缺磷特异诱导在根中表达的启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种缺磷特异诱导在根中表达的启动子及其应用。该启动子，是如下1)或2)的DNA分子：1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在严格条件下与序列表中序列1的DNA分子杂交且能在缺磷条件下驱动目的基因在根中特异表达的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能在缺磷条件下驱动目的基因在根中特异表达的DNA分子。本发明的启动子可以在构建有经济价值的载体中应用，利用构建的载体可培育有经济价值的转基因植物。

说明书

技术领域

本发明涉及缺磷特异诱导在根中表达的启动子及其应用。

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。诱导型启动子的特征，为该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。例如：激素诱导启动子、化学诱导启动子、光诱导启动子等。组成型启动子的特点是，受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如：玉米Ubiqultin启动子和水稻的Actinl启动子。器官或组织特异性启动子的特征，是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子。

磷是植物生长所必需的大量营养元素之一，它不仅是植物细胞中ATP，核苷酸和磷脂的重要组成成份，而且在能量转移、蛋白激活和碳氮代谢中起着非常重要的调节作用。土壤中绝对磷含量通常很高(＞1000μM)，但磷在土壤中极易以有机和无机形式固定，因而有效磷的浓度非常低，大约在2-10μM，扩散到根表面的磷更低，很难满足植物生长发育的需要。

发明内容

本发明的目的是提供缺磷特异诱导在根中表达的启动子及其应用。

本发明所提供的启动子，来源于小麦，命名为TaPHT1.2，是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

2)在严格条件下与序列表中序列1的DNA分子杂交且能在缺磷条件下驱动目的基因在根中特异表达的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能在缺磷条件下驱动目的基因在根中特异表达的DNA分子。

所述步骤3)中的启动子，与1)的启动子最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的序列1由1305个脱氧核苷酸组成。

本发明的TaPHT1.2启动子可用于构建基因工程载体，可先构建含有TaPHT1.2启动子的表达盒，再将所述表达盒插入到出发载体的多克隆位点；也可直接将TaPHT1.2启动子插入到出发载体的多克隆位点，再向此载体中插入目的基因。

其中，所述表达盒自上游至下游依次为所述的DNA分子、外源基因和转录终止子；所述的DNA分子的方向与外源基因的转录方向相同。

含有TaPHT1.2启动子的转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增本发明基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明从小麦中克隆了一个受缺磷特异诱导在小麦根中特异表达的启动子，并证明了所述启动子的功能。实验结果表明，本发明的TaPHT1.2启动子能驱动目的基因在小麦的根系中表达，主要在根毛细胞和表层细胞中表达。本发明的TaPHT1.2启动子在缺磷条件下可诱导目的基因的表达，可用于驱动报告基因以指示和诊断农作物植株体内的磷素营养状况，或者用于驱动基因在根毛和根系表层细胞中特异表达。本发明的TaPHT1.2启动子可为培育磷高效农作物新品种提供理论依据和基因资源。

附图说明

图1为pBI121-TaPHT1.2-GUS载体示意图

图2为加减磷处理后的GUS染色结果

图3为TaHT1.2启动子驱动GFP缺磷根系成熟区的表层细胞和根毛细胞中表达

图4为TaHT1.2启动子驱动的GUS受缺磷诱导表达

图5为缺磷同时缺其它营养元素对GUS的活性影响

具体实施方式

实施例1、小麦磷酸根转运蛋白基因TaPHT1.2启动子序列的分离

提取小麦品种小偃54基因组DNA，采用Clontech公司的Universal Kit，将小麦基因组DNA用四个平末端Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I完全酶切，然后用T₄DNA Ligase在酶切的片段两端加上接头(Adaptor)，根据接头上的序列设计5′的两个引物，根据已知的TaPHT1.2基因序列设计3′端的两个nested-PCR引物：

接头序列如下：

5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3′

3′-H2N-CCCGACCA-PO4-5′

5′端引物序列如下：

接头引物1：5′-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3′；

接头引物2：5′-ACT ATA GGG CAC GCG TGG T-3′。

3′端引物序列如下：(基因特异引物)

基因特异引物GSP1：5′-GCCAGAAGCGGAAGAAACATAGCGTCC-3′；

和GSP2：5′-GAGCAGAGGACCATGAGGATGAGCGTGA-3′。

PCR反应选用上海生工公司的Pfu高保真酶，第一次PCR反应体系为：超纯水40.5μl、10×PCR buffer 5μl；加上接头的基因组片段1μl(200ng/μl)；接头引物1(10μM)1μl；基因特异引物GSP1(10μM)1μl；Pfu酶(5u/μl)0.5μl、dNTPs(10mM)1μl。反应条件为：先94℃4分钟；然后94℃25秒、72℃4分钟，7个循环；再94℃25秒、67℃4分钟，32个循环；最后67℃4分钟。然后将PCR产物稀释50倍后取1μl作为第二次PCR的模板，扩增引物分别为接头引物2和基因特异引物2，PCR反应体系其它组分与第一次PCR相同。第二次PCR的反应条件为：先94℃4分钟；然后94℃25秒、72℃4分钟，5个循环；再94℃ 25秒、67℃4分钟，20个循环；最后67℃4分钟。

