猪2型圆环病毒、猪细小病毒核酸疫苗及猪2型圆环-猪细小-伪狂犬病三价基因工程疫苗研究

摘要

猪圆环病毒病、猪细小病毒病与伪狂犬病是危害全球养猪业的三种重要传染病，分别由猪圆环病毒2型(porcme Circovius聊e 2,PCV2)、猪细小病毒(porciIleparvovirus，PPV)和伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起。目前这三种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失，因此，为了预防和控制这些疾病，安全、高效的疫苗是首要的解决途径。 伪狂犬病毒是一个重要的活病毒载体，具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点，外源基因可稳定地插入其DNA。因此以伪狂犬病毒基因缺失株为表达载体，将其它病原的保护性抗原基因插入到PRV基因缺失疫苗株中，构建二价或多价基因工程疫苗，可以起到对多种疾病的预防作用。本文分别对PCV2和PPV核酸疫苗及PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗进行了研究，其主要研究内容如下： 1．0RF2基因和VP2基因在哺乳动物细胞中的表达 将PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因酶切分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1+中，筛选重组质粒，分别命名为pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2。然后再将pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2采用脂质体法转染IBRS-2细胞，36小时后收集转染的细胞处理后，经Western blotting检测，结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2质粒转染的IBRS-2细胞分别在29 kD和64kD处出现特异性反应带；而同步转染的pcDNA3．1(+)对照却未出现特异性带，从而表明重组的核酸质粒pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2构建成功，并在哺乳动物细胞中获得表达。 2．0RF2基因和VP2基因核酸疫苗对小鼠的免疫原性及其安全性试验 将猪圆环病毒2型ORF2基因疫苗和猪细小病毒VP2基因疫苗分别肌注免疫Balb/c小鼠两次，于首免后第14天和第56天采血，作间接ELISA抗体检测试验；检测结果显示重组的核酸疫苗都能诱导小鼠机体分别产生抗PCV和抗PPV特异性抗体。于首免后第56天，采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)，和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测。淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示构建的pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫组小鼠的脾淋巴细胞经刀豆素A(ConA)刺激后，其淋巴细胞转化率(刺激指数)分别为1.57和1.68，明显高于PBS空白对照组(刺激指数为1)和pcDNA-3.1(+)组(刺激指数为1.04)，但是低于PPV活疫苗组(刺激指数为1.76)和PCV2活疫苗组(刺激指数为1.69)；而T细胞亚类数量的检测结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫的各试验组小鼠的外周血T淋巴细胞亚类CD8<'+>的数量显著增加，而CD4<'+>的数量却减少。 这些结果表明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗均能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。提取小鼠各组织器官染色体基因组进行PCR扩增，对基因疫苗的安全性进行检测，结果显示未能从免疫小鼠各组织的基因组扩增出ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2和VP2基因未整合到小鼠染色体上，说明pcDNA-ORF2和pcDNA-+VP2核酸疫苗是安全的。 3．表达PCV2 0RF2和PPV VP2基因的重组伪狂犬病病毒的构建 将PCV2的ORF2基因和PPV的VP2基因酶切依次插入到PRV gI基因缺失通用转移载体pPI-2．EGFP的多克隆位点中，构建转移质粒pPI-2．EGFEORF2．VP2。然后再将该质粒与PRV基因缺失株SA215基因组共转染ST细胞，通过同源重组，构建了融合表达PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重组伪狂犬病毒株，命名为SA215(D)。经荧光检测和PCR、Southern转印杂交鉴定，结果表明SA215(D)构建成功；并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约120kD的融合蛋白，而融合蛋白中的PCV2 ORF2基因、PPV VP2基因蛋白都仍然保持了原有的免疫原性。此外，SA215(D)株在Vero、IBRS-2、ST和CEF细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显著差异，表明外源基因的插入不影响病毒增殖。 4．重组伪狂犬病病毒sA21 5(D)的形态学和遗传稳定性研究 将PRV基因缺失株和获得的重组病毒SA215(D)的ST细胞培养物进行扫描电镜观察，均能观察到PRV典型的病毒粒子存在，两者形态上无大的差异，表明外源基因的插入不影响病毒的形态。另外，重组病毒SA215(D)在Vero细胞上连续传7代后，分别用VP2基因和ORF2基因的扩增引物进行PCR鉴定，结果均能扩增到ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2基因和VP2基因片段己被稳定地插入到重组伪狂犬病毒SA215(D)基因组中，并具有遗传稳定性。 5．PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗对小鼠的免疫原性和安全性试验 将重组伪狂犬病毒SA215(D)制成PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗接种小鼠，并对该工程疫苗的免疫原性和安全性进行研究。小鼠安全性试验显示将重组重组伪狂犬病毒SA215(D)株，PRV SA215株和野毒Fa株分别以104和105PFU剂量接种小鼠，结果接种Fa株小鼠全部死亡，而接种SA215(D)和SA215株的小鼠全部存活；另外，将这三组免疫小鼠的组织器官进行病理切片观察，结果接种Fa株小鼠的组织病变比SA215(D)和SA215株的严重，而接种SA215(D)和SA215株小鼠的组织病变比较接近。这些结果表明SA215(D)株的毒力显著低于野毒株，而与亲本株SA215相近，初步验证了该重组病毒的安全性。 将PCV2-PPVoPRV三价基因工程疫苗加强免疫小鼠后，作间接ELISA抗体检测试验，结果显示SA215(D)能诱导小鼠产生较高的抗PRV，PCV2和PPV的抗体水平，其中抗PRV中和抗体与其亲本株SA215抗体水平相当，能完全抵抗致死剂量PRV强毒的攻击，具有与亲本株疫苗相当的免疫保护效果；淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示SA215(D)能诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖；而T细胞亚类数量的检测结果显示SA215(D)免疫小鼠能有效提高T细胞数量，增强小鼠的免疫水平。这些结果表明重组伪狂犬病毒SA215(D)制成的PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗能成功诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。重组病毒对PRV Fa株在体内定植特性研究显示免疫重组病毒SA215(D)可以抵御PRVFa株在小鼠中的定植。以上结果表明重组病毒SA215(D)可以作为预防猪2型圆环病毒、猪细小病毒和伪狂犬病的三价基因工程疫苗候选株。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

