翦股颖上两种腥黑粉菌近似种的分子检测方法

摘要

本发明涉及利用PCR引物技术检测禾本科草种翦股颖(Agrostis spp L.)中翦股颖腥黑粉菌[Tilletia sphaerococca(Wallr)Waldh]和小麦网腥黑穗菌(T.caries，简称TCT)的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。本发明设计了5套PCR引物，通用外套引物、通用内套引物、T.sphaerococca的外套引物和特异引物、TCT的特异引物。通用内套引物用于Tilletia属冬孢子的套式扩增，以便对扩增过程进行质量监测，避免假阴性。T.sphaerococca的特异引物和T.caries的特异引物用于菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物和特异引物，用于双重套式PCR检测两种冬孢子。该方法检测快速、可靠，整个检测过程在一个工作日内完成。

说明书

技术领域

本发明涉及使用PCR技术检测寄生于禾本科草种翦股颖(Agrostis spp L.)中翦股颖腥黑粉菌[Tilletia sphaerococca(Wallr)Waldh]和小麦网腥黑穗菌(T.caries，简称TCT)的方法。属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。

背景技术

翦股颖属(Agrostis L.)为禾本科多年生草本，多分布于寒温地带，作为草坪草和牧草的主要有2种(匍匐型和细弱型)，近年来我国的进口量很大。匍匐翦股颖(A.stolonifera Huds)原产于欧亚大陆，具有侵占性很强的匍匐茎，节上土生不定根；质地细腻，形成的草坪致密，耐践踏、耐低修剪，剪后再生力强；耐寒冷潮湿能力强，是最抗寒的冷季型草坪草之一；耐旱、耐盐碱，耐涝；生长低矮、抗病力强、生长繁殖迅速；我国东北、华北、西北及江西、浙江等省区均有分布，广泛用于草坪建植。此外，还可用作地下水位较高、潮湿处的保土植物以及由于再生草品质高、多汁而营养丰富，可作牧草栽培。细弱翦股颖(A.tenuis Sibth)产于欧亚大陆的北温带，质地细，为草皮型多年生草坪草，它通过匍匐茎和根茎扩展，易形成致密的草坪，适应于多种土壤，粘土、砂土以及瘠薄且缺钙质的土壤上均能生长，茎叶柔软，适口性好，也是一种优良的牧草、草坪草和保土植物(王栋原著，任继周等修订.牧草学各论，新一版，江苏科学技术出版社，1989，153-154)。

腥黑粉菌是翦股颖植物上重要的真菌病害。Vanky认为仅有Tilletia sphaerococca(Wallr)Waldh侵染翦股颖(Vanky.1994.European smut fungi.Gustav Fisher Verlag；Stuttgart)，根据Fisher&Duran(Duran R，Fischer G W.1961.The Genus Tilletia.Pullman Washington StateUniversity Press)、Lindeberg(Lindeberg B.1959.Ustilaginales of Sweden.Symb.Bot.Upsal.16：67-75.)的报道，侵染翦股颖的腥黑粉菌有T.pallida Fisch和T.sphaerococca，而T.Matsumoto则认为小麦网腥黑穗菌(T.caries，简称TCT)、翦股颖腥黑粉菌(T.sphaerococca)和T.pallida都可侵染翦股颖，受这三种腥黑粉菌侵染的植株，子粒最后由聚集成黑粉状的冬孢子代替(Matsumoto T and Bell T.1989.Laboratory guide identification of fungi quarantine significanceCalifornia-Smut fungi)。T.sphaerococca又称迷惑腥黑粉菌(章正.关于小麦矮腥病菌某些近似种的探讨.植物病理学报，1980，10：89-94；Ingold C T.The basidium of Tilletia and it’sevolution.Mycologist，1997，11：98-100.)，主要危害翦股颖属，常引起寄主植物矮化[周国梁.禾草腥黑粉菌及其近似种的分类进展.植物检疫，2000，14(3)：160-163.]，该病菌广泛分布于欧洲各国，我国尚未发生。T.pallida冬孢子网脊疣状，不形成网眼状网目，而T.sphaerococca和TCT的孢壁纹饰呈网眼状，T.pallida与T.sphaerococca、TCT两者差异明显，易于区分。Boyd，Carris and Gray[Boyd，M L，Carris L M and Gray P M.1998.Characterization of Tilletiagoloskokovii and allied species.Mycologia，90(2)：310-322.]、罗加凤等从病菌冬孢子形态、自发荧光现象、萌发生理特性等方面对T.sphaerococca进行了较详细的研究[罗加凤，黄国明，崔铁军.进境翦股颖草种中腥黑粉菌的检验鉴定.植物检疫，2004，18(6)：355-359]，T.sphaerococca冬孢子直径22-30um，比TCT略大，TCT冬孢子直径为18-24um，T.sphaerococca萌发最适温是10℃一周左右，初生担孢子“H”结合普遍存在，TCT最适温为17℃一周左右，萌发产生的初生担孢子“H”结合也普遍存在。

