猪圆环病毒2型的快速检测技术

摘要

本发明属于动物医学领域，公开了一种关于猪圆环病毒2型的环介导等温扩增快速检测方法，通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术(LAMP)平台扩增靶序列的特定区域，在一系列质控和阴性、阳性对照的辅助下，从分子水平对包括猪圆环病毒2型的病毒核酸进行检测，本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于动物医学领域，涉及一种从血液或组织中检测病毒的方法，以及这种方法的用途。更确切讲，本发明涉及利用环介导等温扩增技术而研发的从血液中或组织中检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员，属于单股环状DNA病毒，它是已知的最小的动物病毒之一，该病毒无囊膜，具20面体，平均直径为17nm，不具备血凝活性，可抵抗pH等于3的酸性环境，能在猪源细胞和vero细胞中生长，但不产生细胞病变。根据PCV的致病性、核酸序列和抗原性，可将PCV分为两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1和PCV2在核苷酸水平约有80％的同源性。PCV1无致病性，PCV2则是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的一种主要病毒。Ellis等一些学者报道猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)也可产生典型的PMWS症状，因此有必要在猪群发生PMWS症状时检测PCV2，并与PCV1、PPV、PRV、PRRSV做进一步鉴别诊断。根据临床症状和病理变化可对PCV2进行初步诊断，病毒的确切诊断主要依靠实验室诊断技术。

PCV2的临床典型症状包括进行性消瘦，皮肤苍白，呼吸困难，厌食，精神沉郁，被冒蓬乱。解剖变化主要包括肠系膜及腹股沟淋巴结异常肿大，肺部灰褐色炎症病变，如有并发或继发感染，则其淋巴结可见出血、变性或化脓等病变.肺脏病变也比较明显，如肺肿胀、变性、表面有许多大小不一的橡皮状硬块等。有的病例其肝脏表面有白色增生花纹，有的则呈现黄疸性肝炎。淋巴结的皮质有单核细胞或巨噬细胞浸润，有时还散布着大量多核巨噬细胞。有些病例出现淋巴细胞减少、淋巴结基质增生或有嗜酸性细胞浸润。淋巴滤泡中心部有蜂窝状坏死，其周围形成由组织细胞、类上皮细胞性巨细胞、多核巨细胞、淋巴细胞以及嗜酸性白细胞聚集的炎性肉芽肿。肺有轻度多灶性或高度弥漫性间质肺炎，由于肺泡上皮细胞肿大、增生、水肿以及细胞浸润常引起肺泡壁显著肥厚，致使肺泡内有单核细胞、嗜中性白细胞及嗜酸性白细胞渗出，部分肺在支气管和血管周围还发生淋巴细胞和组织细胞浸润，并偶尔伴有多核细胞出现。

PCV2的基因组由两个主要的开放阅读框(ORF)组成，其中ORF1又称为rep基因，编码一个与病毒复制有关的35.7ku的蛋白；ORF2又称为cap基因，编码一个大小为27.8ku抗原衣壳蛋白。

PCV2的实验室诊断技术包括病毒的分离鉴定和针对PCV2抗原和抗体的检测技术。病毒分离主要是通过接种实验动物或敏感细胞进行分离，PCV2分离常用的实验动物一般为SPF猪，常用的细胞为猪肾细胞或vero细胞，采取病猪肺、肝、脾、淋巴结、扁桃体等组织，制成组织匀浆，用氯仿处理以除去有囊膜的病毒，并接种无病毒和支原体污染的猪肾细胞，同时利用氨基葡萄糖短时间处理感染细胞，以促进病毒的增殖.由于PCV2感染细胞不产生病变，因此，通常以PCR技术来确定病毒的存在，有时还可用免疫荧光技术检测病毒的生长情况，或借助电镜技术和超薄切片法来观察PCV2病毒粒子。现已证实，PCV2在PK15细胞上多代盲传才能有效增殖。针对病毒抗原的实验室诊断方法一般包括聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交、免疫组化技术等，其中原位杂交技术可检测出固定组织中的病毒抗原，免疫组化技术可用于病毒抗原在组织培养和机体细胞内生长定位的观察。PCR技术则以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术之一，它也是在PCV2的病原检测和定型中最常用的技术。针对病毒抗体的检测技术主要包括间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(EL ISA)和抗原捕获EL ISA检测技术等。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种快速、简便、灵敏和经济的用于检测猪血液或组织中PCV2的环介导等温扩增方法。

本发明是利用环介导等温扩增技术，从猪血液或组织中提取核酸，利用所设计的引物进行扩增反应，检测反应产物是否含有特异性的梯状条带，以确定猪是否感染猪圆环病毒2型的快速检测技术。

