重组家蚕抗菌肽CM4的生产和纯化方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及家蚕抗菌肽CM4多拷贝表达载体的构建、表达、纯化以及最佳拷贝菌株的筛选等技术。本发明的技术方案是：应用重组DNA技术构建抗菌肽CM4的多拷贝同向串联表达载体pET32a－nCM4(n＝1，2，3...8)，再利用镍柱亲和层析技术纯化多拷贝抗菌肽CM4融合蛋白；利用羟胺切割TrxA－n CM4融合蛋白，获得抗菌肽CM4单体。本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了重组抗菌肽CM4，表达效率高，分离纯化简单，易放大，成本低。这为抗菌肽的大量生产、研究及应用奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及家蚕抗菌肽CM4多拷贝表达载体的构建、表达、纯化以及最佳拷贝菌株的筛选等技术。

技术背景

抗菌肽是所有生物天然免疫系统中重要组成部分，它们组成了高等动物防御外来生物的第一道的防线，迄今已有1000多种具有抗菌活性的多肽被分离鉴定。抗菌肽的抗菌谱广，不但对常见致病细菌和原虫有杀伤作用，而且能抑制甲型流感病毒、水泡性口膜炎病毒和人免疫缺陷症病毒的复制。抗菌肽通过对细菌细胞膜的影响发挥作用，细菌不容易产生耐药性而有望成为新一代的肽类抗生素。

抗菌肽CM4是张双全等从中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号×苏12号)中分离得到的。它是线性的、具有α螺旋两亲的阳离子肽，由35个氨基酸组成，分子量约为3.8KD，有很强的杀菌能力，对细菌，真菌等都有作用。不含甲硫氨酸。从蚕蛹中提取的抗菌肽CM4具有较广泛的抗菌和杀伤某些肿瘤细胞的能力，并且不破坏正常细胞。

由于抗菌肽潜在的重要临床价值，人们对其产生了极大的兴趣。但提取工艺繁琐和成本太高使的获得大量天然产物面临巨大难，因此人们对基因工程技术产生了极大的兴趣。但是到目前为止，国内外众多实验室已进行了各种尝试。如Andersons和Hellers在昆虫杆状病毒中表达抗菌肽A；Reichart在酵母体系中表达防御素。虽然均有不同特点，但总的说来，所表达抗菌肽的量还不能达到实际医药研发的层次.为此，很多研究者开始采用串联表达的方式来提高产量。人们仿效“操纵子”模型，将目的基因一个一个串联起来，形成多个阅读框(ORF)，或者仅串联目标基因编码序列，形成一个ORF，置于表达载体启动子的控制之下，使目的基因在宿主菌中以串联体方式表达。这样，一方面利用串联体的空间结构有效屏蔽了单体产物的毒性作用，另一方面也可有效地提高目标蛋白的表达效率。一般的，基因串联体有以下几种构建策略：(1)随机定向串联法；(2)PCR扩增串联法；(3)化学拼接法；(4)同尾酶法；(5)其他方法(饶贤才，胡福泉.基因串联体的构建策略及其表达模式[J].医学研究生学报，2006，19(6)：557-560.)

抗生素的大量应用，导致耐药菌的产生，为了解决抗生素耐药性的问题，研究新的杀菌药物就很重要。抗菌肽CM4有很强的杀菌力，对细菌，真菌，原虫，肿瘤细胞都有杀伤作用，可作为新药，但天然产量低是个瓶颈。

发明内容

为了解决现有技术的上述不足，满足大规模生产家蚕抗菌肽CM4的需要，本发明提供一种低成本的重组家蚕抗菌肽CM4的生产和纯化方法。本发明采用了同尾酶法(Spe I和Nhe I)，成功构建了抗菌肽CM4的多拷贝串联表达载体，并且也成功的从中筛选了表达量比较高的表达菌株。同单拷贝表达菌株相比，这一菌株大大提高了CM4的表达量，在不考虑羟胺切割效率的情况下，其表达量可以达到72.86mg/L，这是已知的抗菌肽CM4最高表达量。

