离子液体中胶红酵母苯丙氨酸解氨酶催化性质研究

摘要

离子液体(Ionic Liquids，IL)，是在室温或室温附近(＜100℃)由有机阳离子和有机或无机阴离子构成并且呈液态的盐类化合物。离子液体具有诸多优点，因此受到极大的关注，被开发和应用到诸多领域，尤其是在生物催化方面被广泛关注，目前已经被应用于木瓜蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等酶催化反应中，但在苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化应用方面尚未见报道。本文通过研究不同离子液体对PAL催化活性的影响，筛选出能显著提高PAL活性的离子液体，并进一步研究了PAL在该离子液体中各种催化性能。
　　1)胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa) PAL的部分纯化通过玻璃珠对胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)进行破壁，提取粗酶液，并在冰浴中利用40％饱和度的硫酸铵进行蛋白沉淀，采用透析法除去硫酸铵，进而通过PEG20000对酶液进行浓缩，并通过Sepharose4B凝胶柱、DEAE-Sepharose FF离子交换柱进行了部分纯化。结果表明:PAL纯化倍数为22.71，酶活回收率为35.5％。对部分纯化后的酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳得到三个条带，表明得到部分纯化的PAL。
　　2)离子液体的筛选研究了不同浓度的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)、1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([PMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)、1-戊基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([PtMIM]BF4)、1-戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([PtMIM]PF6)、1-已基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIM]BF4)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([HMIM]PF6)8种离子对苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phe)生成反式肉桂酸的影响，结果表明，与单一的缓冲液反应体系相比，发现在反应体系中加入55％的疏水性离子液体[HMIM]PF6，酶活性提高了33.5％。
　　3)离子液体[HMIM]PF6对PAL活性和稳定性的影响采用单因素法，研究了PAL在[HMIM]PF6中最适反应条件、稳定性和动力学参数。结果表明，与单一水相相比，苯丙氨酸解氨酶(PAL)在(水/[HMIM]PF6)两相中的最适反应温度和pH发生相对偏移，分别为40℃和7;温度耐受性和pH稳定性有相对改善，但变性剂耐受性无多大改变。在55％[HMIM]PF6反应体系中的Km比单一缓冲液体系要低，而且最大反应速率vmax也要比单一缓冲体系高。表明该离子液体的加入增加了底物和PAL的亲和力，提高了酶的催化效率。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景

1．2 苯丙氨酸解氨酶研究进展

1．2．1 苯丙氨酸解氨酶特性研究

1．2．2 苯丙氨酸解氨酶的分离纯化

1．2．3 植物中苯丙氨酸解氨酶的研究

1．2．4 微生物中苯丙氨酸解氨酶的研究

1．3 酶在不同催化介质中的研究

1．3．1 酶在有机介质中的研究

1．3．2 酶在气相介质中的研究

1．3．3 酶在超临界流介质中的研究

1．3．4 酶在离子液体介质中的研究

1．4 离子液体的研究进展

1．4．1 离子液体的性质研究

1．4．2 离子液体在化学反应中的应用

1．4．3 离子液体在生物催化中的应用

1．5 立题的目的和意义

1．6 研究内容

第2章 胶红酵母苯丙氨酸解氨酶的纯化

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌种

2．2．2 主要实验试剂及耗材

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 酶活测定方法

2．3．2 蛋白质含量测定方法

2．3．3 胶红酵母菌体的培养及分离

2．3．4 苯丙氨酸解氨酶的纯化

2．3．5 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．4 结果分析

2．4．1 硫酸铵分级沉淀曲线

2．4．2 Sepharose 4B凝胶过滤层析

2．4．3 DEAE-Sepharose FF离子交换层析

2．4．4 苯丙氨酸解氨酶纯化步骤及纯化效率

2．4．5 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．5 本章小结

第3章 离子液体的筛选

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 菌体

3．2．2 试剂

3．2．3 仪器

3．3 方法

3．3．1 PAL的纯化

3．3．2 离子液体的筛选

3．3．3 离子液体的最佳浓度的确定

3．4 结果分析

3．4．1 离子液体的筛选

3．4．2 离子液体的最佳浓度的确定

3．5 本章小结

第4章 离子液体中PAL的催化性能

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 菌体

4．2．2 试剂

4．2．3 仪器

4．3 方法

4．3．1 缓冲溶液的配置方法

4．3．2 PAL的纯化

4．3．3 反式肉桂酸标准曲线的绘制

4．3．4 离子液体中PAL最适催化pH的确定

4．3．5 离子液体中PAL最适催化温度的确定

4．3．6 离子液体中PAL温度稳定性的研究

4．3．7 离子液体中PAL酸碱稳定性的研究

4．3．8 离子液体中PAL变性剂稳定性的研究

4．3．9 离子液体中PAL动力学参数的测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 反式肉桂酸标准曲线的绘制

4．4．2 离子液体中PAL最适催化pH的确定

4．4．3 离子液体中PAL最适催化温度的确定

4．4．4 离子液体中PAL温度稳定性的研究

4．4．5 离子液体中PAL酸碱稳定性的研究

4．4．6 离子液体中PAL变性剂稳定性的研究

4．4．7 离子液体中PAL动力学参数的测定

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的论文

致谢

个人简历