一种栉孔扇贝基因的染色体定位方法

摘要

本发明涉及一种高效栉孔扇贝基因的染色体定位方法。首先利用气干法在载玻片上进行栉孔扇贝染色体制片；然后根据待定位基因序列，进行在线引物设计并合成引物；再对rRNA基因进行染色体定位：先利用连接酶处理载有染色体的载玻片，再对染色体进行甲酰胺变性处理，加入LAMP反应混合物，进行原位LAMP反应，反应结束后清洗载玻片，加入荧光标记的生物素抗体孵育，最后用碘化丙锭抗衰减溶液对染色体进行复染，利用稳定清晰的杂交信号确定目标基因在染色体上的位置。本发明方法使栉孔扇贝基因在恒温条件下能快速得到大量扩增产物，杂交信号清晰稳定，提高基因定位的准确性和特异性。对于定位单或低拷贝的基因，该方法也具有极大的应用潜力。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种染色体基因定位方法——高效栉孔扇贝基因的染色体定位方法，属于分子细胞遗传学技术领域。

背景技术：

荧光原位杂交(FISH)技术、引物原位延伸(PRINS)技术和原位PCR技术是常用的染色体基因定位的技术。目前，FISH和PRINS技术的应用主要限制在定位高度重复的基因。与FISH和PRINS技术相比，原位PCR技术在定位单或低拷贝的基因方面有着明显的优势。但是，该技术在实践应用中并未得到推广，主要是由于当温度和压力发生变化时，很难恒定地维持染色体所在的玻片表面的反应条件，造成基因的定位效果不稳定。环介导的恒温扩增(LAMP)技术是Notomi等人(2000)发明的一项恒温DNA扩增技术。该技术依赖于可自循环的DNA链替代式合成反应，在较短的时间内，等温的条件下，不到1小时就能扩增出10⁹靶序列拷贝，具有特异性强、灵敏度高、快速准确和操作简单等优点。该反应需要一种具有高的链替代活性的DNA聚合酶及特殊设计的两个内侧引物和两个外侧引物。本发明用LAMP技术替代传统的原位PCR技术中的PCR技术，与传统的原位PCR技术相比，原位LAMP技术具有如下优点：(i)原位LAMP反应过程中，低的和恒定的温度有利于维持恒定的反应条件和降低染色体的损伤；(ii)应用4条引物可提高反应的特异性；(iii)LAMP产物易于沉积的特性可有效避免产物的漂移。应用该技术进行基因的染色体定位，重复性好，特异性高，染色体上基因的杂交信号明显，易于分辨，上述优点使之在定位单或低拷贝的基因方面也有很好的应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种高效栉孔扇贝基因的染色体定位方法，解决当温度和压力发生变化时，很难恒定地维持染色体所在的玻片表面的反应条件，造成基因的定位效果不稳定的问题。

本发明方法的操作步骤如下：

第一步，利用气干法在载玻片上进行栉孔扇贝染色体制片

首先将栉孔扇贝的担轮幼虫经0.01％的秋水仙素常温浸泡后，再用0.075M的氯化钾溶液浸泡30分钟，然后用新鲜配制的卡诺固定液(乙醇∶冰醋酸＝3∶1)固定3次，每次15分钟。经过50％的醋酸溶液浸泡后，固定的幼虫被解离成细胞悬液，然后滴到60℃湿热的载玻片上，60℃风干。

第二步，根据待定位基因序列，进行在线引物设计并合成引物

根据GenBank数据库内栉孔扇贝ITS2序列(AY776156)用PrimerExplorer软件设计4条引物(BIP，FIP，B3和F3)。这四条引物的序列分别为：

5’-CCGGCGAGCGGTCTTAAA-CTGGTTTGTTTTTGGTTCGATTGGA-3’(BIP)，

5’-TTTGCCGACCCTCAGACA-CATCGATATCTTGAACGCACATTGC-3’(FIP)，

5’-GCGTCTCTTGTAATTTGTTCCGTA-3’(B3)，

5’-TGTGAATTGCAGGACACATTGA-3’(F3)。

第三步，对rRNA基因进行染色体定位

先利用连接酶对载玻片上的染色体进行连接处理，再对载玻片上的染色体进行甲酰胺变性处理，并用-20℃的70％，90％和100％乙醇梯度脱水之后，风干，预热，然后将载玻片置于温度循环仪的加热板上，加入LAMP反应混和物，开始在载玻片上进行原位LAMP反应，反应结束后清洗载玻片，置于blocking缓冲液中孵育，再加入荧光标记的生物素抗体孵育，使生物素与抗体结合，最后用碘化丙锭(PI)抗衰减溶液对玻片上的染色体进行复染，用荧光显微镜对染色体进行观察和拍照，利用稳定清晰的杂交信号确定目标基因在染色体上的位置。