本发明以猪血液或组织核酸提取物为模板，所使用的四条特异性引物为：

本发明的实现方法如下：通过使用特异性引物，利用LAMP技术扩增PCV2基因组上的特定区域，通过检测特定产物的形成与否，从分子水平对血液或组织样品中的PCV2核酸进行筛查。

本发明的PCV2的LAMP检测方法是：以被检猪的血液或组织中的DNA为模板，根据PCV2基因组序列，设计两对针对PCV2的cap基因的特异性引物进行等温扩增反应。

进一步地，本发明所述的PCV2的LAMP检测方法中，引入了阳性对照，阳性对照为与pMD18T连接的PCV2的cap基因的重组载体。所使用的检测方法为2％的琼脂糖电泳检测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本科学家Notomi发明的一种替代PCR的迅速、简便、准确、成本低的核酸识别技术。LAMP技术用于PCV2的检测具有如下优点：

1.对靶基因的6个部位设定4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增，由于其反应是由多个引物共同启动的，所以比PCR更特异。

2.LAMP技术与PCR具有相同的灵敏度，但所需设备却十分简单，仅需一台能提供60℃-65℃的水浴锅或热块，可极大降低试验成本。

3.LAMP技术一般一个小时内即可完成，比PCR节省时间。

本发明中所使用的试剂包括：病毒DNA提取试剂和LAMP核酸扩增试剂。诊断方法的步骤如下：

(1)核酸提取

使用宝生物工程(大连)有限公司提供的MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒，按照下述方法可提取PCV2的DNA。

本操作是以从250μl样本中纯化病毒RNA/DNA为例设计的，使用其它体积的样本时，其Solution A、Solution B、DB Buffer的使用量需要按比例调整，但RinseA、Rinse B的使用量不用改变。

操作流程的详细步骤如下。

1)取250μl样本，加入1.5ml离心管中。

2)加入500μl的Solution A，剧烈振荡混均后，室温放置5分钟。

3)加入125μl的Solution B和125μl的DB Buffer，均匀混合后，12,000rpm离心5分钟。

4)将试剂盒中的Spin Column安置于2ml收集管上。

5)将上述操作3的上清液850μl转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟(如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1分钟)，弃滤液。

6)将500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

7)将500μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

8)重复操作步骤7。

9)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer(无RNA酶)，室温静置1分钟[注：为防止RNA的分解，可在Elution Buffer中加入RNase抑制剂(TaKaRa Code：D2310)，加入比例为：每50μl Elution Buffer中加入1μ的RNase抑制剂]。

10)12,000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA/DNA。

(2)LAMP反应

LAMP反应体系如下：终浓度分别为2.0μM的FIP和BIP引物，0.2μM的F和B引物，1.0mM dNTP，8U的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)，10×buffer(containing 2mM of MgSO₄，0.8M betaine)and 1μl提取的模板DNA或cDNA，反应终体积为50μl，反应在0.2ml PCR管中进行.

LAMP反应程序为：恒温水浴锅64℃条件下反应60min，然后在80℃加热10min终止反应。

LAMP反应产物检测和结果判定：反应产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳，10V/cm，30分钟后溴化乙啶染色后260nm波长观察。

附图说明

图1为猪圆环病毒2型的LAMP和PCR检测方法的敏感性比较的电泳图。从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000；1-6泳道，不同拷贝数的模板进行的PCR反应，分别为每管1，5，25，125，625，3125拷贝。7-12泳道，LAMP反应中每管中含有不同拷贝数的模板，分别为每管1，5，25，125，625，3125。PCR对猪圆环病毒2型的检出限为25拷贝，而LAMP的检出方法为5拷贝。

图2显示的是猪圆环病毒LAMP与PCV1，PPV，PRV和PRRSV病毒的交叉性反应检测电泳结果。从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL2000，泳道1，PCV2-BJ的DNA为模板；泳道2，PCV1的DNA；泳道3，PPV的DNA；泳道4，PRV的DNA；泳道5，PRRSV的cDNA；泳道6，健康猪组织的DNA。

具体实施方式

本发明实施例分成两部分完成，即实施例一：猪圆环病毒2型LAMP方法的建立；实施例二：猪圆环病毒2型LAMP方法的特异性和敏感性试验，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例<一>猪圆环病毒2型LAMP方法的建立

