一种具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇人工抗原的合成方法

摘要

一种具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以新霉素、卡那霉素和庆大霉素为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对氨基糖苷类药物研究的需要。

说明书

技术领域

一种具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

氨基糖苷类药物是一类由氨基糖分子和非糖部分的糖元结合而成的抗生素，是一种广谱抗菌药物。临床上氨基糖苷类抗生素主要用来治疗大肠杆菌引起的肠道感染、细菌性痢疾、皮肤粘膜感染以及眼部感染等，但具有严重的耳毒性和肾毒性。该类药物在环境中的降解比较困难且可以通过食物链传递给人，动物日粮中长期大量使用氨基糖苷类药物会对环境造成严重的污染。为了确保动物性食品安全，应严格监督和管理饲料中该类药物的添加。然而该类药物检测技术还比较落后，成为限制政府部门对该类药物监管的主要因素.现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对氨基糖苷类抗生素进行快速、准确、多残留的检测。目前国内外尚未有理想的针对氨基糖苷类药物多残留免疫检测方法的报道。为了弥补这一空白，设计了以新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素(gentamycin)为半抗原合成具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇人工抗原的合成方法。所制备的产品用于氨基糖苷类抗生素的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案：一种具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇人工抗原的合成方法，以新霉素、卡那霉素和庆大霉素为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比；步骤为：

(1)偶联物(NM)_L-BSA的制备

20-50mg新霉素NM、40mg牛血清蛋白BSA溶于3mL 0.01mol/L的PBS缓冲液，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺EDC的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得偶联物(NM)_L-BSA混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将偶联物(NM)_L-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，用聚乙二醇20000浓缩至3mL备用；

(2)偶联物(NM)_L-(KM)_m-BSA的制备

将20-50mg卡那霉素KM加入到(NM)_L-BSA的PBS溶液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得偶联物(NM)_L-(KM)m-BSA混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将偶联物(NM)_L-(KM)_m-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，用聚乙二醇20000浓缩至3mL备用；

(3)人工抗原(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA的制备

将20-50mg庆大霉素GM加入到(NM)_L-(KM)_m-BSA的PBS溶液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得人工抗原(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA的混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA的混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA；

(4)具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原的鉴定

人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。

所用现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液为75-100μL碳二亚胺溶于75-50μL甲醇。具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原的鉴定

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白的分子量增加来确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。

本发明的有益效果：本发明成功合成了具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对氨基糖苷类药物研究的需要。

附图说明

图1低分子量标准蛋白Mark、牛血清蛋白BSA及偶联物(NM)_L-BSA、(NM)_L-(KM)_m-BSA、(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA的电泳图。

A：低分子量标准蛋白Mark，B：BSA，C：(NM)_8.1-BSA，D：(NM)_8.1-(KM)_6.9-BSA，E：(NM)_8.1-(KM)_6.9-(GM)_9.8-BSA。

图2电泳标准曲线图(lgMW-Rf图)。

具体实施方式

实施例1

(1)偶联物(NM)_L-BSA的制备

新霉素(NM)25mg、牛血清蛋白BSA40mg溶于3mL 0.01mol/L的PBS缓冲液，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液(75μL EDC溶于75μL甲醇)，室温轻柔搅拌3小时。即得偶联物(NM)_L-BSA混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

将反应液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，透析袋放在聚乙二醇20000中，将反应液浓缩至3mL备用。

(2)偶联物(NM)_L-(KM)m-BSA的制备

将卡那霉素(KM)35mg加入到(NM)_L-BSA的PBS浓缩液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液(75μL EDC溶于75μL甲醇)，室温轻柔搅拌3小时。即得偶联物(NM)_L-(KM)m-BSA混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

将反应液放入透析袋中，于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，用聚乙二醇20000浓缩至3mL备用。

(3)人工抗原(NM)_L-(KM)m-(GM)n-BSA的制备

将庆大霉素(GM)45mg加入到(NM)_L-(KM)m-BSA的浓缩液中，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺的甲醇溶液(100μL EDC溶于50μL甲醇)，室温轻柔搅拌3小时。即得人工抗原(NM)_L-(KM)m-(GM)n-BSA的混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

将反应液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA。

(4)具有氨基糖苷类药物多抗原决定簇的人工抗原的鉴定

偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量来鉴定合成的人工抗原。SDS-聚丙烯酰胺电泳利用迁移率只与分子量有关，而与所带电荷、分子形状无关，可以利用SDS-聚丙烯酰胺电泳来确定人工抗原的分子量从而确定偶联比。本实验采用10％的分离胶，5％的压缩胶，对低分子量标准蛋白Mark、牛血清蛋白BSA、偶联物(NM)_L-BSA、(NM)_L-(KM)_m-BSA、(NM)_L-(KM)_m-(GM)_n-BSA进行电泳鉴定。利用FR980生物电泳凝胶成像系统软件得出偶联比(NM∶KM∶GM∶BSA)分别为8.1∶6.9∶9.8∶1。即人工抗原的形式为(NM)_8.1-(KM)_6.9-(GM)_9.8-BSA，完全符合免疫要求。

偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL^-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为10.5968mg·mL^-1。