近年来，随着我国经济的发展，对外贸易的加大以及城市园林绿化建设、农牧业的需求，境外的草种大量进入我国，匍匐翦股颖和细弱翦股颖作为优良的牧草、草坪草和保土植物，每年约有2千多吨进入我国。翦股颖上腥黑粉菌的检疫鉴定是该草种真菌检疫的重要工作之一。腥黑粉菌属主要依据形态学、萌发生理、细胞学诸方面的特性以及寄主专化性这些传统方法进行分类。尽管T.sphaerococca和TCT在冬孢子形态，萌发温度有差异，但有一定的交叉，且萌发实验耗时费力，萌发是否成功受材料保存时间、材料来源、培养条件等诸多因素的制约，不利于口岸的快速检测，需要开发快速准确、适于口岸检测的方法。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，各国研究者应用分子生物学技术结合传统分类方法对腥黑粉菌属进行了深入研究。PCR方法应用最成功的例子是将黑麦草中与小麦印腥T.indica相近的腥黑粉菌区分开，确立了新种T.walkeri[程颖惠，张颖，章桂明.小麦印度腥黑穗病菌PCR检测.植物检疫，2001，15(6)：321-325；Castlebury L A，Carris L M.Tilletia walkeri，a new species onLolium multiflorum and L.perenne.Mycologia，1999，91(1)：121-131]，从而解决了困扰小麦和草种的国际贸易难题。

随着草业国际化引种频繁，翦股颖腥黑穗菌(T.sphaerococca)和小麦网腥黑穗菌(T.caries)通过口岸传入我国的风险越来越大。为了保护我国的牧草生产和城市绿化，有必要在口岸建立这两种腥黑粉菌的快速准确的分子检测方法。

发明内容

针对上述情况，本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的翦股颖上翦股颖腥黑粉菌(T.sphaerococca)和小麦网腥黑穗菌(T.caries)的双重PCR分子检测方法，能将翦股颖上腥黑粉菌近似种T.sphaerococca和TCT区别开来。该方法不仅能够检测菌丝基因组DNA，而且可以利用冬孢子双重套式扩增实现对两种腥黑粉菌冬孢子的同时检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。

本发明中收集了Tilletia属的2种近似种共计11个菌株(见表1，为菌丝和冬孢子)主要由天津出入境检验检疫局植物检疫实验室于进境检疫中截获，LMC360为交流的标本，其中LMC360、TCT3、TCT4、Ts1、Ts3、Ts4使用培养的菌丝体，LMC360、TCT1、TCT2、Ts1、Ts3、Ts5作为套式双重PCR检测方法中的冬孢子材料。

具体技术方案如下：

本发明目的是提供一种利用PCR引物对翦股颖(Agrostis spp L.)中翦股颖腥黑粉菌(T.sphaerococca)和小麦网腥黑穗菌(T.caries，简称TCT)进行检测的方法，所用的一系列引物如下：

(1)Tilletia属通用引物，序列如下：

通用外套引物：IGSUF1：GGA TGC ATT CTG GGG ACG T

              IGSUR1：GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G

通用内套引物：NIGSUF1：CAC CGC CCA AGC ACG TAC

              NIGSUR1：GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC

这两套引物用于扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性；

(2)T.sphaerococca和TCT各自的特异引物以及T.sphaerococca的外套引物，序列如下：

T.sphaerococca外套引物：IGSUF2：GAG CGATAC CTT TGC ATT CTG ACG T

                        IGSUR2：CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC

T.sphaerococca特异引物：ASSF：CTC TGCATT CTG GGGACG GTCA

                        ASSR：TTC CAT TGC ATT CTG GGG GG

这两套引物用于T.sphaerococca的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增；

TCT的外套引物：IGSUF1/IGSUR1

TCT的特异引物：ASTF：TGC ATT CTG GGG ACG ATC ATC CTG

               ASTR：TCT CTT TGC ATT CTG GGG ACG G

这两套引物用于TCT的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增；

T.sphaerococca的特异引物和TCT的特异引物，可用于菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物与特异引物双重套式PCR特异扩增冬孢子DNA。

