荧光猝灭分析中去除猝灭剂吸收影响的校正方法

摘要

一种荧光猝灭分析中去除猝灭剂吸收影响的校正方法，是通过单独荧光试剂受激发光激发后所产生的荧光的实际测量谱a和荧光试剂与猝灭剂混合样品所产生的荧光的实际测量谱b来获得曲线A′和曲线B′，以A′表征对荧光试剂与猝灭剂的混合样品，去除直接吸收影响后荧光试剂实际可以发出的未被猝灭的荧光谱，以B′表征所述A′被猝灭剂猝灭以后的荧光谱线。以本发明方法可以克服荧光猝灭分析中猝灭剂吸收作用所产生的影响，使得那些原本因吸收谱存在交迭而不适合采用荧光猝灭法进行分析的物质现在可以利用荧光猝灭法进行分析，扩大了荧光猝灭分析的应用范围。

说明书

技术领域

本发明涉及光谱分析，特别是在荧光猝灭测试中的光谱分析，即荧光猝灭分析。

背景技术

在光谱分析中，受到激发光激发后能够产生荧光的物质称为“荧光试剂”，加入到荧光试剂溶液中以后能使原来的荧光减弱的物质则称为“猝灭剂”，通过检测加入猝灭剂前、后荧光强度之变化进行分析的方法，就称为“荧光猝灭分析”。利用荧光猝灭分析方法，可以分析某些自身荧光较难检测但具有猝灭特性的物质的含量，也可以用来分析荧光猝灭过程中两种物质之间(即荧光试剂与猝灭剂之间)的能量转移和电子转移效率。

采用荧光猝灭分析方法时，要求猝灭剂对所选择的激发光不产生吸收——即所选择的激发光的波长应当位于猝灭剂的吸收谱之外，激发光仅被荧光试剂单独吸收，满足这一条件时，加入猝灭剂前，荧光试剂所产生的荧光谱表示为图1中的曲线A；加入猝灭剂后，猝灭剂对荧光试剂所产生的荧光也不应当产生吸收，被猝灭的荧光光谱表示为图1中的曲线B。利用曲线A和曲线B即可获得荧光猝灭率。

但在实际过程中，常常由于荧光试剂与猝灭剂的吸收谱存在交迭，无法避开猝灭剂的吸收范围而仅仅对荧光试剂进行单独激发。这种情况下，加入猝灭剂前，只有荧光试剂单独对激发光进行吸收，所产生的荧光谱表示为图2中的曲线a；而加入猝灭剂后，整个过程将变得复杂化，首先，猝灭剂对激发光也同时产生吸收(以下称为直接吸收)，这将削弱荧光试剂对激发光的吸收，使得荧光试剂实际可以发出的荧光相应减少，表示为图2中的曲线A′，随后该荧光被猝灭剂所猝灭，猝灭后的荧光表示为图2中的曲线B′，而猝灭后的荧光会被猝灭剂再次吸收(以下称为二次吸收)，并导致荧光光谱出现畸变，表示为图2中的曲线b。通过实验能够测量得到的是加入猝灭剂前的曲线a和加入猝灭剂后的曲线b，但此时实际的荧光猝灭率应当由曲线A′和曲线B′获得。由于实验中无法得到代表中间变量的曲线A′和曲线B′，就无法正确地评估猝灭率，从而严重地制约了荧光猝灭分析方法的应用。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的不足之处，提供一种荧光猝灭分析中去除猝灭剂吸收影响的校正方法。利用本发明所给出的校正方法，可以通过校正曲线a和曲线b来获得曲线A′和曲线B′，从而克服荧光猝灭分析中猝灭剂吸收作用所产生的影响，使得那些原本因吸收谱存在交迭而不适合采用荧光猝灭法进行分析的物质现在可以利用荧光猝灭法进行分析，扩大了荧光猝灭分析的应用范围。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