扩增产物用QIAquick胶回收试剂盒按产品说明书进行纯化，然后与PUC18 T载体在16℃下连接8小时，构建重组载体PUC18 T-TaPHT1.2。使用2mm电极杯，2500V将重组载体PUC18 T-TaPHT1.2转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，对质粒进行测序，测序使用AbI PRISM3700 DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)，测序结果表明，扩增到的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，将该片段命名为TaPHT1.2，全长1305bp。

实施例2、小麦磷酸根转运蛋白基因TaPHT1.2启动子功能分析

1)启动子表达特性分析

用内切酶Hind III和BamH I从PUC18 T-TaPHT1.2切下TaPHT1.2启动子片段，并用这两个酶切下载体pBI121的35S启动子部分，将TaPHT1.2启动子插入酶切后的pBI121的Hind III和BamH I位点间，构建pBI121-TaPHT1.2-GUS重组表达载体(图1)，将构建好的pBI121-TaPHT1.2-GUS的重组表达载体转入农杆菌GV3101。

将EGFP(Cat.#4999-100，Clontech，Palo Alto，CA)编码区克隆到pJIT163(Guerineau et al.，Plant Molecular Biology，1992，18：815-818)载体(中国科学院遗传与发育生物学研究所)的35S启动子下游，获得pJIT163-GFP载体。用内切酶Kpn I和Sal I从PUC18 T-TaPHT1.2切下TaPHT1.2启动子片段，并用这两个酶切下载体pJIT163-GFP的35S启动子部分，将TaPHT1.2启动子插入酶切后的pJIT163-GFP的Kpn I和Sal I位点间获得pJIT163-TaPHT1.2-GFP载体。然后用Sac I和XhoI切下pJIT163-TaPHT1.2-GFP载体中的TaPHT1.2-GFP，再连入pBINPLUS(van Engelen FA，Transgenic Research.1995，4：288-290)的SacI和SalI位点之间(SalI和XhoI是同尾酶)构建pBINPLUS-TaPHT1.2-GFP重组表达载体，将构建好的pBINPLUS-TaPHT1.2-GFP的重组表达载体转入农杆菌GV3101。

构建的pBI121-TaPHT1.2-GUS和pBINPLUS-TaPHT1.2-GFP重组表达载体分别通过蘸花浸染法转化拟南芥(哥伦比亚型)，收获拟南芥种子得到了系列转化后代。

拟南芥T1代种子分别在缺磷固体培养基和正常固体培养基中垂直培养9天，对萌发生长9天的拟南芥植株进行GUS染色，检测GUS基因的表达情况。正常固体培养基的无机盐组成如下(mmol/L)：KH₂PO₄，0.2000mmol/L；Ca(NO₃)₂.4H₂O，2.0000mmol/L；FeEDTA，0.1000mmol/L；MgSO₄.7H₂O，0.5000mmol/L；KCl，1.5000mmol/L；CaCl₂，1.5000mmol/L；H₃BO₃，0.0010mmol/L；(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O，0.0001mmol/L；CuSO₄.5H₂O，0.0005mmol/L；ZnSO₄.7H₂O，0.0010mmol/L；MnSO₄.H₂O，0.0010mmol/L。用0.2mmol/L的KCl替换正常培养基的KH₂PO₄即为缺磷固体培养基。正常固体培养基和缺磷固体培养基均含1％的蔗糖和1％的琼脂粉。

拟南芥T1代种子在正常固体培养基中萌发后转入正常水培培养基，在正常水培培养基中培养3周，再转入缺磷水培培养基中生长一周，取上述处理的拟南芥植株进行GUS染色，检测GUS基因的表达。正常水培培养基和正常固体培养基的基本组成相同，差别仅在于正常水培培养基中不含琼脂和蔗糖；缺磷水培培养基和缺磷固体培养基的基本组成相同，差别仅在于缺磷水培培养基中不含琼脂和蔗糖。以在正常水培培养基中培养4周的拟南芥植株作为对照。

固体培养基中的拟南芥植株的GUS染色结果如图3A所示，表明转pB1121-TaPHT1.2-GUS的拟南芥植株在缺磷固体平板培养基中萌发生长9d后经GUS染色，只在缺磷植株的根系检测到GUS基因的表达，而在地上部没有检测到GUS表达；在正常固体培养基中萌发生长9天的拟南芥幼苗没有检测到GUS基因的表达；

