具有新代谢特性的胶红酵母及其在生物降解中的应用

摘要

具有新代谢特性的胶红酵母及其在生物降解中的应用属于生物工程技术领域。本发明分离筛选出一株具有新代谢特性的胶红酵母。本发明的优点是胶红酵母通过部分还原途径降解硝基苯，并矿化降解过程中的副产物吡啶甲酸，从而实现硝基苯的彻底降解，解决了硝基苯部分还原降解中的瓶颈；胶红酵母能够在高盐度以及多种有机物质共存的条件下有效降解硝基苯；胶红酵母能够以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源进行生长，吡啶甲酸最终被矿化为无害的二氧化碳和水；胶红酵母能够作为生物强化制剂应用于盐度高、成分复杂的硝基苯废水和吡啶甲酸废水的生物治理中。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株具有新代谢特性的胶红酵母及其在硝基苯好氧生物降解和吡啶甲酸好氧生物降解中的应用。

背景技术

硝基苯广泛用于医药、染料、塑料、炸药等的生产中，硝基苯的广泛应用导致硝基苯污染环境。硝基苯废水可通过好氧生物法进行处理。目前，好氧降解硝基苯的微生物资源有细菌和真菌，真菌主要为白腐菌。

硝基苯在工业中最重要的用途是生产偶氮染料，偶氮染料废水具有盐度高、成分复杂等特点。高盐度是指废水中的总溶解性固体物(氯化钠)至少为3.5％(W/V)；成分复杂是指废水中除含有硝基苯外，主要的有机污染物还有苯胺和苯酚。在高盐度或者多种有机物质共存的条件下，硝基苯降解菌通常不能生长，因此不能实现硝基苯的降解。

目前所报道的硝基苯降解菌在好氧条件下通过两种途径降解硝基苯：氧化途径或部分还原途径，其中部分还原途径更为广泛。在Spain等分离的155株菌中，154株通过部分还原途径降解硝基苯，1株通过氧化途径降解硝基苯。这是由于硝基的吸电子效应导致苯环上电子云密度下降，从而阻碍了氧化酶的亲电进攻；同时，硝基电负性增强、易于被还原。正是由于硝基苯的自身结构导致目前所分离的菌株几乎都是通过部分还原途径降解硝基苯的。然而在硝基苯的部分还原降解中，吡啶甲酸作为副产物生成，吡啶甲酸具有生物毒性，不能被硝基苯降解菌利用，吡啶甲酸的生成阻碍了硝基苯的好氧降解。

吡啶甲酸为一种N杂环化和物，主要用于医药、农药、染料等的生产中，吡啶甲酸的应用导致吡啶甲酸污染环境。目前，好氧降解吡啶甲酸的微生物资源有Arthrobacter和分支杆菌。

发明内容

本发明的目的就是针对实际硝基苯工业废水盐度高、成分复杂等特点以及在硝基苯降解过程中出现不能降解的副产物吡啶甲酸这一问题，通过科学方法驯化、筛选出硝基苯高效降解菌，用以处理盐度高、成分复杂的硝基苯废水，并解决硝基苯降解过程中的瓶颈。同时，也为吡啶甲酸的好氧生物降解提供高效、实用的微生物资源。

本发明的技术解决方案是，本发明提供的胶红酵母于2006年7月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCCNo.1758，分类命名为Rhodotorula mucilaginosa。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080。

所述的胶红酵母，其具体筛选步骤如下：从大连染料厂曝气池中取50ml活性污泥，加入0.2％的焦磷酸钠作为解絮凝剂，在振荡器上振荡5-10min打碎活性污泥絮体后，取5ml活性污泥，加入含95ml无机盐培养基的摇瓶中，再加入硝基苯作为唯一碳、氮、能源，其中硝基苯的浓度为200mg/L，进行摇床培养，温度30℃，转速180r/min；当菌液变得混浊，进行转接，得到以硝基苯为唯一碳、氮、能源的稳定菌液；将稳定菌液稀释，在以硝基苯为唯一碳、氮、能源的固体培养基上进行涂布，将该固体培养基放入光照培养箱中，30℃、培养4-5天，挑单菌落；分离出一株以硝基苯为唯一碳、氮、能源的的胶红酵母。