本发明荧光猝灭分析中去除猝灭剂吸收影响的校正方法的特点是按如下步骤进行：

a、用光谱曲线a校正获得曲线A′；

所述光谱曲线a为单独荧光试剂受激发光激发后所产生的荧光的实际测量谱，以函数I₁(λ)表征光谱曲线a；以函数I₁′(λ)表征对荧光试剂与猝灭剂的混合样品，去除直接吸收影响后荧光试剂实际可以发出的未被猝灭的荧光谱曲线A′；

则${I_1}^{\prime }\left(\lambda \right)=\frac{{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})[1-{10}^{-n(\Delta E_1+\Delta E_2)}]}{(1-{10}^{-n·\Delta E_2})[1-{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}]}\times I_1\left(\lambda \right)---\left(1\right)$

式(1)中ΔE₁＝ε₁c₁Δl为猝灭剂对应激发波长的元消光度；

ΔE₂＝ε₂c₂Δl为荧光试剂对应激发波长的元消光度；

Δl为样品细分单元层的厚度；

n为样品细分单元层的层数；

ε₁为猝灭剂对应激发波长的摩尔吸收系数；

ε₂为荧光试剂对应激发波长的摩尔吸收系数；

c₁为猝灭剂的摩尔浓度；

c₂为荧光试剂的摩尔浓度；

令：测量荧光谱时所用样品池的宽度和厚度均为L，将样品池中的样品假定为一系列与激发光垂直的等厚薄层，每一个薄层均为一细分单元层，则Δl、n、L三者间的关系为：

n×Δl＝L；

b、用光谱曲线b校正获得校正曲线B′；

所述光谱曲线b为荧光试剂与猝灭剂混合样品所产生的荧光的实际测量谱；用函数I₂(λ)表征曲线b，用函数I₂′(λ)表征所述A′被猝灭剂猝灭以后的荧光谱线曲线B′；

则${I_2}^{\prime }\left(\lambda \right)={10}^{\frac{n}{2}\Delta E_1\left(\lambda \right)}\times I_2\left(\lambda \right)---\left(2\right)$

式(2)中ΔE₁(λ)＝ε₁(λ)c₁Δl为猝灭剂与波长相关的元消光度；

ε₁(λ)为猝灭剂与波长相关的摩尔吸收系数；

c₁为猝灭剂的摩尔浓度；

Δl为样品细分单元层的厚度；

n为样品细分单元层的层数。

本发明方法中，A′表征对荧光试剂与猝灭剂的混合样品，去除直接吸收影响后荧光试剂实际可以发出的未被猝灭的荧光谱，该荧光随后立刻被猝灭剂所猝灭，A′为中间变量，无法直接通过测量获得；B′表征所述A′被猝灭剂猝灭以后的荧光谱线，它穿过样品池时将被猝灭剂二次吸收，B′也是中间变量，无法直接通过测量获得。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明方法的提出，使得可以利用吸收谱数据通过计算来消除直接吸收和二次吸收的影响，进而获得真实的猝灭率。

2、本发明方法操作简便易行，使用荧光光谱仪和吸收谱仪就可以对吸收谱有交迭的物质进行分析，扩大了荧光猝灭分析方法的应用范围，提高了分析精度。

3、本发明方法中给出了校正直接吸收和二次吸收影响的计算公式，该组公式也可用来在多组份试剂分析中校正各试剂间相互吸收作用对光谱产生的影响。

关于式(1)和式(2)的导出：

1、直接吸收的校正

对直接吸收的校正就是由I₁(λ)推导出I₁′(λ)的过程。

以低聚噻吩4T(荧光试剂)和富勒烯C₆₀(猝灭剂)为例，已知加入C₆₀后4T对激发光的实际吸收，可以根据4T的本征谱I₁(λ)推导出I₁′(λ)。由于4T和C₆₀对激发光的吸收同时发生，因此不能简单地利用比尔定律来计算加入C₆₀后4T对激发光的实际吸收量。

比尔定律：I＝I₀·10^-εcl(＝I₀·10^-E)

