抗肝癌源性生长因子单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及抗肝癌源性生长因子单克隆抗体及其应用。本发明制备了抗人肝癌源性生长因子(HDGF)的特异性单克隆抗体。用所述单克隆抗体可以制备多种不同检测方法的HDGF检测试剂。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种抗肝癌源性生长因子单克隆抗体。具体涉及抗人肝癌源性生长因子(以下简称为HDGF)的特异性单克隆抗体。本发明还涉及用所述单克隆抗体制备多种不同检测方法的HDGF检测试剂的应用。

背景技术：

早期发现和正确诊断恶性肿瘤，对肿瘤病人的治疗方案起着决定性作用。

HDGF是肝癌源性生长因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)。HDGF相关蛋白(HDGF related protein，HRPs)是一个新近发现的生长因子家族，由HDGF、HRP1、HRP2、HRP3、HRP4以及LEDGF/p75/p52共同构成。

HDGF在肿瘤病理中起着极为重要的作用，它可能影响着肿瘤的发生和发展过程。动物实验证实了HDGF具有致肿瘤生成作用，应用反义核酸下调HDGF的表达则能抑制癌细胞的增殖及其侵袭作用。已有的对多种恶性肿瘤的研究表明，HDGF在肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、食管癌及恶性黑色素瘤等肿瘤组织中均呈现过表达，并且表达水平与表达模式与肿瘤的恶性程度、复发及预后密切相关，因此HDGF被认为是一个广谱的肿瘤预后标志物。

因此，检测HDGF表达水平有助于临床医生及早并正确判断恶性肿瘤复发的可能及病人的预后，从而制定出相应的治疗方案。但现有的技术手段对于HDGF表达水平的检测是以免疫组织化学或是免疫印迹(Western blot)为主，这些方法的缺点是不易准确定量，不便于重复测定。

另外现有技术所采用的抗HDGF抗体均为多克隆抗体，用重组的人HDGF蛋白或是用合成的HDGF多肽(C-末端aa231-240)免疫家兔后获得的血清。但是多克隆抗体往往具有背景较高而特异性较低，并且应用其进行的免疫组化结果不易标准化等缺点。

目前尚无抗HDGF单克隆抗体，也未见在肿瘤病人血清中可以检测到HDGF的报道。

发明内容：

本发明的目的是制备抗肝癌源性生长因子(HDGF)单克隆抗体，并且将所制备的单克隆抗体用于HDGF的定性及定量检测，特别是用多种不同方法检测在人血清中HDGF的表达水平。

本发明制备了抗HDGF的单克隆抗体(anti-HDGF mAb)，取名为2F12。所述单克隆抗体是利用分子生物学技术表达并纯化了重组人HDGF蛋白，以此为抗原免疫小鼠后，采用杂交瘤技术经过一系列的筛选和亚克隆，制备出的。

制备上述抗HDGF单克隆抗体所用的杂交瘤细胞，命名为2F12。已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C200816，保藏时间：2008年4月22日。

所述抗HDGF单克隆抗体2F12，其重链与轻链可变区如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。其中：

SEQ ID NO：1是抗HDGF单克隆抗体重链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：2是抗HDGF单克隆抗体重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO：3是抗HDGF单克隆抗体轻链可变区DNA序列；

SEQ ID NO：4是抗HDGF单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。

本发明用上述抗HDGF单克隆抗体建立了多种用于HDGF检测的方法，包括：酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹(Western blot)、免疫沉淀(IP，见图1，图2)、免疫荧光(图3)及免疫组化(图4)。