所述的胶红酵母，其特征在于，该菌株适宜生长pH范围为5.0-9.0，适宜生长温度范围为20-40℃；其形态特征：在麦芽汁液体培养基中，25℃下培养三天后，细胞卵形至椭圆形，大小为(2.8-5.2)×(2.5-6.6)μm，有沉淀形成；在麦芽汁琼脂斜面上，25℃下培养一个月后，菌落奶酪状，粉红色，表面平滑，反光，边缘整齐；玉米粉琼脂，无假菌丝产生。

所述的胶红酵母在硝基苯好氧生物降解中的应用，其特征在于，胶红酵母固定化细胞、细胞液体培养物均通过部分还原途径降解硝基苯，并矿化降解过程中的副产物吡啶甲酸，实现硝基苯的彻底降解，因此能够作为生物强化制剂对硝基苯废水进行处理。

所述的胶红酵母在硝基苯好氧生物降解中的应用，其特征在于，胶红酵母固定化细胞、细胞液体培养物均在NaCl质量浓度0-40mg/L的条件下，有效降解硝基苯，因此能够作为生物强化制剂对高盐度的硝基苯废水进行处理。

所述的胶红酵母在硝基苯好氧生物降解中的应用，其特征在于，胶红酵母固定化细胞、细胞液体培养物均在苯胺和硝基苯共存，苯胺质量浓度0-50mg/L的条件下，有效降解硝基苯，因此能够作为生物强化制剂对成分复杂的硝基苯废水进行处理。

所述的胶红酵母在硝基苯好氧生物降解中的应用，其特征在于，胶红酵母固定化细胞、细胞液体培养物均在苯酚和硝基苯共存，苯酚质量浓度0-150mg/L的条件下，有效降解硝基苯，因此能够作为生物强化制剂对成分复杂的硝基苯废水进行处理。

所述的胶红酵母在吡啶甲酸好氧生物降解中的应用，其特征在于，胶红酵母固定化细胞、细胞液体培养物均破坏吡啶甲酸的N杂环，吡啶甲酸开环矿化，因此能够作为生物强化制剂对吡啶甲酸废水进行处理。

所述的胶红酵母生理生化特征见表1

表1胶红酵母生理生化特征

注：+：阳性；-：阴性

所述的胶红酵母既可在富营养培养基LB中生长，也可在葡萄糖、蔗糖、淀粉等小分子有机物为唯一碳源的无机盐培养基中生长。

所述的胶红酵母，可以用新鲜培养的生长期菌种或是制成的固定化细胞对硝基苯废水以及吡啶甲酸废水进行生物降解。

本发明所达到的有益效果是：本发明提供的胶红酵母通过部分还原途径降解硝基苯，并矿化降解过程中的副产物吡啶甲酸，从而实现硝基苯的彻底降解，解决了硝基苯部分还原降解中的瓶颈；胶红酵母在硝基苯为唯一碳、氮、能源且硝基苯初始浓度≤450mg/L的条件下彻底降解硝基苯；胶红酵母在NaCl质量浓度0-40mg/L，硝基苯为唯一碳、氮、能源且硝基苯初始浓度≤450mg/L的条件下有效降解硝基苯；胶红酵母在硝基苯和苯胺共存，苯胺浓度为0-50mg/L，硝基苯初始浓度≤450mg/L的条件下，有效降解硝基苯；胶红酵母在硝基苯和苯酚共存，苯酚浓度为0-150mg/L，硝基苯初始浓度≤450mg/L的条件下，有效降解硝基苯；胶红酵母在吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度≤3500mg/L的条件下彻底降解吡啶甲酸；本发明提供的胶红酵母可作为生物菌制剂，投加到现有的硝基苯废水以及吡啶甲酸废水处理系统中，增强原处理系统的处理能力；本发明提供的胶红酵母在硝基苯废水以及吡啶甲酸废水的处理中有着广阔的应用潜力。

