栉孔扇贝和海湾扇贝G型溶菌酶基因及栉孔扇贝硒结合蛋白基因的克隆和表达研究

摘要

海湾扇贝和栉孔扇贝作为我国优良的海水养殖品种近年来得到了很大的推广，构成了海洋贝类养殖业的主体。尽管我国的扇贝养殖规模在过去的几十年中达到一定水平，养殖总产量也居国际领先地位，但贝类的分子免疫学及其相关的病害防治研究相对国外却相对薄弱，近年来我国养殖扇贝的病害问题一直困扰着该产业的健康和可持续发展。尽管针对扇贝养殖环境、病原以及养殖技术等方面开展了大量的研究工作，提出了许多防病治病措施，也取得了一定的成效。但由于引起养殖扇贝病害的病原和发病原因的多样性，大量使用抗菌素和农药后造成病原微生物抗药性的提高以及对环境造成的严重破坏，所以贝类养殖业要摆脱病害的困扰，必须开辟新的疾病防治途径。本研究从2个方面开展扇贝分子免疫学的工作，一是筛选和克隆了参与调控免疫防御的功能基因，根据抗病功能基因的结构以及这些基因在个体或群体感染后或环境胁迫条件下的表达情况，深入研究扇贝的防御抗病机制，探讨提高机体抗病力的方法和途径，并作为抗病良种选育的分子标记，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育。二是筛选研制新型的具有抗微生物活性的多肽或蛋白基因，并对这些基因实现体外大量表达，在扇贝养殖业上作为新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗菌素和化学药物。 1.栉孔扇贝硒结合蛋白cDNA的克隆与免疫相关性研究含硒的生物大分子在免疫系统中发挥着重要的作用。本研究采取大规模的EST(ExpressedSequenceTag)测序方法，结合锚定PCR技术克隆得到了1个栉孔扇贝硒结合蛋白的全长cDNA序列。栉孔扇贝硒结合蛋白zSeBP全长1664bp，包括一个33bp的5'末端非编码(untranslatedregion，UTR)和一个188bp的3'UTR，其开放式读码框(openreadingframe，ORF)长1443bp，可编码480个氨基酸组成的zSeBP前体蛋白，预测分子量为54kDa，等电点为6.5。同源性分析表明克隆的zSeBPcDNA序列与哺乳动物、鱼类、鸟类、昆虫甚至微生物和植物的硒结合蛋白基因都具有很高的相似性。这表明从栉孔扇贝中克隆得到的cDNA序列是硒结合蛋白家族的成员比且硒结合蛋白在生物体内具有重要的不可替代的作用。为了验证zSeBP的免疫相关性，我们用比较免疫学的方法分别用双氧水和三种不同类型的微生物来刺激栉孔扇贝并用半定量RT-PCR检测zSeBP刺激后不同时间段在血淋巴中mRNA的表达水平，同时我们取相应的全组织匀浆液检测丙二醛(MDA)的指标。结果表明，双氧水或微生物刺激后zSeBP在血淋巴的mRNA表达水平可显著加强并且它们的表达趋势相近，这说明它们的应激机理相似，都是由于在刺激过程中氧代谢的失衡引发zSeBP的表达；同时MDA的指标升高也说明在微生物刺激后扇贝体内的氧代谢平衡被打破，比较不同微生物刺激后的zSeBP的表达水平和MDA的指标，我们发现它们存在负相关性，说明zSeBP在扇贝防御微生物感染和维持体内正常氧代谢的过程中发挥着重要的作用。 2.栉孔扇贝和海湾扇贝G型溶菌酶基因cDNA的克隆与分析溶菌酶是自然界中广泛存在的具有抗菌效应的分子，它在无脊椎动物的免疫反应中发挥着重要的作用。通过EST和锚定PCR技术，从海湾和栉孔扇贝中克隆得到一种溶菌酶基因的全长cDNA。海湾扇贝溶菌酶基因的cDNA全长659bp，栉孔扇贝溶菌酶基因的cDNA全长829bp，均编码200个氨基酸。BLASTx分析的结果显示它们和脊椎动物g-型溶菌酶相似性较高，却不同于无脊椎动物中己发现的c型和i型溶菌酶。在其编码的氨基酸序列中发现了g型溶菌酶的活性中心(Glu82，Asp97，Asp108)，同时6个保守的半胱氨酸也与鸟类和鱼类的g型溶菌酶相一致。结合BLAST分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是一种在无脊椎动物中首次发现的G型溶菌酶的编码序列。采用Clustalw软件，对多种脊椎动物c-型、g-型溶菌酶和无脊椎动物c-型、i-型溶菌酶以及本研究发现的无脊椎动物g型溶菌酶进行分析，结果发现无脊椎动物c-型、i-型溶菌酶和脊椎动物c-型溶菌酶同源性较高，而海湾扇贝g型溶菌酶和脊椎动物g-型溶菌酶同源性较高。由此说明c-型、g-型溶菌酶从无脊椎到脊椎动物的进化是平行发生的，这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1我国贝类养殖现状和面临的问题