本发明还采用常规的方法用上述纯化的重组人HDGF蛋白免疫家兔，获得了抗HDGF多克隆抗体。

本发明还用上述抗HDGF单克隆抗体作为捕获抗体，用上述抗HDGF多克隆抗体为检测抗体，建立了检测HDGF蛋白的双抗体夹心ELISA法，具体操作方式如下：

1.用抗HDGF单克隆抗体包被ELISA板，4℃过夜；

2.用PBST洗涤3次后，加入封闭液4℃封闭过夜；

3.加入用1％BSA稀释His-HDGF蛋白，以1％BSA为空白4℃过夜；

4.PBST洗涤3次后，加入抗HDGF兔血清(1∶1000)，室温90min；

5.PBST洗涤3次后，1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG，室温90min；

6.PBST洗涤4次后，加入底物pNPP，室温显色30min，测A405nm的OD值。

本发明的优点：

1.Western蛋白印记实验结果表明HDGF单克隆抗体可以很好的识别重组的His-HDGF。

2.免疫沉淀实验有效地检测并证实了外周血液中存在着HDGF。该方法为将来建立简便易行的检测血清中HDGF方法如夹心ELISA提供了必要条件。

3.免疫荧光实验结果说明所制备的HDGF单克隆抗体无论是效价还是特异性，均优于多抗，可以用于流式细胞仪等试验。

4.免疫组化实验结果显示染色清晰，定位准确，基本没有背景干扰。而且由于HDGF单克隆抗体特异性高，简化了实验步骤，在进行的免疫组化过程中，无需预先封闭，抗原修复后，直接加入稀释的单抗即可。

5.HDGF的双抗体夹心ELISA检测方法最低检测限为4ng/ml，灵敏度高。

用本发明制备的抗HDGF单克隆抗体，利用双抗体夹心ELISA法、Western蛋白印记实验、免疫沉淀实验、免疫荧光实验或免疫组化等实验方法，可以分别制备多种不同的检测HDGF的试剂。

附图说明：

图1是细胞免疫沉淀实验，图中，M是蛋白标记，1是阳性参照(His-HDGF)，2是NIH3T3(小鼠成纤维细胞)，3是Hep G2(人肝癌细胞)，4是M14(人恶性黑色素瘤细胞)，5是阴性参照；

图2是血清样本免疫沉淀实验，图中，1、2是正常人血清，3是阴性参照，4是阳性参照；5、6是胃癌，7、8是肠癌，9、10是乳腺癌；

图3是免疫荧光实验，图中，A是抗HDGF兔血清(1∶100，FITC-绿色)，B是正常光镜，C是抗HDGF mAb(1∶1000，罗丹明-红色)，D是DAPI(标记细胞核，蓝色)E是叠加后；

图4是乳腺癌免疫组化实验，图中，1处指肿瘤间质。

生物材料保藏信息：

培养物名称：杂交瘤细胞2F12

保藏编号：CCTCC NO：C200816

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏时间：2008年4月22日

具体实施方式：

实施例1HDGF单克隆抗体的制备

1、重组人HDGF蛋白的制备

取等量的3份冻存人肝癌组织(来自于南京医科大学第一附属医院)，加入1ml Trizol后匀浆，按照说明书中的方法提取总RNA后，经反转录成cDNA，采用PCR扩增HDGF片段。正向引物为5’-gcggatccatgtcgcgatccaaccggcagaag-3’，反向引物为5’-cggaattcggcaggctctcatgatctctgatgcc-3’，反应条件为：经94℃5min热启动，94℃1min，60℃1min，72℃2min，40个循环后72℃延长10min。产物进行琼脂糖电泳后发现有一长度约为700bp的片段被扩增出来，经测序证实和BLAST对比后，证实序列完全正确为人HDGF片段。

扩增后的HDGF片段经T4连接酶过夜连接后，连接于T载体并转入大肠杆菌XL1-Blue.涂于LB平板37℃过夜培养，次日挑取单个克隆接种于LB培养基振荡培养至OD₆₀₀＝2.0，提取质粒分别进行PCR及测序，证实序列完全正确。经酶切后，再将HDGF片段分别插入表达载体pGEX-4T-2和pET-28-a(+)，同样转入XL1-Blue，进行质粒的扩增及PCR、限制性酶切鉴定，并再次测序。经上述鉴定后，证明插入序列及阅读框架完全正确。将表达载体pGEX-4T-2-HDGF和pET-28-a(+)-HDGF转入感受态的表达菌BL21(DE3)，进行诱导表达。GST-HDGF融合蛋白的最佳表达条件为OD₆₀₀≈0.8-1.2，IPTG 1mM，37℃10hr，His-HDGF的最佳表达条件为以0.5mM IPTG，37℃诱导6hr，重组蛋白主要存在于细菌的周质腔内。大量培养、诱导后，经超声裂解细菌，8000g离心30min，弃去沉淀，留取上清。用0.2μm滤膜过滤后，采用AKTA的FPLC蛋白纯化仪，经GSTrap FF亲和层析柱(5ml，GE)纯化GST-HDGF融合蛋白，经HisTrap^TM HP亲和层析柱(5ml，GE)纯化His-HDGF蛋白。

