究证实，许多精神疾病包括痴呆、精神分裂、帕金森疾病等与脑内NMDA(N-甲基天冬氨酸)受体异常有关。研究和开发能够有效量化局部脑组织NMDA受体和该受体活性状态改变的显像剂，从分子水平上展现脑的生理、病理状态，对与受体有关的疾病作出诊断，并用于指导合理用药以及疗效评价和预后判断，是至关重要的。目前国外有用[¹⁸F]、[¹¹C]或[¹²³I]标记不同类型的N-甲基天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂的报道^[6-10]，但^99mTc标记的NMDA受体显像剂国内外均无报道。美金刚胺(Memantine)是一种具有中等亲和力的NMDA受体拮抗剂，可以抑制兴奋性氨基酸的神经毒性而不干扰学习、记忆所需的短暂的谷氨酸生理性释放，具有神经元保护作用，我们以美金刚胺为原料，经过结构改造，引入N₂S₂基团，得到一种全新的双功能化合物N-[2-(N-(2-巯基乙基))氨基甲酰甲基]-N-(2-巯基乙基)-3，5-二甲基金刚烷胺基乙酰胺(N₂S₂-Memantine)，与锝络合得到新的锝标记化合物^99mTc-Memantine(结构式见图1)。经改造后的拮抗剂与NMDA受体结合情况也会相应的改变，能否成为一种更有效的NMDA受体拮抗剂，^99mTc-Memantine能否成为一种新的SPECT显像药物，必须对其性质进行深入研究，其中油水分配系数的测定极为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种放射性配基N₂S₂-Memantine和脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，^99mTc-Memantine的油水分配系数与药物在体内的溶解、吸收、分布、转运有关，是决定药物能否进脑的一个重要因素之一，通过油水分配系数测定，可推测新药的一些药理作用，因此通过体外测定N₂S₂-Memantine及^99mTc-Memantine的油水分配系数，可以模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况。

本发明的技术方案：一种放射性配基N₂S₂-Memantine的油水分配系数测定方法，放射性配基^99mTc标记前体N-[2-(N-(2-巯基乙基))氨基甲酰甲基]-N-(2-巯基乙基)-3，5-二甲基金刚烷胺基乙酰胺，简称N₂S₂-Memantine，采用N₂S₂-Memantine在正辛醇-水或正辛醇-磷酸盐缓冲液体系中，用HPLC法测定N₂S₂-Memantine的油水分配系数，25℃时，N₂S₂-Memantine的油水分配系数lgP为1.70，步骤为：

(1)溶液配制

精密称取N₂S₂-Memantine 1.0g，置于100mL量瓶中，加入适量甲醇溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为10mg/mL的贮备液；

(2)线性关系确定

精密量取贮备液适量，置于10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积A；以N₂S₂-Memantine质量浓度mg/mL计ρ为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归，得N₂S₂-Memantine的线性回归方程为：A＝4×10⁶ρ+3173.1，r²＝0.9996，结果表明N₂S₂-Memantine在0.1～1.0mg/mL内呈良好线性关系；

另取0.1mg/mL的N₂S₂-Memantine溶液加流动相稀释配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积A，得到N₂S₂-Memantine的回归方程为：A＝4×10⁶ρ-1855.7，r²＝0.9989，表明N₂S₂-Memantine在0.005～0.1mg/mL内也呈良好的线性关系；

色谱条件：

色谱柱：Lichospher C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈、水和三氟乙酸，其中：乙腈∶水体积比为2∶1，三氟乙酸为流动相总体积的2％；紫外检测波长：230nm，流速：1.00mL/min，柱温：25℃；

(3)油水分配系数的测定

精密称取N₂S₂-Memantine适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为1.0mg/mL的溶液，取该溶液2mL于10mL具塞管中，加入2mL正辛醇饱和的水、氮气保护25℃摇床振摇72h，离心，分别取油相和水相各20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，代入标准曲线计算N₂S₂-Memantine的浓度，油相浓度为ρ_n，水相浓度为ρ_w，由公式P＝ρ_n/ρ_w得25℃时N₂S₂-Memantine的正辛醇-水油水分配系数P为50.51，即lgP＝1.70；

或以正辛醇-磷酸盐缓冲液体系代替正辛醇-水作为N₂S₂-Memantine的溶液配制液进行油水分配系数的测定。

一种脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，步骤为：

(1)^99mTc标记

精密称取N₂S₂-Memantine适量用70％乙醇配成N₂S₂-Memantine质量浓度为5mg/mL的溶液，精密量取20μL，依次加入20μL1mg/mL用0.1mol/L HCl新鲜配制的SnF₂，50μL100mg/mL葡庚糖酸钠，50μL10mg/mL EDTA和800μLpH＝6.0的PBS，混匀，加入放射性强度约为1mCi ^99mTc淋洗液，沸水煮30min；

(2)量取上述溶液0.1mL，加入3mL正辛醇和3mL 0.1mol/L pH＝7.4的PBS，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取有机相、水相各1mL，分别测γ计数；

(3)取步骤(2)的有机相1mL，加入2mL正辛醇和3mL 0.1mol/L pH＝7.4的PBS，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取油相、水相各1mL，分别测γ计数为γ油、γ水；每次取油相进行倍比稀释，至少进行5次，每次对倍比稀释后的油相、水相进行测γ计数γ油、γ水，测定分配系数P＝γ油/γ水，至样品在两相中的分配比趋于稳定，lgP趋于1.9。

本发明的有益效果：本发明采用HPLC法测定N₂S₂-Memantine的油水分配系数和^99mTc标记测定^99mTc-Memantine的油水分配系数。结果25℃时，N₂S₂-Memantine的油水分配系数lgP为1.70，^99mTc-Memantine的油水分配系数为lgP为1.9，结论N₂S₂-Memantine和^99mTc-Memantine呈脂溶性。

