高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法

摘要

本发明公开了一种高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法，属药用植物单体的分离方法。本发明以钩吻总生物碱为原料，以高速逆流色谱仪为分离设备，方法包括制备构成固定相、流动相的溶剂体系；高速逆流色谱仪填充满固定相；泵入流动相并平衡；由进样阀进样；根据检测器图谱或结合高效液相色谱、薄层色谱检测方法，收集目的组分，减压蒸干后重结晶获得高纯度钩吻生物碱单体。通过调整溶剂体系的具体配比参数，可以一步或分步分离单个或多个目标钩吻生物碱单体。本方法方便快捷、制备量大、样品损耗少、分离效果好、可控性强、适合自动化生产，分离获得的钩吻生物碱单体具有多种药理活性，具有制备成药物的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及药用植物单体的分离方法，具体的说是应用高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法。

背景技术

钩吻(Gelsemium elegans Benth.，GEB)为马钱科植物胡蔓藤的全草，分为中国钩吻和北美钩吻两种。在我国盛产于浙江、福建、广东、广西、湖南、贵州、云南等地，又名断肠草、野葛、毒根、大茶药等。国外，1887年H Gerrad等将其制成格林制剂，为一些国家副药典所收载；美国药物索引及日本《世界的民间药》中均有钩吻的记载。我国对钩吻的研究历史更为悠久，《神农本草》、《本草纲目》均有记载，我国民间一直应用钩吻原植物治疗各类疼痛，尤其慢性神经性疼痛与癌性疼痛。钩吻的主要有效成分为吲哚类生物碱。钩吻总生物碱或粗提物具有治疗免疫疾病、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗银屑病、扩瞳、促进畜禽生长等药理作用(张兰兰，林敬明，吴忠.钩吻化学成分与药理研究进展，中药材，2003，26(6)：451-453)。钩吻毒性大，临床应用受到一定限制，但在其显著的临床疗效诱惑下，近年对其研发日趋活跃，开始瞄准其生物碱单体。

钩吻生物碱单体，目前已经分离得到钩吻素子、甲、寅、卯、辰、丙、丁、戊、己、庚以及胡蔓藤碱甲、乙、丙、丁等40多种单体，其毒性大小不同，钩吻生物碱单体的用途也很广泛。如钩吻素子具有抗肿瘤作用(吴达荣，秦瑞，蔡晶，迟德彪.钩吻素子抗肿瘤作用研究，中药药理与临床，2006，22(5)：6-8)、调节免疫功能作用(孙莉莎，雷林生，方放治，杨淑琴，王剑.钩吻素子对小鼠脾细胞增殖反应及体液免疫反应的抑制作用，中药药理与临床，1999，15(6)：10-12)、治疗银屑病(张兰兰，黄昌全，张忠义，等.钩吻素子治疗银屑病样动物模型的疗效观察.第一军医大学学报，2005，25(5)：547-549)以及抗血小板聚集作用(方放治，单春文，陈平雁.钩吻素子对兔血小板聚集的影响，中药药理与临床，1998，14(1)：21-24)等。

目前文献报道的，用于从钩吻总生物碱中分离钩吻生物碱单体的方法为柱层析法，如硅胶柱层析法、氧化铝柱层析法。柱层析法的不足之处是：分离周期长，回收率低，分离效果很不理想。高速逆流色谱(High-speed Counter-currentChromatography，HSCCC)是国际上于20世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，它不用任何固态支撑体或载体因而克服了传统分离技术对样品组分的不可逆吸附作用，节省了材料和溶媒消耗，样品回收率高，同时还具有操作简便、分离量大、分离周期短、分离效率高以及重现性好等优点，易形成自动化生产，被广泛应用于生物、医药、环保等领域各种物质的制备分离和纯化。

经文献检索，钩吻总生物碱提取方法已有大量文献报道(徐坚，梁崇真.钩吻总生物碱提取方法的比较，药学通报，1988，23(6)：341-342)，其中包括2篇申请专利：①钩吻总生物碱的提取方法，公开号：CN101011466A，公开日：2007年8月8日；②一种抗癌镇痛的中药钩吻总生物碱和含它的药物组合物及其制备方法，公开号：CN1528767A，公开日：2004年9月15日。但上述2篇申请专利未涉及单体的分离方法。现有文献中，未见高速逆流色谱法用于钩吻生物碱单体分离的国内外报道。因此，本发明公开了高速逆流色谱法从钩吻中分离钩吻生物碱单体的方法。