(1)、加入C₆₀后4T对激发光实际吸收量的计算

设想将样品池种光程为L的样品细分成厚度为Δl的n个薄层，并根据每个薄层中4T和C₆₀的分布情况，建立两种物理模型，如图3所示。在模型1里，每一层中的C₆₀分子均分布于4T分子之上，当激发光透过时，先被C₆₀吸收，后被4T吸收。在模型2里，每一层中的4T分子均分布于C₆₀分子之上，当激发光透过时，先被4T吸收，后被C₆₀吸收。

首先，按模型1的吸收方式来计算加入C₆₀后4T对激发光的吸收。

对第一层：

激发光(I₀)被C₆₀吸收后${I_1}^{\prime }=I_0·{10}^{-\Delta E_1}$(元消光度ΔE₁＝ε₁c₁Δl为C₆₀的相应值)

激发光(I₀)被4T+C₆₀吸收后${I_1}^{\prime \prime }=I_0·{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}$(ΔE₂＝ε₂c₂Δl为4T的相应值)

则，4T吸收的激发光$\Delta I_{1X}={I_1}^{\prime }-{I_1}^{\prime \prime }=I_0·{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})$

对第二层：

激发光(I₁″)被C₆₀吸收后${I_2}^{\prime }={I_1}^{\prime \prime }·{10}^{-\Delta E_1}$

激发光(I₁″)被4T+C₆₀吸收后${I_2}^{\prime \prime }={I_1}^{\prime \prime }·{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}$

则，4T吸收的激发光$\Delta I_{2X}={I_2}^{\prime }-{I_2}^{\prime \prime }=I_0·{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})·{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}$

对第三层：

激发光(I₂″)被C₆₀吸收后${I_3}^{\prime }={I_2}^{\prime \prime }·{10}^{-\Delta E_1}$

激发光(I₂″)被4T+C₆₀吸收后${I_3}^{\prime \prime }={I_2}^{\prime \prime }·{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}$

则，4T吸收的激发光$\Delta I_{3X}={I_3}^{\prime }-{I_3}^{\prime \prime }=I_0·{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})·{10}^{-2(\Delta E_1+\Delta E_2)}$

对第n层：

激发光(I_n-1″)被C₆₀吸收后${I_n}^{\prime }={I_{n-1}}^{\prime \prime }·{10}^{-\Delta E_1}$

激发光(I_n-1″)被4T+C₆₀吸收后${I_n}^{\prime \prime }={I_{n-1}}^{\prime \prime }·{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}$

则，4T吸收的激发光$\Delta I_{\mathrm{nX}}={I_n}^{\prime }-{I_n}^{\prime \prime }=I_0·{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})·{10}^{-(n-1)(\Delta E_1+\Delta E_2)}$

则加入C₆₀后4T对激发光的总吸收为：

$I_X=\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\Delta I_{\mathrm{iX}}=I_0·{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})·[1-{10}^{-n(\Delta E_1+\Delta E_2)}]/[1-{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}]---\left(a\right)$

按照模型2，可以类似地推导出加入C₆₀后4T对激发光的吸收为：

$I_X=\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}\Delta I_{\mathrm{iX}}=I_0·(1-{10}^{-\Delta E_2})·[1-{10}^{-n(\Delta E_1+\Delta E_2)}]/[1-{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}]---\left(b\right)$

可以看出，根据两种假设得到的计算公式有所不同。由(a)、(b)二式容易推出，两种计算方法的相对误差为：

$\Delta I_X/I_X=(1-{10}^{-\Delta E_1})\times 100\%$(或$\Delta I_X/I_X=[(1-{10}^{-\Delta E_1})/{10}^{-\Delta E_1}]\times 100\%$)

式中ΔE₁的大小可通过细分层数n来调整(当ΔE₁＜0.01时，ΔI_x/I_x＜2.4％)。随着细分层数的增大，相对误差越来越小，两种模式所得的结果相互靠近。

实际上，C₆₀与4T混杂在一起，吸收过程不分先后，4T对激发光的吸收介于两种假想的模式之间。因此，可以在ΔE₁足够小的情况下用(a)式或(b)式来逼近加入C₆₀后4T对激发光的实际吸收。