2.小鼠的免疫接种

免疫动物为6周龄雌性BALB/c小鼠。第一次免疫时，首先将20μg GST-HDGF融合蛋白与等体积的2×聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样缓冲液混合，经100℃加热10min变性，然后加入福氏完全佐剂(Sigma)0.25ml和PBS至总体积为0.5ml，经超声充分混匀后，腹腔注射免疫小鼠。以后每隔三周，将福氏完全佐剂改为不完全佐剂(Sigma)，以同样方法进行抗原处理，对小鼠分别进行第二和第三次免疫。第三次免疫后第10天，眼眶采血，分离血清采用间接ELISA法测定效价。方法如下：用His-HDGF(2μg/ml)包被ELISA板，4℃过夜。次日倾去包被液，用PBST洗板2次后，加入1％BSA 200μl/孔，37℃封闭1hr。弃去封闭液后，加入自1∶2000开始倍比稀释的小鼠血清50μl/孔，室温作用90min。PBST洗板3次后，加入碱性磷酸酶标记的抗小鼠Ig G 50μl/孔，室温作用90min。PBST洗板4次后，加入显色底物pNPP 50μl/孔，室温放置30min后，405nm读取OD值，结果显示血清效价达到1∶128000以上。在第三次免疫4周后，对小鼠腹腔和尾静脉分别注射不含佐剂的40μg(天然和变性蛋白各20μg)GST-HDGF融合蛋白进行最后的追加免疫。3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞，用不含血清的DMEM培养基(Invitrogen)洗涤后，与小鼠骨髓瘤细胞(SP/20OUR-1，P3X63AF8/653)按2∶1比例，在50％聚乙二醇(PEG，pm 1500，Sigma)存在下进行细胞融合。1000rpm离心5min后，弃去上清，将细胞悬浮于预热的含有20％胎牛血清(FBS，Hyclone)和支持杂交瘤细胞生长的Supplement(ROCHE)、1％L-谷氨酰胺(Invitrogen)、0.1％β-巯基乙醇(Invitrogen)和1％青、链霉素(Invitrogen)的OPTI-MEM(Invitrogen)的HAT(Sigma)培养基中，按150μl/孔分种于10块96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

4.阳性克隆的筛选及亚克隆

细胞融合后培养至第7天，用His-HDGF(2μg/ml)包被ELISA板，以1∶5000稀释最后一次免疫的小鼠血清为阳性对照，碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(Sigma)为二抗，采用常规的间接ELISA法，检测10块培养板中的阳性克隆。根据ELISA结果挑出24个阳性克隆，转种于24孔细胞培养板中，用含有HT(Sigma)的20％FBS OPTI-MEM培养基继续培养。3天后，取培养上清进行蛋白印记实验(Western blot)，进一步筛选阳性克隆。具体步骤如下：用总量为20μg His-HDGF进行SDS-PAGE后，将蛋白转至硝纤膜上。5％脱脂奶粉室温封闭2小时后，将膜固定于专门的装置上，在每一孔内加入细胞培养上清650μl，同时取一孔加入1∶5000稀释的最后一次免疫小鼠血清为阳参，室温孵育90min。经PBST洗涤3次后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠酶标二抗(Sigma)室温孵育90min，经PBST洗涤4次后，用SuperSignal West Pico Trial Kit(PIERCE)进行信号检测。结合Western blot和ELISA检测结果，挑出一株Western和ELISA均为阳性的克隆，取名为2F12。采用有限稀释法对2F12进行亚克隆，并进一步扩大培养，用于制备单抗并冻存细胞。

5.单克隆抗体的制备及纯化：

将扩大培养后的2F12，转至25ml培养瓶中，用含有10％FBS的OPTI-MEM培养基进行培养。待细胞长至融合状态，将细胞转至75ml培养瓶中，并将培养基中的血清降至7.5％FBS。在后续的传代过程中，逐渐降低血清的浓度直至细胞生长在完全无血清的培养基中(Hybridoma-SFM medium，GIBCO)。经1300rpm离心5min，收集上清4℃保存。用15mlSFM培养基重悬细胞后，将细胞悬液加入生物反应器中继续培养，每周收集一次细胞培养上清。待收集100ml无血清培养上清后，用HiTrap protein G柱(5ml，GE)纯化单抗。上样缓冲液为20mM PBS(pH 7.0)，洗脱缓冲液为0.1M甘氨酸(pH 2.7)，中和缓冲液为1M Tris(pH9.0)。