发明内容

为了克服现有分离钩吻生物碱单体技术的不足，本发明目的在于提供一种高效、速效分离钩吻生物碱单体的新方法，即使用高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种高速逆流色谱法从钩吻中分离制备钩吻生物碱单体的方法，其特征是：

原料：钩吻总生物碱。

所述的原料钩吻总生物碱，系参考经典的钩吻生物碱提取方法获得(陈忠良.钩吻生物碱的提取与分离，中药通报，1987，12(5)：41；徐坚，梁崇真.钩吻总生物碱提取方法的比较，药学通报，1988，23(6)：341-342；陈竞峰，袁慧.钩吻总碱的提取、分离、鉴定及一般毒性，湖南农业大学学报(自然科学版)，2003，29(5)：422-425)。

分离设备：高速逆流色谱仪

所述的分离设备高速逆流色谱仪，根据所需目标分离量的不同，可选择分析型、半制备型或制备型高速逆流色谱仪。

高速逆流色谱分离制备钩吻生物碱单体的方法，包括制备构成固定相、流动相的溶剂体系；高速逆流色谱仪填充满固定相；泵入流动相并平衡；由进样阀进样；根据检测器图谱或结合高效液相色谱、薄层色谱检测方法，收集目的组分，减压蒸干后重结晶获得高纯度钩吻生物碱单体。

所述的溶剂体系可为：1)烷烃∶脂肪酸酯∶脂肪醇∶水构成的两相溶剂体系；2)氯仿∶脂肪醇∶水(含一定浓度酸)构成的两相溶剂体系；3)以及在上述两种体系基础上建立的多元两相溶剂体系。

所述的分离方法，通过调整溶剂体系的具体配比参数，可用于一步分离单个目标钩吻生物碱单体；也可一步分离多个目标钩吻生物碱单体；亦可分步分离钩吻生物碱单体，即首先分离一种或几种较易分离的钩吻生物碱单体，然后将未能分离开的组分从色谱仪中泵出，浓缩后采用高速逆流色谱法进行二次分离。

分离出的钩吻生物碱单体可通过熔点仪测定熔点、高效液相色谱仪测定纯度、紫外(Uultraviolet，UV)全波谱扫描图谱、红外(Infrared，IR)扫描图谱、核磁共振谱(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)、质谱(Mass Spectrum，MS)等方法验证其结构。

本发明的优点是：

1)方便快捷，操作简便，分离周期短。传统分离制备方法操作繁琐、分离周期长，一般要1～2个月，甚至更长时间；采用本法高速逆流色谱法分离钩吻生物碱单体，只需1～2天即可，大大缩短分离周期。

2)制备量大。根据所需的目标样品量，可选择不同型号的高速逆流色谱仪进行分离。其中，制备型高速逆流色谱仪进样量可达几克甚至几十克，一次分离出的钩吻生物碱单体的量即可约达中试水平。

3)样品损耗少，得率高，分离效果好。传统的柱层析法所用固定相是固体，易出现样品的吸附、拖尾、分离纯度不高等现象；而高速逆流色谱分离法所用固定相是液体，不存在吸附现象，因而分离得率高，不易产生拖尾，分离效果好，经重结晶后纯度可达98.5％以上。

4)重复可控性好。传统的柱层析法常采用梯度洗脱，洗脱液浓度、洗脱速度不易精确控制，重复性差；而本法参数可控，重复性好，适合自动化生产，可推广应用。

5)分离得到的钩吻生物碱单体，具有多种药理活性，如调节免疫、抗肿瘤等作用，具有制备成药物的潜在应用。本分离方法，则提供了实现钩吻生物碱单体药用的产业化制备基础。

总之，通过调整溶剂体系，可以采用高速逆流色谱法一步分离某种或多种目标钩吻生物碱单体，也可分步分离多种钩吻生物碱单体。较传统分离方法操作简便，分离周期短，可控性好，制备量大，样品损耗少，拥有用于自动化制备钩吻生物碱单体应用的前景，钩吻生物碱单体具有多种药理效应，有望应用于制备治疗多种疾病的药品，而本法可以成为制备钩吻生物碱单体药用的产业化制备基础。

