法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-09-15
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20101020 终止日期:20160730 申请日:20080730
专利权的终止
2014-04-16
专利权的转移 IPC(主分类):C12Q1/68 变更前: 变更后: 登记生效日:20140321 申请日:20080730
专利申请权、专利权的转移
2010-10-20
授权
授权
2009-02-25
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-12-31
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的特异性引物。
背景技术
美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)是一种丛枝菌根(arbuscularmycohizal,AM)真菌,因为菌根包括内生、外生、内外生菌根等,外生真菌是可培养的,而AM真菌为内生菌根真菌的一种,它才是不可培养的。如果缺乏必需的植物根系共生则无法完成生活史,不能继续繁殖、存活,即不能纯培养。AM真菌不能纯培养,虽然可以利用湿筛倾析法从植物根际土壤中获得AM真菌单个孢子,然后对单个AM真菌孢子进行DNA提取,使用真核生物通用引物即可将其扩增出来、测序等技术就可以知道其序列,但是如果在多种菌共同存在的混合DNA样品中,尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中直接扩增出具有美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)遗传特性的25SrDNA D1/D2可变区域部分序列,给AM真菌侵染根系的检测带来了困难。
发明内容
本发明是为了解决现有的引物无法从混合DNA样品中直接扩增出具有美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)遗传特性的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列的问题,而提供一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物。
本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′。
将本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物命名为S.cal。
本发明的引物是根据不同的AM真菌DNA的D1区序列大小基本相同,而D2区有一个大约50bp的插入序列,不同的AM真菌该插入序列碱基差异大的特点而设计的。将本发明的引物S.cal(作为反向引物)与通用引物对中的LR1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3′)配对使用,即可从混合DNA样品中直接扩增出长度为718bp的美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)目的片段。
附图说明
图1为用具体实施方式二的引物对不同的DNA样品扩增出的序列的凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物为5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′。
具体实施方式二:本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物5′-TTAAAGCCATTACGTCAGCG-3′作为反向引物。
将正向引物LR1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3′)与本实施方式的反向引物配对使用。分别以含有Scutellospora calospora DNA的混合样品、Scutellospora calospora DNA样品和不含Scutellospora calospora DNA的混合样品为模板进行引物S.cal的特异性验证试验。PCR扩增体系及反应条件如下:
扩增反应体系为20μL由2.0μL DNA模板,1.6μL 浓度为2.5mmol/L的dNTP,2.0μL 10×缓冲液(不含Mg2+),2.0μL浓度为25mmol/L的MgCl2,2.0μL浓度为10pmol/L的引物,0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶(DNA聚合酶)和余量的重蒸馏水组成;扩增反应条件:预变性95℃3min,变性93℃1min,退火58℃1min,延伸72℃1min,共30个循环,延伸72℃5min。
将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图1所示,图1中M泳道为标准条带,1号和2号泳道中的条带为含有Scutellosporacalospora DNA的混合样品扩增结果,3号和4号泳道中的条带为Scutellosporacalospora DNA样品扩增结果,5号和6号泳道中的条带为不含Scutellosporacalospora DNA的混合样品扩增结果。从图1中可以看出本实施方式用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物能够准确扩增出美丽盾巨孢囊霉(Scutellospora calospora)的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列片段。将1、2、3、4号泳道对应的序列片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞测序,测序结果为:序列长度为718bp,并且经blast分析,为美丽盾巨孢囊霉(Scu.calospora)特异性序列。
<110>黑龙江大学
<120>一种用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>本发明用于扩增美丽盾巨孢囊霉的种特异性引物。
<400>1
ttaaagccat tacgtcagcg 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与本发明的引物配对使用的LR1引物。
<400>1
gcatatcaat aagcggagga 20
机译: 用于扩增方法的引物和至少一种特异性的核苷酸序列
机译: DNA扩增引物和物种特异性,性别特异性和通用探针,用于检测和鉴定。快速细菌病原体与真菌和基因共同抵抗。抗生素相关的临床标本,可在微生物实验室进行诊断。
机译: 物种特异性,属特异性和通用性的dna探针和扩增引物,用于快速检测和鉴定临床样品中的病原细菌和真菌以及相关的抗生抗药性,以便在微生物实验室中进行诊断。