HLA－B27磁性酶联免疫试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种HLA－B27磁性酶联免疫试剂盒，它主要包括酶稀释液，酶结合物，包被有与HLA－B27抗体共价耦联免疫磁性微珠的微孔板板条。该试剂盒制备方法主要包括(A)共价耦联免疫磁性微珠和HLA－B27抗体；(B)酶结合物的制备；(C)包被微孔板。该HLA－B27磁性酶联免疫试剂盒具有快速、简单、准确、成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明属于医疗器械领域，  具体地是涉及一种HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种结缔组织疾病，在人群中的患病率为0.2％-0.4％，发病年龄大多在30岁以内，占65％。平均病程4-6年。主要症状是腰、骶及下肢关节疼痛。常伴有晨僵、夜间重、活动后轻等特点。与成年人的AS不同，青少年AS在发病初期引起骨骼病变的症状出现较少，可能有24％的儿童主诉四肢关节痛或只有足跟痛，但末梢关节病变表现已很明显。AS主要表现为椎间盘纤维环和纤维环附近结缔组织的骨化、椎间关节和四肢关节滑膜的炎症和增生。晚期患者脊柱僵硬呈板状，活动受限。晚期致残率高。因而早期诊断、治疗具有重要意义。

人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)是白细胞膜上的一种同种抗原，依不同的位点编码，具有重要的生理功能。早在1973年，Brewerton等报道了HLA-B27与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)强相关。在AS患者中，88％-96％的患者具有HLA-B27抗原，而正常对照组中具有B27抗原者仅为4％-8％。相对危险率达90％。

尽管HLA-B27与强直性脊柱炎有很强的相关性，但查出HLA-B27阳性并不能确诊为强直性脊柱炎，HLA-B27是强直性脊柱炎的一个易发病的因素。

HLA-B27检测不能作为血清学阴性脊柱关节病的确诊指标，但在以下几个方面将有助于诊断：

1如果症状和体征提示脊柱关节病变发生的可能性超过50％，那么B27抗原阳性显著增加正确诊断的机会。

2背痛及强直的患者，B27抗原阴性强烈提示患有其他疾病。在不伴有牛皮癣及炎症性小肠病变时，B27抗原阴性可排除AS诊断。

3患有炎症性关节病变的青少年，B27抗原阳性可提示，可能会发生血清学阴性脊柱关节病变。

4预测AS患者家庭成员发生AS的可能性。如果某成员携带有与AS相关的单倍型，尤其是男性，则预示其发病的可能性较大，为20％-30％，不带有该单倍型者，发病的可能性极小，几乎为0。

早期检测HLA-B27抗原的方法是微量淋巴细胞毒试验(microlymphocytotoxicity test，MLCT)。该方法费时费力，现已逐渐被流式(flowcytometry，FC)所取代。但FC价格昂贵，操作复杂。最近，又发展了以PCR为基础的方法，虽然该方法准确性高，但不适合做大样本快速筛查。

酶标免疫磁性抗体分离检测技术(Magnetic Anti-body Immuno Assay MA I A)是一项高灵敏度的酶免技术，其检测灵敏度可达到放射免疫法的水平。它将免疫磁性微珠分离技术引入酶联免疫测定领域。磁性微珠连接的单克隆抗体与相应的标本抗原结合后，在磁力的作用下，特异性结合的抗原与其它物质分离，再通过酶联免疫显色反应，测定其含量。迄今为止，还未有人将该技术应用到HLA-B27抗原检测。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒，该试剂盒建立在磁性免疫分离和酶检测原理上，具有快速、简单、准确性高等优点。

解决上述技术问题的技术内容为：

一种HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒，主要包括酶稀释液，酶结合物，还包括有：

包被有与HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠的微孔板板条。

优选地，所述酶结合物为耦联有抗CD45抗体的HRP，即抗CD45酶结合物。

HLA-B27抗体与抗CD45酶结合物的稀释度为1∶50。

该试剂盒还包括有，HRP耦联HLA-B27抗体分子的阳性对照。

酶稀释液优选为加有1％BSA(小牛血清白蛋白)、0.1％Proclin300的0.01M PBS缓冲液。

本发明所述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒用于检测EDTA-K3(乙二胺四乙酸三钾)作为抗凝剂的全血标本。

本发明的另一需要解决的技术问题是提供上述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法。

一种HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

(A)共价耦联免疫磁性微珠和HLA-B27抗体：PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，  KH₂PO₄ 1.4mmol/L)，pH6.5-7.5洗涤1ml免疫磁性微珠1-5次，加入抗体8-12mg/ml，共1ml，混匀后，加入双功能耦联剂BS³(Bis[sulfosuccinimidyl]suberate)，使其终浓度为0.8-1.2mM，室温孵育20-40min，加入终止液0.7-1.2M Tris缓冲液，pH 6.5.-7.5，室温孵育7-13min，用PBS洗涤2-5次，恢复体积1ml；