LAMP反应混合物总体积为20微升，由8μM的FIP和BIP，2μM的F3和B3，200μM的脱氧腺苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧鸟苷三磷酸，20μM的脱氧胸苷三磷酸，20μM的生物素标记的脱氧尿苷三磷酸，1M的betaine(Sigma公司)，1×ThermerPol缓冲液，8个单位的Bst DNA聚合酶混合形成lamp反应体系混合物。

LAMP反应程序由两步完成：65℃下30分钟的扩增步骤及其后的80℃下10分钟的终止步骤。

本发明方法充分利用LAMP技术的优点，使之与原位PCR技术相结合，用LAMP技术替代传统的原位PCR技术中的PCR技术，使栉孔扇贝基因在恒温条件下能快速得到大量扩增产物，杂交信号清晰稳定，提高基因定位的准确性和特异性。

具体实施方式：

下面以栉孔扇贝核糖体rRNA基因的染色体定位为例通过具体的实施例详细叙述本发明方法：

(1)利用气干法在载玻片上进行栉孔扇贝染色体制片

首先将栉孔扇贝的担轮幼虫经0.01％的秋水仙素常温浸泡2个小时后，再用0.075M的氯化钾溶液浸泡30分钟，然后用新鲜配制的卡诺固定液(乙醇∶冰醋酸体积比＝3∶1)固定3次，每次15分钟。经过50％的醋酸溶液浸泡后，固定的幼虫被解离成细胞悬液，然后滴到60℃湿热的载玻片上，60℃风干。

(2)根据待定位的rRNA(18S-5.8S-28S)基因序列，进行在线引物设计并合成引物

根据GenBank内栉孔扇贝ITS2序列(AY776156)用PrimerExplorer软件(http://primerexplorer.jp/e/)设计4条引物(BIP，FIP，B3和F3)。这四条引物的序列分别为：

5’-CCGGCGAGCGGTCTTAAA-CTGGTTTGTTTTTGGTTCGATTGGA-3’(BIP)

5’-TTTGCCGACCCTCAGACA-CATCGATATCTTGAACGCACATTGC-3’(FIP)

5’-GCGTCTCTTGTAATTTGTTCCGTA-3’(B3)

5’-TGTGAATTGCAGGACACATTGA-3’(F3)

(3)对rRNA基因进行染色体定位

在进行LAMP反应前，玻片先用5个单位的T4连接酶(MBI公司)在50微升的缓冲液内常温处理1.5个小时。然后，玻片上的染色体用70％的甲酰胺和2×标准柠檬酸盐溶液的混合液70度变性2分钟，接着用冷的(-20℃)乙醇梯度(70％，90％和100％)脱水，每次5分钟。在风干后，玻片被置于65度预热2分钟，然后加入LAMP反应混和物。LAMP反应体系混合物总体积为20微升，包括8μM的FIP和BIP，2μM的F3和B3，200μM的脱氧腺苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧鸟苷三磷酸，20μM的脱氧胸苷三磷酸，20μM的生物素标记的脱氧尿苷三磷酸，1M的betaine(Sigma公司)，1×ThermerPol缓冲液，8个单位的Bst DNA聚合酶，形成LAMP反应体系混合物。

每张载玻片被置于温度循环仪(Biometra公司)的加热板上，然后将上述LAMP反应体系混合物添加到载玻片上面。再在载玻片上覆以盖玻片，周边用指甲油进行密封，以防蒸发。LAMP反应程序由两步完成：65℃下30分钟的扩增步骤及其后的80℃下10分钟的终止步骤。反应终止后，玻片用wash缓冲液(4×标准柠檬酸盐溶液，0.1％吐温20，pH7.0)常温冲洗5分钟。然后玻片置于blocking缓冲液(3％牛血清白蛋白，4×标准柠檬酸盐溶液，0.1％吐温20，pH7.0)中37℃孵育20分钟，接着加入生物素抗体孵育1个小时，使生物素和抗体充分结合。玻片上的染色体用含1.5μg/mL的碘化丙锭(PI)抗衰减溶液对细胞核和染色体进行染色。

玻片用配有CCD相机的尼康Eclipse-6000型荧光显微镜观察基因在染色体上的位置。信号用合适的滤光片和LUCIA软件进行收集。稳定清晰的杂交信号可用于确定目标基因在染色体上的位置。

根据王永平和郭希明(2004)的报道，栉孔扇贝核糖体rRNA基因位于5号染色体短臂的端部区域。本发明方法应用原位LAMP技术对栉孔扇贝核糖体rRNA基因的染色体定位，阳性信号用箭头标示，标尺示5微米，得到的这一结果与王永平和郭希明(2004)报道的结果完全一致。该结果验证了应用该技术进行基因的染色体定位结果的可行性和可靠性。