附图说明

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述。

图1是实施例1的从钩吻总生物碱中分离钩吻素子的高速逆流色谱图；

图中横坐标表示时间；1为钩吻素子，2为钩吻素甲，3为钩吻素己。

图2是实施例2的从钩吻总生物碱中分离钩吻素甲和钩吻素己的高速逆流色谱图；

图中横坐标表示时间；1为钩吻素己，2为钩吻素甲。

图3是实施例3的从钩吻总生物碱中分离钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己等4种单体的高速逆流色谱图；

图中横坐标表示时间；1为单体1，2为单体2：钩吻素己，3为单体3：钩吻素子，4为单体4：钩吻素甲。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不对本发明的实施范围构成任何限制。

实施例1

高速逆流色谱法从钩吻总生物碱中分离钩吻生物碱单体钩吻素子(见图1)。

1.样品：钩吻总生物碱，系参考经典的钩吻生物碱提取方法(陈忠良.钩吻生物碱的提取与分离，中药通报，1987，12(5)：41；徐坚，梁崇真.钩吻总生物碱提取方法的比较，药学通报，1988，23(6)：341-342；陈竞峰，袁慧.钩吻总碱的提取、分离、鉴定及一般毒性，湖南农业大学学报(自然科学版)，2003，29(5)：422-425)从榕产钩吻根茎提取获得。

2.仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司。

3.方法：

3.1配制溶剂体系，正己烷∶乙酸乙酯∶无水乙醇∶水(3∶3∶2∶3V/V)共2200ml，充分混匀后静置过夜分层。第二天分离分层的两相溶液，上相作为固定相，下相作为流动相，超声半小时。

3.2制备样品溶液：取钩吻总生物碱约300mg，用略少于20ml的流动相溶解，超声10min，备用。

3.3平衡高速逆流色谱仪固定相、流动相体系：固定相以25ml/min流速泵入高速逆流色谱仪至泵满，设定恒温循环器温度为25℃；以1.5ml/min流速泵入流动相至平衡，泵流动相同时迅速开启主机，调主机反转，转速为900rpm。计算平衡时本溶剂体系的保留率ρ为71.6％(ρ＝(V_总-V_出)/V_总×100％，其中V_总：管路总体积(ml)；V_出：平衡过程中流动相推出的固定相体积(ml))。平衡稳定10min。

3.4上样分离：开启紫外检测器与N2000色谱工作站软件，样品通过进样阀倒吸入仪器，进样完毕的同时迅速点击软件开始采集紫外吸收数据。进样后40min开始用自动部分收集器收集流出的样品，每4min收集1管，共收集60管。收集完毕后，将主机转速调至0，关闭主机和恒温循环器，以25ml/min流速泵入固定相，将主机内的平衡体系溶液泵出回收浓缩备用。

4.目标单体收集纯化：将收集到的各管组分用高效液相色谱检测。检测条件如下：色谱柱为依利特Hypersil ODS2高效液相色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温25℃；流动相为甲醇∶水∶正丁胺(50∶50∶0.1V/V)；流速为1.0ml/min；紫外检测器，检测波长为256nm。经检测，将含有纯度较高的相同成分的组分合并，减压蒸干，乙醇重结晶，得到一个单体成分，经紫外全波谱扫描、红外图谱扫描、核磁共振谱、质谱等方法分析确定为钩吻素子，纯度＞98.5％。

实施例2

高速逆流色谱法分离钩吻生物碱单体钩吻素甲和钩吻素己。(见图2)

本实施例是采用高速逆流色谱法分步分离钩吻生物碱的单体的实例。第一步，采用高速逆流色谱法分离钩吻素子，具体方法详见实施例1；第二步，将第一步高速逆流色谱法未能分离的组分收集浓缩后，作为新的分离样品，再次经高速逆流色谱法分离，可得钩吻素甲和钩吻素己。本实施例仅述第二步。

2.1样品：实施例1中未能分离开的钩吻素甲和钩吻素己两个组分(即图1中2、3组分)收集液合并后，45℃减压蒸干，作为新的分离样品。

2.2仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司。

2.33.方法：

3.1配制溶剂体系，氯仿∶甲醇∶0.2mol/l盐酸(4∶3∶1.5V/V)共1700ml，充分混匀后静置过夜分层。第二天分离分层的两相溶液，上相作为固定相，下相作为流动相，超声半小时。