(B)酶结合物的制备；

(C)包被微孔板：

将与HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠2-4ul/孔加入到微孔板中。

加入到微孔板中的HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠优选为3ul/孔。

优选地，共价耦联免疫磁性微珠和HLA-B27抗体包括：PBS，pH7.0洗涤1ml免疫磁性微珠3次，加入抗体10mg/ml，共1ml。混匀后，加入双功能耦联剂BS³，使其终浓度为1mM，室温孵育，30min，加入终止液1M Tris缓冲液，pH7.0，室温孵育10min，用PBS洗涤3次，恢复体积1ml。然后加入1％BSA作为稳定剂，0.1％NaN3作为防腐剂。

酶结合物的制备包括：准确称取10mgHRP(辣根过氧化物酶)置于干净容器中，加入0.2mol/L pH为5.6的醋酸盐缓冲液，待酶溶解后，加入0.06mol/LNaIO₄溶液室温反应20分钟；加入0.16mol/L乙二醇-10％氯化钠溶液，于室温下反应20分钟后；将上述酶液装入透析袋中，用0.001mol/LpH为4.0的醋酸盐缓冲液透析过夜；加入2mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液，加入待标记的抗CD45抗体10mg后，4℃搅拌反应2小时。然后加入新配制的NaBH₄溶液(浓度为5mg/ml)，4℃搅拌反应2小时；滴加饱和的(NH4)₂SO₄溶液，4℃搅拌放置30分钟，3500转/分钟离心20分钟，弃上清，将沉淀溶于0.02mol/LpH为7.4的磷酸盐缓冲液；用0.02mol/LpH为7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，取出透析液，加入等体积酶保护液后，再加入等体积甘油，混匀后-20℃保存。

该试剂盒还可以包括酶联免疫试剂盒常用的底物液A、底物液B、终止液、20倍浓缩洗液、阴性对照。

病人全血样本(EDTA-K3抗凝)与HRP标记的抗细胞抗体都加入到含有HLA-B27抗体免疫磁性微珠的微孔板微孔中，若样本中的白细胞上有HLA-B27抗原，经短时孵育，免疫磁性微珠与白细胞结合，此时HRP标记的抗细胞抗体连接到细胞上。洗涤后，免疫磁性微珠、细胞和酶被保留下来；若白细胞上没有B27抗原，通过洗涤，细胞和酶均被清洗掉；之后加入酶底物液显色，450nm读取光密度值。

本发明所述的HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒具有稳定、性能好等优点。

用本发明所述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒进行310份血样检验。同时做流式HLA-B27试剂用于对照。

表1与流式对比统计结果

  流式阳性  流式阴性  阳性    35    8    43  阴性    2    265    267    37    273    310

以流式方法作为金标准，本发明HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的灵敏度为35/37＝94.6％，特异性为265/273＝97.1％，准确性为(35+265)/310＝96.8％，说明该试剂盒与流式的结果符合很好。

酶结合物稳定性试验：

实验方法

将分装好的酶结合物和稀释液于37℃生化培养箱放置七天，取出平衡室温后与保存在4℃的酶结合物和稀释液同时实验。

实验结果

表2抗体-酶结合物37℃与4℃存放七天后的对比

由表2可知，抗CD45酶结合物置37℃生化培养箱存放七天后，除OD值稍有所降低外，对其他指标并无影响，其稳定性良好，完全可用于HLA-B27磁性酶免疫分析。

本发明所述的制备方法得到的HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法还具有快速、简单、准确、成本低等优点。

具体实施方式

一种HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒，包括1％BSA、0.1％Proclin300的0.01M PBS的酶稀释液，抗CD45酶结合物，包被有与HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠的微孔板板条，HRP耦联HLA-B27抗体分子的阳性对照、使用时配备有酶联免疫试剂盒常用的底物液A、底物液B、终止液、20倍浓缩洗液，0.2MPBS的阴性对照，其中，使用时，HLA-B27抗体与CD45酶结合物的稀释度为1∶50。

上述HLA-B27磁性酶联免疫试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

(A)共价耦联免疫磁性微珠和HLA-B27抗体：

PBS，pH7.0洗涤1ml免疫磁性微珠3次，加入抗体10mg/ml，共1ml，混匀后，加入双功能耦联剂BS³(Bis[sulfosuccinimidyl]suberate)，使其终浓度为1mM，室温孵育30min，加入终止液1M Tris缓冲液，Ph7，室温孵育10min，用PBS洗涤3次，恢复体积1ml。然后加入1％BSA(小牛血清白蛋白)作为稳定剂，0.1％NaN₃作为防腐剂。