附图说明

图1是本发明提供的胶红酵母在以硝基苯为唯一碳、氮、能源且硝基苯初始浓度为450mg/L的液体培养中生长与硝基苯降解曲线图，图中左侧纵坐标表示硝基苯的回收率，单位为％，右侧纵坐标表示菌体干重，单位为mg/L；

图中：-■-代表回收率，-□-代表菌体生长量。

图2是本发明提供的胶红酵母在以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源且吡啶甲酸初始浓度为3500mg/L的液体培养中生长与吡啶甲酸降解曲线图，图中左侧纵坐标表示吡啶甲酸的回收率，单位为％，右侧纵坐标表示菌体的生长量，单位为OD660；

图中：-■-代表回收率，-□-代表菌体生长量。

图3是本发明提供的胶红酵母在不同氯化钠质量浓下，硝基苯为唯一碳、氮、能源且硝基苯初始浓度为450mg/L时，硝基苯的降解曲线图，图中纵坐标表示硝基苯的回收率，单位为％；

图中：-■-代表氯化钠质量浓度20mg/L，-□-代表氯化钠质量浓度30mg/L，-○-代表氯化钠质量浓度40mg/L，-●-代表氯化钠质量浓度50mg/L。

图4是本发明提供的胶红酵母在苯胺和硝基苯共存，且硝基苯初始浓度为450mg/L时，硝基苯的降解曲线图，图中纵坐标表示硝基苯的回收率，单位为％；

图中：-■-代表苯胺浓度25mg/L，-□-代表苯胺浓度50mg/L，-○-代表苯胺浓度75mg/L，-●-代表苯胺浓度100mg/L。

图5是本发明提供的胶红酵母在苯酚和硝基苯共存，且硝基苯初始浓度为450mg/L时，硝基苯的降解曲线图，图中纵坐标表示硝基苯的回收率，单位为％；

图中：-■-代表苯酚浓度50mg/L，-□-代表苯酚浓度100mg/L，-○-代表苯酚浓度150mg/L，-●-代表苯酚浓度200mg/L。

图1到5中：横坐标h均表示时间，单位为小时。

具体实施方式

下面结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

实施例1

本发明提供的胶红酵母，其筛选步骤如下：

从大连染料厂的曝气池中采集好氧活性污泥样品，作为菌源进行驯化、培养。将50ml活性污泥，加入0.2％的焦磷酸钠作为解絮凝剂，在振荡器上振荡5-10min打碎活性污泥絮体后，取5ml活性污泥，加入含95ml无机盐培养基的摇瓶中，再加入硝基苯作为唯一碳、氮、能源，其中硝基苯的浓度为200mg/L，进行摇床培养，温度30℃、转速180r/min。无机盐培养基成分：Na₂HPO₄·12H₂O，7g/L；KH₂PO₄，1g/L；CaCl₂·2H₂O，10mg/L；FeCl₃，2mg/L；MgSO₄·7H₂O，20mg/L。当菌液变得混浊，硝基苯检测不到，进行下一次转接；经过不断地驯化培养，最终得到以硝基苯为唯一碳、氮、能源的稳定菌液。将稳定菌液稀释，在以硝基苯为唯一碳、氮、能源的固体培养基上进行涂布。固体培养基成分：Na₂HPO₄·12H₂O，7g/L；KH₂PO₄，1g/L；CaCl₂·2H₂O，10mg/L；FeCl₃，2mg/L；MgSO₄·7H₂O，20mg/L；硝基苯，200mg/L，琼脂2％。将该固体培养基放入光照培养箱中，30℃、培养4-5天，挑单菌落；分离筛选出一株以硝基苯为唯一碳、氮、能源的胶红酵母；该菌株于2006年7月18日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.1758。

该胶红酵母的适宜生长pH范围较宽，在5.0-9.0的pH范围内均有良好的生长，最适pH值为7.0，适合生长温度在30℃；其形态特征：在麦芽汁液体培养基中，25℃下培养三天后，细胞卵形至椭圆形，大小为(2.8-5.2)×(2.5-6.6)μm，有沉淀形成；在麦芽汁琼脂斜面上，25℃下培养一个月后，菌落奶酪状，粉红色，表面平滑，反光，边缘整齐；玉米粉琼脂，无假菌丝产生。