本发明所采用的技术方案是：一种重组家蚕抗菌肽CM4的生产和纯化方法，包括以下步骤：

(1)抗菌肽CM4多拷贝同向串联表达载体的构建：利用DNA重组技术，将CM4基因插入pET32a(+)载体中，构建抗菌肽CM4单拷贝的克隆表达载体pET32a-CM4；在pET32a-CM4的基础上，利用同尾酶方法(本实验中的同尾酶为Spe I和Nhe I)构建多拷贝的表达载体，即pET32a-nCM4(n＝2，3，4...8)；

(2)多拷贝抗菌肽CM4的表达和纯化

将各拷贝抗菌肽CM4表达载体转入E.coli BL21(DE3)，利用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，离心收集菌体，超声破碎后再离心收集上清，将得到的上清过镍柱后将融合蛋白挂于柱上，然后将其洗脱，得到粗蛋白。

可将得到的粗蛋白再经对PBS透析和反相高效液相层析(RP-HPLC)得到纯化的产物。

在上述的方案中，为了得到单体CM4，在串联体构建时，抗菌肽CM4之间，以及CM4与TrxA之间均引入羟胺切割位点，将得到的TrxA-3CM4融合蛋白冻干粉于2M盐酸羟胺，45℃切割，将切割产物于4℃中的PBS透析脱盐。

实验表明，重组抗菌肽CM4的活性基本类似于天然的抗菌肽CM4活性。

上述所说的多拷贝的表达载体pET32a-nCM4(n＝2，3，4...8)，优选n＝3，即pET32a-3CM4.

本发明的有益效果是：

1.筛选出了表达量最高的多拷贝抗菌肽表达菌株

2.表达效率高：本工艺采用原核表达系统，在未优化表达条件下能够达到72.86mg/L，在优化表达条件后，这一产量可以进一步提高。

3.分离纯化简单，易操作，采用化学切割，生产成本低，可以大规模生产。

附图说明

图1是抗菌肽CM4多拷贝同向串联表达载体的构建示意图

图2是抗菌肽CM4多拷贝同向串联体的双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定

图3是SDS-PAGE鉴定多拷贝表达载体的诱导表达

图4是western blot鉴定多抗菌肽CM4多拷贝同向串联体表达

图5是SDS-PAGE分析各拷贝抗菌肽CM4串联体中目的蛋白表达形式

图6是SDS-PAGE分析及鉴定三拷贝抗菌肽CM4融合蛋白的表达与纯化

图7是反相高效液相色谱分离纯化抗菌肽CM4

图8是Tricine/SDS-PAGE鉴定纯化的抗菌肽CM4

图9是打孔测活鉴定抗菌肽CM4的活性

图10各拷贝抗菌肽CM4串联体表达菌株中上清蛋白中融合蛋白的比例和CM4的相应表达量

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例：

1、抗菌肽CM4多拷贝同向串联表达载体的构建：

1.1根据已知的抗菌肽CM4的序列设计如下引物：

pET32a-F：5′GCGGGATCCAACGGCCGTTGGAAGATCTTTAAG 3′

pET32a-R：5′GAGAAGCTTTCATTAGCCGTTGATAGTGGCAGCCTGG3′

其中pET32a-F和pET32a-R斜体部分编码的氨基酸序列为羟胺切割位点，加下划线部分分别为基因克隆位点BamH I和Hind III。同时，加边框的序列部分分别为同尾酶Spe I和Nhe I的识别序列。

1.2通过rPCR合成CM4基因，以pET32a-F和pET32a-R为引物，扩增CM4基因。割胶回收后，用BamH I和Hind III对其以及pET32a(+)载体(购自Novagen公司)进行双酶切，用连接酶连接后构建单拷贝表达载体pET32a-CM4