6.单克隆抗体的亚类鉴定和可变区序列测定：

纯化后的单抗用ROCHE公司的ISOSTRIP Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Cat#1493027)进行亚类鉴定，结果表明2F12为IgG1/κ。

扩增培养杂交瘤细胞2F12，用Trizol(Invitrogen，Cat#15596-026)提取细胞总RNA，经RT-PCR分别克隆并扩增出抗HDGF单克隆抗体的重链与轻链可变区DNA片段，测序。

实施例2～6是HDGF单克隆抗体用于多种免疫检测的实验

实施例2Western蛋白印记实验

1.方法

用重组的His-HDGF(0.1μg/lane)进行SDS-PAGE后，然后将蛋白转到硝纤膜上。5％脱脂奶粉室温封闭1小时后，按泳道将膜切成3等份，分别加入纯化后的实施例1制备的2F12单抗(1∶10000)、1∶5000稀释的最后一次免疫小鼠血清和1∶1000抗His抗体(Invitrogen)作为阳参，4℃过夜。次日倾去一抗后，用PBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠酶标二抗(1∶2000)室温孵育90min，倾去二抗，PBST洗膜4次，用ECL发光系统(PIERCE)进行信号检测。

2.结果与结论

应用我们制备的单抗及多克隆抗体所识别的蛋白条带与应用Invitrogen公司商品化的抗His抗体识别出的条带处于同一位置，均为40KDa，其大小与计算出的His-HDGF理论分子量相同。

上述结果说明我们制备的抗HDGF单克隆抗体可以很好的识别重组的His-HDGF，可以用于检测HDGF的Western blot。

实施例3免疫沉淀实验

1.方法

将单抗(5μg)分别与15μl Protein G混合，冰上放置半小时后，各加入His-HDGF重组蛋白1μg，加PBS至1ml。4℃混匀过夜。次日离心小心吸去上清，用PBST洗涤2次后，加入20μl蛋白电泳上样缓冲液100℃加热变性后，进行SDS-PAGE。经转膜、5％脱脂奶粉封闭后，加入1∶5000稀释的抗HDGF兔血清，4℃过夜。第二天用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标抗体作为二抗，采用ECL发光系统进行Western检测，结果2F12单抗可以用于重组的蛋白标准品的免疫沉淀。有文献报道HDGF可在某些肝癌细胞株和黑色素瘤细胞株中表达，我们用2F12对培养的肝癌细胞株Hep-G2、黑色素瘤细胞株M14以及小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞的裂解液，进行了的免疫沉淀实验(试验方法同上)，结果表明Hep-G2、M14均HDGF阳性细胞株，NIH3T3为阴性细胞株，与文献报道相吻合(见附图1)。

上述的试验说明我们制备的单抗，不仅仅能够与蛋白标准品相互作用，而且可以从细胞裂解液所含有的众多蛋白成分中，与天然的HDGF相互作用，因而可以应用于蛋白质相互作用的研究。随后我们测试了采用免疫沉淀的方法是否可以在肿瘤病人的血清中检测到HDGF的存在。取10μg 2F12与15μl Protein G混合，冰上放置半小时后，加入分别加入正常人和肿瘤病人血清100μl及PBS至总体积为500μl，4℃反应2h，期间每15min混匀一次。10000rpm离心2min，小心吸去上清，加入0.5mlPBS混匀洗涤，10000rpm离心2min，弃去上清。经2次洗涤后，按前述的方法依次进行电泳、转膜、封闭、抗HDGF兔血清(1∶2000)、加酶标二抗及信号检测。

2.结果与结论

在正常人和多种肿瘤病人的血清中均检测到了HDGF。从条带的灰度上看，肿瘤病人血清中HDGF的含量高于正常人(见附图2)。

采用我们建立的免疫沉淀方法则可以有效地检测并证实了外周血液中存在着HDGF。该方法为将来建立简便易行的检测血清中HDGF方法如夹心ELISA提供了可靠的实验资料，奠定研究基础。