本发明提供的胶红酵母的26S rDNAD1/D2扩增：

通过扩增该菌株的26S rDNA D1/D2，得到了长度为613bp的26S rDNAD1/D2序列。PCR引物采用26S rDNA D1/D2的通用引物NL1(5’-GCA TATCAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3’)。用PCR仪(GeneAmp，PCR System 9700)进行扩增反应。表2和3分别显示了PCR反应体系以及反应条件。

表2PCR反应体系

表3反应条件

取PCR产物1μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒(大连宝生物工程公司TaKaRa)切胶回收PCR产物，将PCR产物克隆到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与Rhodotorula mucilaginosa的同源性高达100％。

制备胶红酵母的细胞液体培养物：

挑取在硝基苯为唯一碳、氮、能源的固体培养基上的胶红酵母单菌落，装有灭菌的以硝基苯为唯一碳、氮、能源的液体培养基中，其中硝基苯的浓度为100mg/l，于30℃、pH 7.0、180r/min，进行好氧培养48-60小时，取培养好的菌液1ml接种在100ml含硝基苯(200mg/l)的无机盐培养基中，30℃、pH 7.0、180r/min、进行好氧培养60小时，得到胶红酵母的细胞液体培养物。

制备胶红酵母的固定化细胞：

[1]采用表面吸附固定化技术；

[2]选用大连兰大生物环境技术有限公司提供的专利产品，DW-22型大孔网状载体作为固定化材料，表4给出了载体的性能；

表4DW-22型大孔网状载体性能

[3]在250ml锥形瓶中加入100ml无机盐培养基，再加入硝基苯作为唯一碳、氮、能源，其中硝基苯的浓度为200mg/l；

[4]将DW-22型载体直接加入上述[3]的锥形瓶中，121℃下灭菌20min；其中，载体投加量为24％(体积比)，载体投加量为加入的载体体积和培养液体积之比；

[5]接种1ml胶红酵母的细胞液体培养物，于30℃、pH 7.0、160r/min、进行好氧培养；

[6]当硝基苯完全降解时，大孔网状载体上附着了大量的胶红酵母细胞，胶红酵母被固定在大孔网状载体上；

[7]用无菌的生理盐水冲洗已附着了胶红酵母细胞的大孔网状载体，共冲洗3遍，将该大孔网状载体浸泡在生理盐水中，4℃储存，备用。

实施例2

本发明中，胶红酵母对硝基苯好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]在250ml锥形瓶中加入100ml无机盐培养基，再加入450mg/L的硝基苯作为唯一碳、氮、能源，121℃下灭菌；

[2]将实施例1制备的胶红酵母细胞液体培养物加入上述[1]的培养基中，30℃、180r/min，好氧培养，图1为胶红酵母的生长与硝基苯降解情况。

实施例3

本发明中，胶红酵母对吡啶甲酸好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]在250ml锥形瓶中加入100ml无机盐培养基，加入3500mg/L的吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源，121℃下灭菌；

[2]将实施例1制备的胶红酵母细胞液体培养物加入上述[1]的培养基中，30℃、180r/min，好氧培养，图2为胶红酵母的生长与吡啶甲酸降解情况。

实施例4

本发明中，胶红酵母在高盐度下对硝基苯好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]分别配制氯化钠质量浓度为2％，3％，4％和5％的无机盐培养基，加入450mg/L的硝基苯作为唯一碳、氮、能源，121℃下灭菌；

[2]将实施例1制备的胶红酵母细胞液体培养物加入上述[1]的培养基中，30℃、180r/min，好氧培养，图3为胶红酵母在不同盐度下的生长与硝基苯降解情况。

实施例5

本发明中，胶红酵母在苯胺和硝基苯共存时，对硝基苯好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]在100ml的无机盐培养基，加入450mg/L的硝基苯，再分别加入不同浓度的苯胺，苯胺浓度在25-100mg/L之间变化，121℃下灭菌；