1.3以载体pET32a-CM4位于目的基因之外的Kpn I酶切位点和Spe I同时对其进行双酶切，割胶回收大片段(含有一个CM4序列)，同样的再以Kpn I和NheI同时双酶切载体，回收小片段(同样含有一个CM4序列)，然后用连接酶连接大小片段即得到抗菌肽CM4双拷贝表达载体pET32a-2CM4。根据图1反复循环即可构建多拷贝表达载体pET32a-nCM4(n＝1，2，3...8)。双酶切鉴定，见图2。

2.多拷贝抗菌肽CM4的表达及最佳拷贝菌株的筛选：

将构建好的各拷贝抗菌肽CM4表达载体转入E.coli BL21(DE3)，在25℃条件下利用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，5000rpm离心15min收集细胞。

2.1 SDS-PAGE及western blot鉴定

将10μl样品分别加入等量含β-巯基乙醇的2×上样缓冲液，恒压100V进行12％SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色显带分析(图3)。

同样的样品在12％SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜，5％脱脂奶粉封闭后，加入Anti-His Antibody孵育过夜，然后再加HRP偶联的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，TMB显色(具体参照Current protocol in immunology unit 8.10).结果显示各拷贝菌中目的蛋白均表达(图4)。

2.2筛选抗菌肽CM4表达量最高拷贝菌株

鉴定目的蛋白表达之后，对细胞进行超声破碎，一方面分别取上清和沉淀以及全菌跑SDS-PAGE电泳，然后利用Bandscan software Version 5.0扫胶软件对SDS-PAGE凝胶图像进行分析。另一方面，利用Bradford protein assay法对上清中的蛋白浓度进行测定。结合这两方面的数据我们选定抗菌肽CM4表达量最高的BL21(DE3)/pET32-3CM4作为理想的表达菌株。(图5，图10)

3.最佳拷贝菌株表达产物的纯化

1mM IPTG，25℃诱导培养BL21(DE3)/pET32-3CM4，离心(5000rpm，15min)收集菌体，超声破碎后再离心(12000rpm，4℃ 20min)收集上清。由于融合蛋白中带有His.tag，将得到的上清过镍柱后可以将融合蛋白挂于柱上。然后将其洗脱。将收集的蛋白于4℃对PBS透析16h，12％SDS-PAGE检测。蛋白于冻干机中冻干保存以备后续实验。(图6)

4.融合蛋白的切割纯化及生物学活性鉴定

4.1为了得到单体CM4，在串联体构建时抗菌肽CM4之间，以及CM4与TrxA之间均引入了羟胺切割位点。将得到的TrxA-3CM4融合蛋白冻干粉于2M盐酸羟胺，45℃切割4h，然后降低温度和PH值终止反应。最后，将切割产物于4℃中的PBS透析脱盐。

4.2将上述透析产物用反相高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化。所用仪器为：Agilent 1100，分析柱为：Kromasil C18(10×250mm，5μm)，实验所用的流动相为A液(含有15％乙腈和0.1％TFA)和B液(100％乙腈和0.1％TFA)。

以天然的抗菌肽CM4为标准舞，收集对应峰位的样品，将其冻干以备用。(图7)

4.3将RP-HPLC纯化后的蛋白进行Tricine/SDS-PAGE以及打孔测活鉴定(图8，图9)。

4.4为了进一步鉴定重组抗菌肽CM4和天然抗菌肽CM4的活性大小，我们做了以下几种微生物的抗菌肽CM4最小抑菌浓度(MIC)测定：Escherichia coli K₁₂D₃₁，Salmonella spp.，Penicillium chrysogenum，Aspergillus niger。将重组抗菌肽CM4样品用含有0.01％乙酸和0.2％BSA的无菌水进行连续稀释，然后将稀释后的样品置于96孔板中，每一孔接种100μL培养至对数期的菌，于30℃震荡培养24h，然后置于酶标仪下测每孔的OD600。以上实验重复三次，算出相应菌对抗菌肽CM4的MIC。实验表明，重组抗菌肽CM4的活性基本类似于天然的抗菌肽CM4。