1.1猪圆环病毒的研究进展

1.1.1猪圆环病毒的发现及危害

1.1.2猪圆环病毒特性

1.1.3猪圆环病毒流行病学

1.1.4猪圆环病毒的分子生物学

1.1.5检测方法的研究进展

1.1.6猪圆环病毒疫苗的研究进展

1.2猪细小病毒的研究进展

1.2.1猪细小病毒的发现及危害

1.2.2猪细小病毒形态、理化特性与血凝性

1.2.3猪细小病毒培养特性

1.2.4猪细小病毒流行病学

1.2.5猪细小病毒的分子生物学

1.2.6猪细小病毒疫苗的研究进展

1.3伪狂犬病毒的研究进展

1.3.1猪伪狂犬病毒的危害

1.3.2猪伪狂犬病毒的特性

1.3.3猪伪狂犬病毒鉴别技术的研究

1.3.4猪伪狂犬病毒的分子生物学

1.3.5伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究进展

1.4研究的目的和意义

第二章猪2型圆环病毒和猪细小病毒核酸疫苗的研究

2.1实验材料

2.1.1毒种与细胞

2.1.2菌种与质粒

2.1.3研究中所用的引物

2.1.4主要的药品及试剂

2.1.5主要培养基

2.1.6质粒小量抽提液

2.1.7质粒大抽与纯化用缓冲液

2.1.8 SDS-PAGE缓冲液

2.1.9 Weststern blotting缓冲液

2.1.10 ELISA缓冲液

2.1.11其它缓冲液

2.1.12实验动物

2.2实验方法

2.2.1质粒的小量制备

2.2.2质粒的大量制备与纯化

2.2.3 PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因酶切与回收

2.2.4真核表达载体pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2的构建

2.2.5连接反应

2.2.6感受态细胞制备

2.2.7连接产物的转化

2.2.8构建表达质粒用ORF2基因进行PCR检测

2.2.9构建表达质粒用VP2全基因进行PCR检测

2.2.10重组质粒的酶切鉴定

2.2.11转染细胞制作准备

2.2.12转染细胞制作

2.2.13酶标SPA制备

2.2.14重组质粒表达及检测

2.2.15实验分组

2.2.16小鼠脾T淋巴细胞的制备及脾细胞增殖实验

2.2.17外周血T淋巴细胞的预处理及亚群数量的检测

2.2.18免疫小鼠血清抗体检测

2.2.19基因疫苗的安全性检测

2.3结果与分析

2.3.1 pcDNA-3.1(+)、PCV2 ORF2和PPV VP2基因酶切与回收

2.3.2 pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2质粒的构建及鉴定

2.3.3 PCV2 ORF2和PPV VP2基因在哺乳动物细胞中的表达

2.3.4脾细胞增殖实验-MMT法

2.3.5 T细胞亚类数量的检测

2.3.6小鼠血清中PCV2特意性抗体测定

2.3.7实验小鼠血清中PPV特意性抗体测定

2.3.8基因疫苗的安全性检测

2.4讨论

2.4.1目的基因的选择

2.4.2真核表达质粒的选择与构建

2.4.3 pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗的免疫原性

2.4.4 pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗的安全性

2.5结论