该方法包括以下步骤：

(1)实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养；

(2)菌丝基因组DNA的提取；

(3)冬孢子的挑取与破碎；

(4)菌丝基因组DNA双重PCR检测方法的建立；

(5)冬孢子双重套式PCR检测方法的建立。

该发明的另一个目的是利用PCR引物对翦股颖中翦股颖腥黑粉菌和小麦网腥黑穗菌检测的方法在检测翦股颖上腥黑粉菌近似种方面进行应用。

本发明设计合成了5套引物，通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性。T.sphaerococca和T.caries的特异引物，可用于菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物与特异引物双重套式PCR特异扩增冬孢子DNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了快速简便、特异性强、灵敏度高、准确可靠的翦股颖上T.sphaerococca和T.caries双重PCR分子检测方法，能将翦股颖上腥黑粉菌近似种T.sphaerococca和T.caries区别开来。采用通用引物实现对实验过程的检测，避免了假阴性。该方法不仅能够检测菌丝基因组DNA，而且可以利用冬孢子双重套式扩增实现对两种腥黑粉菌冬孢子的同时检测，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。特别是冬孢子双重套式扩增实现对T.sphaerococca和T.caries冬孢子的同时检测，为直接应用于国内外对翦股颖传带T.sphaerococca和T.caries的检测创造了技术条件。

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1：菌丝基因组DNA外套通用引物的扩增

图2：菌丝基因组DNA特异引物的双重扩增

图3：冬孢子通用引物套式PCR的扩增

图4：冬孢子特异引物双重套式PCR的扩增

具体实施方式

实施例1：实验材料冬孢子的萌发和菌丝的培养

实验涉及的材料包括Tilletia属的2种近似种共计11个菌株(为菌丝和冬孢子)来源于天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心植检实验室，LMC360为交流的标本，LMC360、TCT3、TCT4、Ts1、Ts3、Ts4使用培养的菌丝体，LMC360、TCT1、TCT2、Ts1、Ts3、Ts5作为套式双重PCR检测方法中的冬孢子材料，相关信息见表1。

表1供试材料

0.5mL Eppendorf离心管中加入适量0.25％的次氯酸钠溶液，挑取一定数量的冬孢子放入，用涡旋振荡器混和，消毒50秒钟后，以3000转/分钟离心1分钟，立即用微量加样器吸去上清液，混和与离心处理时间不超过3分钟，加无菌水离心清洗两次，将冬孢子沉淀物转至3％水琼脂平板上在各自的最适温度下光照培养。培养20天的菌落，用无菌水冲洗至PDA(马铃薯培养基)上，继续培养30-45天后，收集大量菌丝供DNA提取。

实施例2：菌丝基因组DNA的提取；

采用上海生工基因组DNA纯化试剂盒(编号SK1252)提取菌丝DNA。提取的基因组DNA溶于70μL 1×TE中，其余菌丝置-70℃下备用。

实施例3：冬孢子的挑取与破碎

载玻片上放置1mm见方的盖玻片，其上滴约0.5μL 10×PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，pH8.3)，用解剖针刺破菌瘿，挑取3-10个左右冬孢子置10×PCR缓冲液中，盖上近似大小的盖玻片，用镊子轻轻摩擦盖玻片，显微镜下确认孢子破裂后将叠合的两片盖玻片一起放入含4.5μL 10×PCR缓冲液的PCR管底部，盖上管盖，以不添加冬孢子仅含PCR缓冲液作为阴性对照。

实施例4：菌丝基因组DNA双重PCR检测方法的建立

PCR扩增相关试剂为大连宝生物(TaKaRa)工程公司产品。

4.1菌丝基因组DNA通用引物的PCR扩增

4.1.1反应混合液的配制

反应体系为20μL：10×缓冲液2.0μL(其中含有终浓度为1.5mmol/L的MgCl₂)，浓度各为2.5mmol/L的四种dNTPs共0.4μL，浓度为20μmol/L的引物(IGSUF1/IGSUR1)各为0.2μL，0.2μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，0.5μL模板DNA(约为40ng)，加无菌水至20μL，以阳性质粒作为阳性对照，以添加无菌水为模板作为阴性对照。

4.1.2PCR反应程序为

94℃  预变性5分钟；

94℃  变性30秒；

63℃  复性30秒；

72℃  延伸1分钟，35个循环；

72℃  延伸7分钟。

4.1.3结果分析

对6个菌株的菌丝基因组DNA进行属通用引物IGSUF1/IGSUR1的扩增，以阳性质粒作为阳性对照，以添加无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色均能观察到特定目的大小带，外套通用引物扩增的片段应约为900bp，阳性质控和所有的菌丝基因组DNA均能得到特定大小的目的片段，见图1。

图1中的9个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、8、M表示。

阴性对照无相应产物，见图1的泳道1～7，其中1为阳性质粒，2～7分别为LMC360、TCT3、TCT4、Ts1、Ts3、Ts4，8为阴性对照，M为2000bp DNA分子量标准。