实施例4免疫荧光实验

1.方法

通过实施例3的免疫沉淀试验证实了HepG2细胞为HDGF阳性细胞，NIH3T3为HDGF阴性细胞。将HepG2与NIH3T3各2000个细胞混合培养48小时后，用4％甲醛室温固定30min，PBS洗涤2次。5％脱脂奶粉室温封闭45min，同时加入用封闭液稀释的不同稀释度的抗HDGF兔血清(1∶100、1∶500、1∶1000)和抗HDGF单克隆抗体(2F12，1∶1000)，37℃孵育1.5h。PBS洗涤2次后，加入罗丹明标记的抗小鼠IgG(1∶100)和FITC标记的羊抗兔抗体(1∶20)，37℃孵育1.5h。PBS洗涤2次后，加入DAPI(1∶300)，室温5min，PBS洗涤2次后，封片。4℃避光过夜，次日在荧光显微镜下进行观察。

2.结果与结论

发现当兔血清稀释度为1∶500时，绿色荧光信号较弱，观测时间稍长荧光即会很快淬灭。而稀释度为1∶100时，尽管荧光信号强度适中，绿色荧光主要定位于HepG2细胞上，但仍有极少量定位于NIH3T3上的非特异性荧光信号，并且在HepG2细胞的亚细胞定位不够准确，背景较强。而红色荧光标记的单抗则只定位于HepG2细胞的细胞核上，NIH3T3未见任何非特异性荧光染色。

这一结果说明我们制备的单克隆抗体无论是效价还是特异性，均优于多抗，可以用于流式细胞仪等试验(见附图3)。

实施例5免疫组化实验

1.方法

1)乳腺癌石蜡切片采用常规的脱蜡方法脱蜡至水(免疫组化实验标本为江苏省肿瘤医院保存的乳腺癌组织的蜡块)。

2)蒸馏水冲洗后，切片入pH6.0柠檬酸缓冲液中电饭煲煮沸20min进行抗原修复。

3)加入1∶2000稀释的抗HDGF单抗(2F12)，37℃孵育1小时或4℃过夜。

4)PBS洗片，5分钟×3次。

5)滴加HRP标记的抗小鼠抗体(福州迈新maxvision)，室温孵育20分钟。

6)PBS洗片，5分钟×3次。

7)DAB显色。

8)自来水充分冲洗，复染，封片。

说明：在采用实施例1制备的单抗进行的免疫组化过程中，由于其特异性高，因此在抗原修复后，直接加入1∶2000稀释的单抗即可，无需预先封闭。

2.结果

结果显示肿瘤实质染色清晰，定位准确，间质未见着色。箭头所指处为乳腺癌细胞的细胞核，染为深棕色，与已有的文献报道HDGF主要定位在细胞核的结论相符，而且没有背景干扰(见附图4)。

实施例6双抗体夹心ELISA检测HDGF蛋白方法的建立

1.双抗体夹心ELISA法的操作流程：

1)用抗HDGF mAb(5μg/ml)100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。

2)用含有0.5％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次后，加入200μl/孔封闭液(1％小牛血清白蛋白，BSA)，4℃过夜。

3)加入1％BSA稀释的His-HDGF蛋白100μl/孔，以1％BSA为空白对照，4℃过夜。

4)PBST洗涤3次后，加入用封闭液稀释的抗HDGF兔血清(1∶1000)50μl/孔，室温作用90min。

5)PBST洗涤3次后，加入用封闭液1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG(Sigma)100μl/孔，室温作用90min。

6)PBST洗涤4次后，加入底物pNPP(KPL)50μl/孔，室温显色30min，酶标仪检测405nm的OD值。

2.双抗体夹心ELISA检测方法最适条件的确定

双抗体夹心ELISA采用抗HDGF单抗(2F12)为捕获抗体，抗HDGF多抗(兔血清)为检测抗体。酶标抗体为碱性磷酸酶标记的抗兔IgG。采用正交设计和方阵试验相结合，确定夹心ELISA的最佳反应条件。捕获抗体2F12设2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml三个浓度，抗HDGF兔血清和酶标抗体分别设1∶1000、1∶2000、1∶5000三个稀释度。His-HDGF设1μg/ml、0.1μg/ml和0.05μg/ml三个浓度。结果表明用5μg/ml 2F12包板，抗HDGF兔血清为1∶1000，碱性磷酸酶标记的抗兔IgG为1∶2000效果最佳。