水培培养基中的拟南芥植株的GUS染色结果如图3B所示，表明转入缺磷水培培养基中生长一周的转pBI121-TaPHT1.2-GUS的拟南芥植株的根系中GUS基因表达，地上部份没有GUS基因表达，而在正常水培培养基中生长4周的转pBI121-TaPHT1.2-GUS的拟南芥植株无论地上部分还是根部都没有GUS基因的表达。

图3中“+P”代表在正常培养基中生长的转pBI121-TaPHT1.2-GUS的拟南芥，“-P”代表在缺磷培养基中生长的转pBI121-TaPHT1.2-GUS的拟南芥。

GFP检测结果类似GUS基因，缺磷培养基中生长5天的转pBINPLUS-TaPHT1.2-GFP拟南芥可以检测到GFP报告基因的表达，2周以后仍能检测到GFP荧光。

2)TaHT1.2启动子驱动GFP在缺磷根系成熟区的表层细胞和根毛细胞中表达

TaHT1.2启动子驱动GFP报告基因主要在根系表达，并且是在缺磷处理后才表达。荧光显示在根冠、分生区和伸长区没有表达；在成熟区表达，表达的细胞是根毛细胞和表层细胞(根毛细胞和表层细胞是根系从土壤中吸收养分的主要承担者)，结果如图4所示。说明，TaHT1.2启动子驱动GFP的表达部位和它所承担的功能是吻合的。

3)缺磷特异诱导分析

除了缺磷以外，检测了在缺氮、缺铁和缺镁培养基中垂直培养的拟南芥植株中GFP基因的表达。缺氮、缺铁和缺镁培养基的组成分别为去掉氮源、铁盐和镁盐的正常固体培养基。

GFP检测实验结果如图5所示，表明只有在缺磷的条件下，TaHT1.2启动子驱动的GFP才会被诱导表达。另外，温度(低温4℃处理1天)和盐(1％NaCL)等与GFP基因的表达没有直接关系。

4)复合缺素对GUS表达的影响

由于土壤中各种离子之间的相互关系也影响着植物对它们的吸收，以及生产实践中常常复合施肥更能达到增产的目的。在缺磷同时分别缺少氮素、铁素或镁等情况下，检测了GUS基因的表达，缺氮、缺铁和缺镁培养基的组成同3)中。

实验结果如图6所示，表明缺磷同时缺氮则抑制GUS基因的表达，而同时缺少其它营养元素则没有明显的影响，图6中1代表缺磷、2代表缺磷和缺氮、3代表缺磷和缺铁和4代表缺磷和缺镁。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>缺磷特异诱导在根中表达的启动子及其应用

<130>CGGNARW81395

<160>1

<210>1

<211>1305

<212>DNA

<400>1

agtacggcat acggatttca atgctgccct gtctgcttgc tgcgaaatct gcatatgttt    60

agtagtttgt taaaaaaaaa cacacttagt agtttttatt tcatatttca gattaccaat    120

gttctaaacg tatggttgct gcatgctatt ttgttcagaa ccttatctaa attctgaagt    180

tgggaattct cctctgtttc tgtgactact atgttatgca cctaatcctt caagaatatt    240

tcctcatttt ttctgtgtta caatcaataa aaaaatagca cgttatagcg ttctgagcag    300

tcttgctaaa tgaaatcaat gtacaattgt tcgctatagt gtggagatag cgttgcctta    360

gcgcgatata gcttcgctat agctgatttt aagggttgcg ctattatgtc atagcacgct    420

attttttgca ttggttacaa ccaaacaacc ccccctcccc cccttgttcc tacatttcta    480

gaacaatgtg aaccaagcat ggccttttta tgtaacagat gaccaatgtt ctgaacatat    540

agcccttgca tatgtatttt gttcataaac tgtctgaagt atgaaattag attttagcaa    600

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gcatccattt atcgtcgaaa ttctgttttt ttgttgttgc ttctgatttg atgaaatcgg    720

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aggtatattc ccagcataac catgatctgg cttcattatt ttttatttcc acaattctat    960

agtactaaat ttgaaagtca aacctgataa acttaagttt agcattcctt aatccttcta    1020

ataataacag aaatgtagcc cgacatagct gtagctctca aggcaagaca attgactccg    1080

cgtatatttt tgtaagaact atcttgacaa tgtacaatcc gttgttttac aagcgatgcc    1140

gtacatatga tattatatac gtcgttgcaa ctagcacaat atgtaccttc accttgcatt    1200

atttacgcct atataatagt atatatacgt actagaagca tcgaacaaag cacacaacaa    1260

gagagcagca gacgaagttt agttgagaga tcgccggcgg ccatg                    1305