4.2菌丝基因组DNA特异引物的双重PCR扩增

4.2.1反应混合液的配制

特异引物的扩增体系同实施例4中4.1.1，其中引物换成两对特异引物(ASSF/ASSR和ASTF/ASTR)，不设置阳性对照。

4.2.2PCR反应程序

94℃  预变性5分钟；

94℃  变性30秒；

55℃  复性30秒；

72℃  延伸30秒，35个循环；

72℃  延伸7分钟。

4.2.3结果分析

对6个菌株的菌丝基因组DNA进行两对特异引物ASSF/ASSR和ASTF/ASTR的双重PCR扩增，以添加无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色均能观察到特定目的大小带，TCT的特异引物扩增片段应为500bp，只有LMC360、TCT3、TCT4显示特定大小的目的带，见图2。

图2中的8个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、M表示。

其中1～3泳道分别为LMC360、TCT3、TCT4，T.sphaerococca特异引物扩增的片段应约为280bp，只有Ts1、Ts3、Ts4显示特定大小的目的带(见图2中4～6泳道，4～6泳道分别为Ts1、Ts3、Ts4)，阴性对照无相应产物(见图2中7泳道)，M为2000bp DNA分子量标准。实施例5：冬孢子双重套式PCR检测方法的建立

5.1反应混合液的配制

第一轮的反应体系为50μL：浓度各为2.5mmol/L的四种dNTPs共0.5μL，浓度为20umol/L的引物(IGSUF1/IGSUR1和IGSUF2/IGSUR2)每条各为0.5μL，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，模板和PCR缓冲液计为5μL，加无菌水至50μL，采用阳性质粒作为阳性对照，只添加PCR缓冲液为模板作为阴性对照。

第二轮的反应体系为20μL：NIGSUF1/NIGSUR1的扩增的反应体系同实施例4中4.1.1，引物换为NIGSUF1/NIGSUR1，模板为1μL第一轮扩增产物，设置阳性对照和阴性对照；ASSF/ASSR和ASTF/ASTR的扩增的反应体系同实施例4中4.1.1，引物换为ASSF/ASSR和ASTF/ASTR，模板为第一轮扩增产物1μL，不设置阳性对照，设置阴性对照。

5.2PCR反应程序

第一轮PCR的反应程序为：

94℃  预变性5分钟；

94℃  变性30秒；

60℃  复性30秒；

72℃  延伸1分钟，25个循环；

72℃  延伸7分钟。

第二轮的反应程序为：

NIGSUF1/NIGSUR1引物对的反应程序为：

94℃  预变性5分钟；

94℃  变性15秒；

60℃  复性15秒；

72℃  延伸1分钟，35个循环；

72℃  延伸7分钟。

ASSF/ASSR和ASTF/ASTR的双重PCR反应程序为：

94℃  预变性5分钟；

94℃  变性15秒；

55℃  复性15秒；

72℃  延伸30秒，35个循环；

72℃  延伸7分钟。

5.3结果分析

挑取6个菌株3至数个冬孢子进行通用引物和外套引物的套式扩增。采用阳性质粒作为阳性对照，以不添加冬孢子仅含PCR缓冲液作为阴性对照，扩增产物经电泳、染色均能观察到特定目的大小带，内套通用引物扩增的片段应约为700bp，阳性质控和所有的菌株冬孢子经两轮套式扩增均能得到特定大小的目的片段，阴性对照无相应产物，见图3。

图3中的9个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、8、M表示。其中1为阳性质粒，2～7分别为LMC360、TCT1、TCT2、Ts1、Ts3、Ts5，8为阴性对照，M为2000bp DNA分子量标准。

TCT的特异引物扩增片段约为500bp，只有LMC360、TCT1、TCT2显示特定大小的目的带，见图4。图4中的8个泳道从左到右分别用1、2、3、4、5、6、7、M表示。(1～3泳道分别为LMC360、TCT1、TCT2)，T.sphaerococca特异引物扩增的片段约为280bp，只有Ts1、Ts3、Ts5显示特定大小的目的带(见4～6泳道，4～6泳道分别为Ts1、Ts3、Ts5)，阴性对照无相应产物(图4中7泳道)，M为2000bp DNA分子量标准。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>翦股颖上两种腥黑粉菌近似种的分子检测方法

<130>20080531

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ggatgcattc tggggacgt                                   19

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gtagccttgt tgctacgatc tg                               22

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

caccgcccaa gcacgtac                                    18

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

gaccttttgg ggtcaaactt ctc                              23

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gagcgatacc tttgcattct gacgt                            25

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

cactgcattc tggggacgta c                                21

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ctctgcattc tggggacggt ca                               22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

ttccattgca ttctgggggg                                  20

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

tgcattctgg ggacgatcat cctg                             24

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

tctctttgca ttctggggac gg                               22