(2)推导I₁′(λ)

设：i₁为4T本征谱I₁(λ)中的任一值，i₁′为I₁′(λ)中的对应值。

荧光强度正比于吸收光强，根据逼近结果可得：

$\frac{{i_1}^{\prime }}{i_1}=\frac{{10}^{-\Delta E_1}(1-{10}^{-\Delta E_2})·[1-{10}^{-n(\Delta E_1+\Delta E_2)}]}{(1-{10}^{-n·\Delta E_2})·[1-{10}^{-(\Delta E_1+\Delta E_2)}]}=A---\left(c\right)$

上式中ΔE₁和ΔE₂为与激发光波长对应的常数，则对光谱函数有下式成立：

I₁′(λ)＝I₁(λ)·A

上式即为式(1)，其中A为与激发波长相关的常数修正项，根据荧光试剂4T和猝灭剂C₆₀的吸收谱由式(c)计算获得。

2、侧吸收的校正

对侧吸收的校正则是由I₂(λ)推导出I₂′(λ)的过程。

仍以4T和C₆₀为例，C₆₀除了对激发光的吸收以外，对4T产生的荧光也有吸收作用，实验中发现这种吸收作用不仅使猝灭后的荧光强度减弱，还导致光谱产生畸变。

设：i₂为I₂(λ)中的任一值，i₂′为I₂′(λ)中的对应值。

样品池为正方形，激发光在水平方向上从样品池的中间穿过。由于激发光具有一定的宽度，对此作近似处理，即不考虑激发光宽度时，有：

$i_2={i_2}^{\prime }·{10}^{-\frac{n}{2}·\Delta E_1}\to {i_2}^{\prime }=i_2·{10}^{\frac{n}{2}·\Delta E_1}$

由于C₆₀对荧光的吸收随波长改变，对光谱而言，此时ΔE₁不再是常数，而是与C₆₀的吸收谱相关的函数ΔE₁(λ)。

令$B\left(\lambda \right)={10}^{\frac{n}{2}·\Delta E_1\left(\lambda \right)}---\left(d\right)$

则对光谱函数有下式成立

I₂′(λ)＝I₂(λ)·B(λ)

上式即为式(2)，其中B(λ)为函数修正项，根据C₆₀的吸收谱由式(d)导出。

附图说明

图1、图2为关于背景技术的说明；其中，图1为吸收谱无交迭时荧光猝灭光谱示意图；

图2为吸收谱存在交迭时荧光猝灭光谱示意图。

图3为本发明方法中校正计算式(1)和式(2)的推导模型；

图4为本发明方法实施例1中对4T/C₆₀直接吸收校正结果的显示。实线代表I₁(λ)，虚线代表I₁′(λ)。a)激发波长：360nm；b)激发波长：400nm。

图5为本发明方法实施例1中对4T/C₆₀二次吸收校正结果的显示。实线代表I₂(λ)，虚线代表I₂′(λ)，点划线代表4T的本征荧光谱。a)激发波长：360nm；b)激发波长：400nm。

图6为本发明方法实施例2中对5T/C₇₀直接吸收校正结果的显示。实线代表I₁(λ)，虚线代表I₁′(λ)，激发波长430nm。

图7为本发明方法实施例2中对5T/C₇₀二次吸收校正结果的显示。实线代表I₂(λ)，虚线代表I₂′(λ)，点划线代表5T的本征荧光谱，激发波长430nm。

以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明作进一步说明

具体实施方式

本实施例方法按如下过程进行：

1、利用吸收谱仪分别测量荧光试剂和猝灭剂的吸收谱，获取它们的摩尔吸收系数谱函数。

2、利用荧光光谱仪测量单独的荧光试剂样品的荧光谱，获得光谱曲线a。

3、利用荧光光谱仪测量荧光试剂与猝灭剂混合样品的荧光谱，获得光谱曲线b，该曲线包含了吸收作用和猝灭作用的影响，是多种影响共同作用的结果。

4、确定细分单元层数n的数值。假定将样品池中激发光光程为L的样品细分成厚度为Δl的n个薄层，n可取100，1000，…等数值，单元层数n的大小将会影响校正计算误差，随着细分层数的增大，计算误差越来越小。可根据具体情况选取适当的n(Δl)值，ΔE₁＝ε₁c₁Δl，当ΔE₁小于0.01时，校正计算误差小于2.4％。