[2]将实施例1制备的胶红酵母细胞液体培养物加入上述[1]的培养基中，30℃、180r/min，好氧培养165h，图4为胶红酵母在苯胺与硝基苯共存时的生长与硝基苯降解情况。

实施例6

本发明中，胶红酵母在苯酚和硝基苯共存时，对硝基苯好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]在100ml的无机盐培养基，加入450mg/L的硝基苯，再分别加入不同浓度的苯酚，苯酚浓度在50-200mg/L之间变化，121℃下灭菌；

[2]将实施例1制备的胶红酵母细胞液体培养物加入上述[1]的培养基中，30℃、180r/min，好氧培养165h，图5为胶红酵母在苯酚与硝基苯共存时的生长与硝基苯降解情况。

实施例7

本发明中，胶红酵母固定化细胞对硝基苯好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]配置实施例4所述的不同盐度的液体培养基；

[2]配置实施例5所述的含有不同浓度苯胺的液体培养基；

[3]配置实施例6所述的含有不同浓度苯酚的液体培养基；

[4]将实施例1所述的胶红酵母固定化细胞分别投加到上述[1]、[2]、[3]的培养基中，30℃、180r/min，好氧培养；表5列出了胶红酵母固定化细胞在不同盐度下对硝基苯的降解，表6列出了胶红酵母固定化细胞在苯酚或苯胺和硝基苯共存时对硝基苯的降解；在盐度为4％的条件下，胶红酵母固定化细胞250h对硝基苯的降解率为81.18％，而胶红酵母细胞液体培养物在250h对硝基苯的降解率仅为23.76％；在苯酚浓度为150mg/L时，胶红酵母固定化细胞165h对硝基苯的降解率为78.13％，而胶红酵母细胞液体培养物165h对硝基苯的降解率仅为39.89％；在苯胺浓度为75mg/L时，胶红酵母固定化细胞165h对硝基苯的降解率为44.13％，而胶红酵母细胞液体培养物165h对硝基苯的降解率为17.87％；结果表明与细胞液体培养物相比，固定化细胞的耐盐性和耐毒性均有所提高。

表5胶红酵母固定化细胞在不同盐度下对硝基苯的降解

表6胶红酵母固定化细胞在苯酚或苯胺存在时对硝基苯的降解

实施例8

本发明中，胶红酵母固定化细胞对吡啶甲酸好氧降解研究的应用，其步骤如下：

[1]在250ml锥形瓶中加入100ml无机盐培养基，加入3500mg/L的吡啶甲酸作为唯一碳、氮、能源，121℃下灭菌；

[2]将实施例1制备的胶红酵母固定化细胞加入上述[1]的培养基中，30℃、160r/min，好氧培养，固定化细胞完全降解吡啶甲酸的时间为40h。

<110>大连理工大学环境与生命学院

<120>具有新代谢特性的胶红酵母及其在生物降解中的应用

<160>序列总数1

<211>613bp

<212>DNA

<213>胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)

<220>

<221>gene

<120>胶红酵母26S rDNA D1/D2序列

 1  gcatatcaat aagcggagga aaagaaacta acaaggattc ccctagtagc ggcgagcgaa

61  gcgggaagag ctcaaattta taatctggca ccttcggtgt ccgagttgta atctctagaa

121 atgttttccg cgttggaccg cacacaagtc tgttggaata cagcggcata gtggtgagac

181 ccccgtatat ggtgcggacg cccagcgctt tgtgatacat tttcgaagag tcgagttgtt

241 tgggaatgca gctcaaattg ggtggtaaat tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac

301 cgatagcgaa caagtaccgt gagggaaaga tgaaaagcac tttggaaaga gagttaacag

361 tacgtgaaat tgttggaagg gaaacgcttg aagtcagact tgcttgccga gcaatcggtt

421 tgcaggccag catcagtttt ccgggatgga taatggtaga gagaaggtag cagtttcggc

481 tgtgttatag ctctctgctg gatacatctt gggggactga ggaacgcagt gtgcctttgg

541 cgggggtttc gacctcttca cacttaggat gctggtggaa tggctttaaa cgacccgtct

601 tgaaacacgg acc