(B)酶结合物的制备：

准确称取10mgHRP(辣根过氧化物酶)置于一干净容器中，加入0.2mol/L pH为5.6的醋酸盐缓冲液1ml，待HRP溶解后，加入0.06mol/LNaIO₄溶液1ml，室温反应20分钟；加入0.16mol/L乙二醇-10％氯化钠溶液1ml，于室温下反应20分钟后；将上述酶液装入透析袋中，用0.001mol/LpH为4.0的醋酸盐缓冲液透析过夜；加入2mol/L pH为9.6的碳酸盐缓冲液，加入待标记的抗CD45抗体10mg后，4℃搅拌反应2小时。然后加入新配制的NaBH₄溶液(浓度为5mg/ml)2ml，4℃搅拌反应2小时；滴加饱和的(NH4)₂SO₄溶液5ml，4℃搅拌放置30分钟，3500转/分钟离心20分钟，弃上清，将沉淀溶于0.02mol/LpH为7.4的磷酸盐缓冲液5ml；用0.02 mol/LpH为7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，取出透析液，加入等体积酶保护液后，再加入等体积甘油，混匀后-20℃保存。

(C)包被微孔板

按3ul/孔将与HLA-B27抗体共价耦联免疫磁性微珠加入到微孔板中，真空封装。

本实施例所用所述底物液A、底物液B、终止液、20倍浓缩洗液购自深圳市安群生物工程有限公司，也可按以下方法制备：

底物液A的制备：

在混合容器中加入生产总量0.2MPBS 5％；

混合容器中按5g/1000ml加入H₂O₂.搅拌至完全均匀.

加纯水至生产总体积，搅拌均匀；分装。

底物液B的制备：

在混合容器中加入生产总量0.2MPBS 5％；

混合容器中按3g/1000ml加入TMB.搅拌至完全均匀。

加纯水至生产总体积，搅拌均匀；分装。

20倍浓缩液的制备：

在混合容器中加入生产总量0.2MPBS 85％；

混合容器中按0.5ml/1000ml加入吐温20，搅拌至完全均匀。

加0.2MPBS至生产总体积，搅拌均匀；分装

终止液的制备：

在混合容器中加入生产总量纯水60％；

混合容器中按125ml加入浓硫酸.搅拌均匀；

加纯水至生产总体积，搅拌均匀；分装。

因为人细胞很难保存，所以将HLA-B27分子耦联上HRP，作为本发明试剂盒的阳性对照，其耦联方法与抗白细胞抗体(抗CD45抗体)耦联HRP相同。

以上所有试剂都应于4℃避光贮藏。

经过多次实验的反复对比测定抗凝剂的影响，在多种抗凝剂(例如柠檬酸钠，肝素以及EDTA-K3)中，选择使用EDTA-K3作为本发明所述试剂盒的测定的血样的抗凝剂。

使用时，可以按以下步骤操作：

1.取出所有试剂和血样，平衡至室温；

2.病人样本编号，将病人样本、阳性对照、阴性对照安排到微孔中；

3.取出所需微孔板条，其余放回密封袋中封好，放入冰箱；

4.用酶稀释液将HRP标记的抗细胞抗体50倍稀释；

酶稀释液50uL X(样本数+2，阴、阳性对照)HRP标记的抗细胞抗体1uL X(样本数+2，阴、阳性对照)

5.充分混匀后，加50ul于每一微孔中，轻拍板架，使免疫磁性微珠分散；

6.将抗凝管(EDTA-K3)颠倒混匀数次，按记录单中的安排每孔加入50ul血样。用移液器吹打5-6次，使免疫磁性微珠和全血样本充分混匀；各加50uL阳性、阴性对照到相应微孔中；免疫磁性微珠和全血样本必须混和均匀；

7于室温下反应10分钟，期间轻拍框架边缘数次，使试剂与样本维持均匀混合；

8反应时制备洗液，底物液。洗液按每孔1500ul，用去离子水20倍稀释；

9每孔加入250ul洗液。利用加入时的冲击力使免疫磁性微珠分散，如发现有聚团，用移液器吹散。将板架放于磁板上，2分钟；

10用八道移液器在远离磁体的微孔侧壁吸弃上清，留下约10uL，不要吸干，取下并轻拍板架，使免疫磁性微珠分散；

11重复9、10步骤共5-6次；

12每孔加入底物A液、B液的混合液100ul，室温，避光，15分钟，观察结果；

13如需测量OD值，每孔加入50ul终止液；

14将板架放于磁板上，使免疫磁性微珠吸于板条侧壁；

15轻轻取下板架，在波长450nm下，读取吸光度值(OD)。