附图说明

图1^99mTc-Memantine的结构式。

图2N₂S₂-Memantine色谱图。

图3乙腈-水体系的油相色谱图。

图4乙腈-水体系的水相色谱图。

具体实施方式

材料

600型高效液相色谱仪及色谱工作站(美国Waters公司)，pH300型pH计(上海天达仪器有限公司)，AC-2105型分析天平(德国sartorius)，80-2型离心机(上海手术机械厂)，1470型自动γ-计数仪(美国PerkinElmer)，N₂S₂-Memantine(卫生部核医学重点实验室合成，纯度大于95％)，甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯)，正辛醇、磷酸二氢钠(分析纯)，水为二次蒸馏水。

色谱条件：

色谱柱：Lichospher C18(4.6×250mm)，流动相为乙腈、水和三氟乙酸，其中：乙腈∶水体积比为2∶1，三氟乙酸为流动相总体积的2％；紫外检测波长：230nm，流速：1.00mL/min，柱温：25℃。

实施例1N₂S₂-Memantine的油水分配系数测定

(1)溶液配制

精密称取N₂S₂-Memantine 1.0g，置于100mL量瓶中，加入适量甲醇溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为10mg/mL的贮备液。

(2)线性关系

精密量取贮备液适量，置于10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以N₂S₂-Memantine质量浓度ρ(mg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归，得N₂S₂-Memantine的线性回归方程为：A＝4×10⁶ρ+3173.1，r²＝0.9996，结果表明N₂S₂-Memantine在0.1～1.0mg/mL内呈良好线性关系；另取0.1mg/mL的N₂S₂-Memantine溶液配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，得到N₂S₂-Memantine的回归方程为：A＝4×10⁶ρ-1855.7，r²＝0.9989，表明N₂S₂-Memantine在0.005～0.1mg/mL内也呈良好的线性。

(3)精密度实验

取N₂S₂-Memantine质量浓度分别为0.5mg/mL和0.04mg/mL的甲醇溶液按所述色谱条件连续进样6次，计算相对标准偏差(RSD)。结果RSD分别为0.62％和1.08％，均小于2％，表明该方法的精密度良好。

(4)回收率实验

配制0.1、0.5、1.0mg/mL低、中、高3种质量浓度的N₂S₂-Memantine样品溶液，进行色谱测定，每种质量浓度测定5次，由标准曲线方程计算测定值，测定值(ρ_D)与真实值(ρ_T)的比值为回收率。结果见表1。

表1回收率的测定

(5)油水分配系数的测定

精密称取N₂S₂-Memantine适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度约为1.0mg/mL的溶液，取该溶液2mL于10mL具塞管中，加入2mL正辛醇饱和的水、25℃摇床振摇72h，离心，取油相和水相20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。代入标准曲线计算N₂S₂-Memantine的浓度分别为ρ_n和ρ_w，由公式P＝ρ_n/ρ_w得25℃时N₂S₂-Memantine的正辛醇/水油水分配系数P为50.51(lgP＝1.70)。

N₂S₂-Memantine由于含巯基，不稳定，需充氮气保护。经氮气保护的试样稳定性较好，日间标准偏差仍小于2％。

实施例2流动相的选择

考察不同的流动相对水相和油相分离条件的影响。选用不同比例的甲醇-水体系，主峰的保留时间在6.5min左右，但油相的主成分受杂质峰干扰较严重，无法有效分开；改用乙腈-水体系，分离效果得到较大的改观，选择乙腈和水的比例为2∶1时，分离度大于1.5；加入一定比例的三氟乙酸，峰形较好并有合适的保留时间，油相和水相的色谱图见图3、图4。

实施例3pH对分配系数的影响

将实施例1中步骤(5)方法中所用的水改成0.1mol/L pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0和9.0的磷酸盐缓冲液，同法测定在不同的pH缓冲液中N2S2-Memantine的分配系数，见表2。结果正辛醇-磷酸盐缓冲液体系分配系数受缓冲液的pH值影响不大。

表2分配系数测定

实施例4^99mTc标记的^99mTc-Memantine测定油水分配系数

精密称取N₂S₂-Memantine适量用70％乙醇配成质量浓度为5mg/mL的溶液，精密量取20μL，依次加入20μL 1mg/mL的SnF₂(用0.1mol/L HCl配制)、50μL100mg/mL GH(葡庚糖酸钠)，50μL10mg/mL EDTA和800μL PBS(pH＝6.0)，混匀，加入放射性强度约为1mCi ^99mTc淋洗液，沸水煮30min。

量取上述溶液0.1mL，加入3mL正辛醇和3mL 0.1mol/L PBS(pH＝7.4)，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取有机相、水相各1mL测γ计数。

取上述有机相1mL，分别加入2mL正辛醇和3mL 0.1mol/L PBS(pH＝7.4)，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取油相、水相各1mL测γ计数为γ油、γ水。开始时，样品中含有未反应的过量游离^99mTc，加入两相后，游离^99mTc几乎全溶于水中，使第一次水相的测量值过高，而标记后的样品主要溶于有机相中，因此，对有机相多次进行倍比稀释，就可以逐步消除游离^99mTc影响，从而得到比较准确的油水分配系数。每次取油相进行倍比稀释，至少进行5次，每次对倍比稀释后的油相、水相进行测γ计数γ油、γ水，测分配系数P＝γ油/γ水，至样品在两相中的分配比趋于稳定，lgP趋于1.9。

表3^99mTc-Memantine的分配系数测定

N₂S₂-Memantine和^99mTc-Memantine的分配系数相近，均呈脂溶性，容易进脑。