第三章PCV2-PPV-PRV三价基因工程疫苗的研究

3.1实验材料

3.1.1毒种与细胞

3.1.2菌种与质粒

3.1.3研究中所用的引物

3.1.4主要的药品及试剂

3.1.5主要培养基

3.1.6质粒小量抽提液

3.1.7质粒大抽与纯化用缓冲液

3.1.8 SDS-PAGE缓冲液

3.1.9 Western blotting缓冲液

3.1.10 ELISA缓冲液

3.1.11其它缓冲液

3.1.12实验动物

3.2实验方法

3.2.1质粒的小量制备

3.2.2质粒的大量制备与纯化

3.2.3感受态细胞制备

3.2.4伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.ORF2的构建

3.2.5伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.ORF2.VP2的构建

3.2.6病毒的增殖

3.2.7 PRV病毒基因组的提取

3.2.8转染细胞准备

3.2.9脂质体介导的共转染

3.2.10重组病毒的空斑筛选

3.2.11重组病毒的空斑纯化、PCR鉴定及绿色荧光检测

3.2.12重组病毒Southern杂交

3.2.13重组病毒SDS-PAGE电泳

3.2.14重组病毒Western blotting

3.2.15重组病毒PRV、PCV2和PPV抗原性检测

3.2.16重组病毒在不同细胞上的增殖滴度

3.2.17重组病毒的遗传稳定性检测

3.2.18重组病毒与亲本毒株SA215形态学比较

3.2.19病毒株PFU的测定

3.2.20重组病毒的安全性试验

3.2.21伪狂犬病毒SA215(D)株攻毒小鼠的病理学

3.2.22重组病毒对伪狂犬病的保护力实验

3.2.23重组病毒对小鼠的免疫性实验

3.2.24重组病毒对PRVFa株在小鼠体内的定植特性研究

3.3结果与分析

3.3.1伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.ORF2.VP2的构建及酶切鉴定

3.3.2重组伪狂犬病毒SA215(D)的构建与筛选

3.3.3重组病毒的SA215(D)PCR鉴定

3.3.4重组病毒SA215（D）的SOUTHERN杂交鉴定

3.3.5重组病毒SA215（D）WESTERN-BLOTING检侧

3.3.6重组病毒SA215(D)PRV、PCV2和PPV抗原性检测

3.3.7重组病毒SA215(D)在不同细胞上的增殖

3.3.8重组病毒SA215(D)的遗传稳定性

3.3.9重组病毒SA215(D)与亲本毒株SA215形态学比较

3.3.10重组病毒SA215(D)安全性试验

3.3.11伪狂犬病毒SA215(D)株攻毒小鼠的病理学观察

3.3.12重组病毒对伪狂犬病的保护力实验

3.3.13免疫小鼠T细胞亚群数量的变化

3.3.14免疫小鼠的脾淋巴细胞增值反应检测

3.3.15免疫小鼠的PRV、PCV2和PPV抗体检测

3.3.16重组病毒SA215(D)对PRVFa株体内定植特性的研究

3.4讨论

3.4.1伪狂犬病病毒载体的选择

3.4.2重组伪狂犬病病毒SA215(D)的构建

3.4.3重组伪狂犬病毒SA215(D)的筛选

3.4.4外源基因在伪狂犬病病毒载体中的表达

3.4.5外源基因的插入对伪狂犬病病毒增殖、毒力和保护力的影响

3.4.6重组病毒诱导的体液免疫与细胞免疫应答

3.5结论

参考文献

致谢

个人简介

附件