5、确定细分单元层的厚度Δl。根据步骤4所确定的n的数值即可确定Δl的大小。(Δl＝L/n，L为样品池的厚度)

6、根据步骤1所得到的吸收谱，利用式(1)对步骤2所得的光谱曲线a进行校正，去除直接吸收作用的影响，获得光谱曲线A′。

7、根据步骤1所得到的吸收谱，利用式(2)对步骤3所得的光谱曲线b进行校正，去除二次吸收作用的影响，获得光谱曲线B′。

实施例1：4T和C₆₀实验数据的校正处理

实验中使用日立F-4500荧光光谱仪和岛津UV-2550紫外-可见光吸收光谱仪，实验在25℃室温下完成。实验中使用的低聚噻吩4T和富勒烯C₆₀的浓度分别为9.5·10^-5M·L^-1和5·10^-4M·L^-1，激发波长分别为360nm和400nm。

利用Origin软件对4T和C₆₀的实验数据进行校正处理，图4显示了根据式(1)对直接吸收的校正结果，图中实线为加入C₆₀之前4T的荧光谱I₁(λ)，虚线为去除C₆₀直接吸收影响后4T的荧光谱I₁′(λ)。很明显，对于不同的激发波长，直接吸收作用的影响不同。

图5则显示了根据式(2)对二次吸收的校正结果，图中实线代表I₂(λ)，虚线代表去除C₆₀二次吸收影响后被猝灭的荧光谱I₂′(λ)，点划线为4T的本征荧光谱。可以清晰地看到，由于側吸收作用的存在，I₂(λ)谱线上的第二峰明显低于第一峰，谱线发生了畸变。校正后的谱线I₂′(λ)则呈现出本征光谱原有的特征——虚线与点划线吻合得非常好。

实施例2：5T和C₇₀实验数据的校正处理

实验中使用日立F-4500荧光光谱仪和岛津UV-2550紫外-可见光吸收光谱仪，实验在25℃室温下完成。实验中使用的低聚噻吩(5T)和富勒烯(C₇₀)的浓度分别为2.1·10^-5M·L^-1和1.25·10^-4M·L^-1，激发波长为430nm。

利用Origin软件对5T和C₇₀的实验数据进行校正处理，图6显示了根据式(1)对直接吸收的校正结果，图中实线为加入C₇₀之前5T的荧光谱I₁(λ)，虚线为去除C₇₀直接吸收影响后5T的荧光谱I₁′(λ)。由于C₇₀对430nm激发光的吸收超过了5T，从图6中可以看出直接吸收作用的影响很大。

图7则显示了根据式(2)对二次吸收的校正结果，图中实线代表I₂(λ)，虚线代表去除C₇₀二次吸收影响后被猝灭的荧光谱I₂′(λ)，点划线为5T的本征荧光谱。由于側吸收作用，I₂(λ)谱线发生了明显畸变，已经看不出与本征谱有相似之处。校正后的谱线I₂′(λ)则呈现出本征光谱原有的特征——虚线与点划线吻合得非常好。

在上述实施例中，根据式(2)对因二次吸收而产生畸变的应光谱进行校正后，所得谱线均恢复本征谱的特征，校正效果良好；根据式(1)对直接吸收校正后，结合对荧光光谱仪自身校正功能的修正，计算出的荧光猝灭率在1和3之间，符合实际情况，而不经校正直接由实验数据得出的荧光猝灭率超过50，为虚高的赝象。

因此，根据本发明所提供的校正计算方法，可以较好地去除猝灭剂吸收作用的影响，并至少可以在吸收谱存在交迭的情况下对荧光猝灭率进行定性分析。