3.2制备样品溶液：取上述样品约300mg，用略少于20ml的流动相溶解，超声10min，备用。

3.3平衡高速逆流色谱仪固定相、流动相体系：固定相以25ml/min流速泵入高速逆流色谱仪至泵满，设定恒温循环器温度为25℃；以2ml/min流速泵入流动相至平衡，泵流动相同时迅速开启主机，调主机反转，转速为800rpm。计算平衡时本溶剂体系的保留率ρ为66％。平衡稳定10min。

3.4上样分离：开启紫外检测器与N2000色谱工作站软件，样品通过进样阀倒吸入仪器，进样完毕的同时迅速点击软件开始采集紫外吸收数据(检测波长为254nm)。进样后30min开始用自动部分收集器收集流出的样品，每4min收集1管，共收集100管。收集完毕后，将主机转速调至0，关闭主机和恒温循环器，用氮气将主机内的平衡体系溶液泵出回收浓缩备用。

4.目标单体收集纯化：将收集到的各管组分用高效液相色谱检测。检测条件如下：色谱柱为依利特Hypersil ODS2高效液相色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温25℃；流动相为甲醇∶水∶正丁胺(50∶50∶0.1V/V)；流速为1.0ml/min；紫外检测器，检测波长为256nm。经检测，将含有纯度较高的相同成分的组分合并，减压蒸干，乙醇重结晶，得到两个单体成分，经紫外全波谱扫描、红外图谱扫描、核磁共振谱、质谱等方法分析确定为钩吻素甲和钩吻素己，纯度＞98.5％。

实施例3

高速逆流色谱法分离钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己等4种单体。(见图3)

1.样品：钩吻总生物碱，系参考经典的钩吻生物碱提取方法(陈忠良.钩吻生物碱的提取与分离，中药通报，1987，12(5)：41；徐坚，梁崇真.钩吻总生物碱提取方法的比较，药学通报，1988，23(6)：341-342；陈竞峰，袁慧.钩吻总碱的提取、分离、鉴定及一般毒性，湖南农业大学学报(自然科学版)，2003，29(5)：422-425)从榕产钩吻根茎提取获得。

2.仪器：TBE-300A高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司。

3.方法：

3.1配制溶剂体系，氯仿∶甲醇∶0.2mol/l盐酸(2∶2∶1V/V)共2000ml，充分混匀后静置过夜分层。第二天分离分层的两相溶液，上相作为固定相，下相作为流动相，超声半小时。

3.2制备样品溶液：取钩吻总生物碱300mg，用略少于20ml的流动相溶解，超声10min，备用。

3.3平衡高速逆流色谱仪固定相、流动相体系：固定相以25ml/min流速泵入高速逆流色谱仪至泵满，设定恒温循环器温度为25℃；以1.5ml/min流速泵入流动相至平衡，泵流动相同时迅速开启主机，调主机反转，转速为850rpm。计算平衡时本溶剂体系的保留率ρ为73％。平衡稳定10min。

3.4上样分离：开启紫外检测器与N2000色谱工作站软件，样品通过进样阀倒吸入仪器，进样完毕的同时迅速点击软件开始采集紫外吸收数据(检测波长为254nm)。进样后40min开始用自动部分收集器收集流出的样品，每4min收集1管，共收集110管。收集完毕后，将主机转速调至0，关闭主机和恒温循环器，用氮气将主机内的平衡体系溶液泵出回收浓缩备用。

4.目标单体收集纯化：将收集到的各管组分用高效液相色谱检测。检测条件如下：色谱柱为依利特Hypersil ODS2高效液相色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温25℃；流动相为甲醇∶水∶正丁胺(50∶50∶0.1V/V)；流速为1.0ml/min；紫外检测器，检测波长为256nm。经检测，将含有纯度较高的相同成分的组分合并，减压蒸干，乙醇重结晶，得到四个单体成分，经紫外全波谱扫描、红外图谱扫描、核磁共振谱、质谱等方法分析确定其中三种为钩吻素子、钩吻素甲和钩吻素己，纯度＞98.5％。