1猪圆环病毒2型的核酸提取

无菌采集感染猪圆环病毒2型的猪的外周血液，加入适量抗凝剂，对肺、肝、脾、肾等组织加入少量pH 7.4，0.05M的磷酸盐缓冲液(PBS)然后用组织粉碎机匀浆处理。处理后的样品按照宝生物工程(大连)有限公司提供的病毒RNA/DNA提取试剂盒提取病毒DNA。

2PCV2的LAMP反应

参照GenBank登录的PCV2的cap基因的序列，设计两对引物。本发明采用引物的序列如下：

外侧引物：

上游F：5′-ATGGGCTGCTAATTTTGCAGAC-3′

下游B：5′-TCAATAGGAAATTCAGGGCATG-3′

内侧引物：

FIP：5′-GTACAGTTCCACCTTTAGTCTC

TTTTGGTTACCATGGTGAAGAAGTGG-3′

BIP：

5′-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAGATTTTTCCTCCGTGGATTGTTCTGTAG-3′

以提取的PCV2的DNA为模板，在50μL反应体系中加入PCV2的DNA 1μL，10μmol/L外侧上、下游引物各1μl，1μmol/L内侧上、下游引物各1μl，2.5mmol/LdNTPs 2μL，Bst DNA聚合酶8U，10x缓冲液5μL，加ddH₂O至50μL。LAMP反应程序如下：65℃ 60min，然后85℃ 10min。

结果检测：PCR结束后取样进行2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为7V/cm，30分钟，结果出现LAMP反应特异的梯状条带，见图1。

实施例<二>猪圆环病毒2型LAMP方法的特异性和敏感性试验

1、PCV2的LAMP的敏感性试验

1.1PCV2病毒的定量及不同稀释度模板的确定。

按照PCV2-BJ基因组的大小和提取的病毒DNA的浓度测算，按照LAMP和PCR每管1，5，25，625，3125拷贝数进行稀释。

1.2PCV2的LAMP方法检出限与PCR方法的对比

PCV2的LAMP反应组成及反应程序按照实施例<1>进行，PCV2的PCR反应组成如下：50μl反应体系中包括1.5mM的dNTP，5μl的10×buffer，5U的Taqpolymerase(Nippon Gene)，1μM上下游引物F和B，1.0μl模板DNA或cDNA.扩增程序为94℃，5min，然后是循环程序94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。最后72℃延伸5min。PCR反应在MJ ResearchMinicycler扩增仪中进行。

1.3结果检测：

PCR产物和LAMP反应产物在同一块上琼脂糖凝胶中进行电泳。然后进行溴化乙啶染色，BIO-RAD凝胶成像仪中照相并分析，电泳结果见图2，从图中可以看出PCV2的LAMP方法的检测限为每个反应5个拷贝，而PCR反应的检出限为每个反应25拷贝，LAMP反应比PCR反应的敏感性高5倍。

2、PCV2的LAMP的特异性试验

2.1PRRSV、PPV、PRV和PCV1病毒核酸的提取和LAMP反应

分别用经过PCR或RT-PCR鉴定过的田间分离株PCV1、PPV、PRV中提取的DNA和PRRSV中的cDNA作为PCV2的LAMP反应的模板，以健康猪组织中提取的DNA作为阴性对照模板。然后按照实施例<一>中PCV2的LAMP反应体系和条件进行反应，反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2特异性反应结果分析

PCV1、PPV、PRV和PRRSV与PCV2的LAMP方法交叉性反应结果见图1。从图中可以看出上述四种病毒均与PCV2的LAMP方法无交叉性反应。健康猪组织中提取的DNA作模板的LAMP反应结果也为阴性。上述结果表明本试验所建立的PCV2的LAMP检测方法与上述四种在临床症状表现相似的病毒无交叉反应。

3、PCV2的LAMP的临床样品检测

3.1临床样品的准备

分别被PCR和测序或病毒分离诊断为PCV2阳性的86个临床样品由外周血、淋巴组织、肺、肝、肾、心和脾所组成。其中78个样品通过PCR和测序鉴定，另外8个样品通过病毒分离鉴定。

3.2LAMP检测结果

对上述86个PCV2阳性的临床样品用所建立的LAMP方法进行检测，检测结果见表2，从表中可以看出，LAMP方法对86个临床样品的检出率为96.5％，总体上比PCR的检出率高。其中对肺、肾和心的PCR和LAMP的PCV2的检出率均为100％，对血液、淋巴组织、肾和脾的PCV2的检出率LAMP方法比PCR方法略高一些。

4.结论

上述试验证明所建立的PCV2的LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速、所需设备简单、操作容易等特点，适合于实验室和田间对PCV2的快速诊断。

表2.LAMP和PCR方法对86个PCV2阳性临床样品的分析