3.标准曲线制备和灵敏度确定及正常人血清中HDGF含量的测定

1)用抗HDGF mAb(5μg/ml)100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜。

2)PBST洗涤3次后，加入1％BSA250μl/孔封闭，4℃过夜。

3)用1％BSA倍比稀释His-HDGF，自32ng/ml开始直至稀释到0.5ng/ml。将稀释好的蛋白按100μl/孔加入到ELISA板中，取46份正常人血清用1％BSA进行5倍稀释。以1％BSA为空白对照，按100μl/孔将稀释好的蛋白标准品和血清样本分别加入ELISA板中，每个样本做2个复孔，室温作用90min。

4)PBST洗涤3次后，按100μl/孔加入1∶1000稀释的抗HDGF兔血清，室温作用90min。

5)PBST洗涤3次后，加入1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG，室温作用90min。

6)PBST洗涤4次后，加底物室温显色30min，测定A405值。

7)以His-HDGF蛋白标准品浓度为横坐标，以A405值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线在32ng/ml～0.5ng/ml之间线性关系良好，相关系数R²＝0.992，检测的灵敏度为2ng/ml。

8)通过测得的蛋白标准品的吸光度与蛋白浓度制备标准曲线，应用该标准曲线计算血清中HDGF的含量。

4、结果与结论：

标准曲线在32ng/ml～0.5ng/ml之间线性关系良好，相关系数R²＝0.992，最低检测限为0.5ng/ml。测得的46份正常人血清中HDGF的含量为4.665±2.319ng/ml。

我们采用基于抗HDGF单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA，说明该方法的灵敏度较高。通过对46份正常人血清样本的测定，证实了该方法用于临床病人血清HDGF的检测是切实可行的。

序列表

<110>曹伯良(Brian B.Cao)张爱霞南京医科大学

<120>抗肝癌源性生长因子单克隆抗体及其应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>360

<212>DNA

<213>小鼠(Mouse)

<400>1

GAGGTGAAGT TGGTGGAGTC TGGCCCTGGG ATATTGCAGC CCTCCCAGAC CCTCAGTCTG  60

ACTTGTTCTT TCTCTGGGTT TTCACTGAAC ACTTCTGGTG TGGGTGTAGG CTGGATTCGT  120

CAGCCATCAG GGAAGGGTCT GGAGTGGCTG GCACACATTT GGTGGGATGA TGTCAAGCGC  180

ATTACCCAG  CCCTGAAGAG CCGACTGACT ATCTCCAAGG ATACCTCCAG CAGCCAGGTA  240

TTCCTCAAGA TCGCCAGTGT GGACACTGCG GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCGAATA  300

GATGACTATG ATTACCCTTT TACTTACTGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA  360

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>小鼠(Mouse)

<400>2

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1               5                    10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser

             20                  25                  30

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

         35                  40                  45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Tyr Pro Ala

    50                  55                  60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Val

65                  70                  75                  80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

                85                  90                  95

Cys Ala Arg Ile Asp Asp Tyr Asp Tyr Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

        115                 120

<210>3

<211>327

<212>DNA

<213>小鼠(Mouse)

<400>3

GATATTGTGA TGACCCAGTC TCCTGCTTCC TTAGCTGTAT CTCTGGGGCA GAGGGCCACC    60

ATCTCATACA GGGCCAGCAA AAGTGTCAGT ACATCTGGCT ATAGTTATAT GCACTGGAAC    120

CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAGACTC CTCATCTATC TTGTATCCAA CCTAGAATCT    180

GGGGTCCCTG CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT    240

CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGCAACCTAT TACTGTCAGC ACATTAGGGA GCTTACACGT    300

TCGGAGGGGG GACCAAACTG GAAATCA                                        327

<210>4

<211>109

<212>PRT

<213>小鼠(Mouse)

<400>4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                    10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

        35                  40                  45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

                85                  90                  95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Asn Trp Lys Ser

            100                 105             109