1.2节贝类的非特异性免疫防御体系

1.2.1贝类细胞免疫的成分与免疫机制

1.2.2贝类体液免疫的成分与免疫机制

1.3贝类免疫系统中的氧化还原代谢平衡

1.3.1贝类的抗氧化体系

1.3.2硒：抗氧化和免疫体系中重要的一分子

1.4基因克隆和表达研究的主要方法

1.4.1表达序列标签

1.4.2差异显示反转录

1.4.3随机引物法克隆未知序列基因

1.4.4代表性差异分析(Representative difference analysis PCR)

1.4.5用特异抗体克隆基因

1.4.6基因表达系列分析

1.4.7基因芯片

1.4.8 mRNA表达的定量检测技术

1.5扇贝基因组及功能基因的研究现状

1.6本论文研究目的

第二章材料与方法

2.1样本的采集与处理

2.1.1健康扇贝在实验室环境中的暂养

2.1.2氧应激实验

2.1.3微生物应激实验

2.2RNA的提取

2.2.1主要化学试剂与仪器

2.2.2扇贝血淋巴RNA的提取

2.3cDNA第一链的合成

2.3.1主要化学试剂与仪器

2.3.2合成扇贝cDNA一链的步骤

2.4获得全长cDNA序列

2.5感受态细胞的制备及转化

2.5.1感受态细胞的制备

2.5.2转化

2.6目的基因的生物信息学分析

2.7基因在体内表达的研究

2.8丙二醛(MDA)的测定

2.9栉孔扇贝硒结合蛋白免疫相关性研究实验设计思路

2.9.1硒结合蛋白是否和栉孔扇贝的免疫机制相关?

2.9.2什么机制使硒结合蛋白参与栉孔扇贝的免疫应答?

第三章结果与讨论

3.1栉孔扇贝硒结合蛋白基因(zSeBP)的克隆与免疫相关性研究

3.1.1 zSeBP的克隆与序列分析

3.1.2 zSeBPcDNA序列与其它物种硒结合蛋白序列的比对

3.1.3栉孔扇贝不同微生物应激后的MDA分析

3.1.4栉孔扇贝不同微生物和氧应激后血淋巴中硒结合蛋白mRNA的表达与分析

3.1.5讨论

3.2栉孔扇贝和海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆与分析

3.2.1栉孔扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆

3.2.2栉孔扇贝g型溶菌酶基因cDNA的序列分析

3.2.3海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆

3.2.4海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的序列分析

3.2.5栉孔扇贝和海湾扇贝g型溶菌酶基因的分子进化研究

3.2.6讨论

第四章结论

参考文献

已发表或已接收文章

已在GenBank数据库中注册的序列

已申请的国家发明专利

致谢