咖啡酰奎宁酸含氮衍生物及其制备方法和其药物组合物及用途

摘要

本发明提供了咖啡酰奎宁酸衍生物及其制备方法，并提供了包含该咖啡酰奎宁酸衍生物的药物组合物，以及咖啡酰奎宁酸衍生物在制备用于治疗或预防病毒疾病药物的应用，尤其在呼吸道合胞病毒及乙肝病毒中的应用，具有安全高效低毒的特性。

说明书

技术领域

本发明涉及咖啡酰奎宁酸衍生物及其制备方法，以及包含该咖啡酰奎宁酸衍生物的其药物组合物，及其在制备用于治疗或预防病毒疾病药物的应用。

背景技术

病毒是一类严重危害人类健康威胁人类生命的病原体，如流行性感冒病毒、艾滋病病毒、SARS病毒、乙肝病毒等，具有高度的传染性。对这些病毒的防治主要是抗病毒疫苗，但由于这些病毒容易发生变异，常规疫苗尚不能有效的预防及阻止其爆发和流行。大多数的病毒对抗生素类化学药不敏感，目前已成为医学界的一大难题。医用外源性干扰素、白细胞介素-2等能抑制病毒复制，提高机体细胞免疫功能，治疗前景良好，但费用昂贵，且大量使用尚有一定不良反应。而中医药临床防治具有独特效果，毒副作用小，药源丰富，价格低廉，能调节整体免疫功能，抑制病毒复制，阻止病毒致细胞病变，改善临床症状，在治疗病毒感染性疾病上应用广泛，显示出了独特的优势。近年来很多人从不同的角度和方向对中药抗病毒做了不同的研究。

咖啡酰奎宁酸类化合物广泛存在中草药、水果、蔬菜等植物中。二咖啡酰奎尼酸(Dicaffeoylquinic acid，DCQA)，也称二咖啡酰奎宁酸，是奎尼酸的二咖啡酸酯。二咖啡酰奎尼酸作为一种药理活性成分，其作用范围较广泛，具有抗病毒(CN1087608；EP1008344；US6331565；US20020111382)，抗氧化(CN1136434；孙燕荣，董俊兴等，军事医学科学院院刊，2002，26(1)：39)、提高免疫功能(CN1136434)、抗肝损伤(CN1476842；孙燕荣，董俊兴等，军事医学科学院院刊，2002，26(1)：39)、抗诱变(Yoshimoto M.，et al.，Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(11)：2336)等作用，在病毒感染、心血管疾病(CN1136434；CN1381236；CN1462620；KR2002085507)等方面有一定疗效，对于乙肝病毒(CN1087608；EP1008344；US6331565)、艾滋病毒(CN1087608；EP1008344；US6331565)、冠状病毒感染(CN1449751)，二咖啡酰奎尼酸也有治疗作用。也有人将其用于化妆品(EP577516；US5445816)。

呼吸道合胞病毒肺炎(respiratory syncytial virus pneumonia)简称合胞病毒肺炎，是一种小儿常见的间质性肺炎，多发生于婴幼儿。由于母传抗体不能预防感染的发生，出生不久的小婴儿即可发病，但新生儿较少见。国外偶有院内感染导致产科医院新生儿病房爆发流行的报道。到目前为止，对RSV感染的研究有一定的进展，但还没有特异有效的治疗和预防方案。目前唯一允许用于化学疗法的药物主要是利巴韦林(ribavirin)，还有金刚烷胺及盐酸阿比朵儿。其它的如单抗：人类单克隆抗体palivizumab(Synagis)和静脉用免疫球蛋白(RSV-IGIV)已经注册使用，疗效虽好，但其治疗一个周期所需的费用很高，不能普遍应用于临床。

发明内容

本发明的目的正是为了提供新型的咖啡酰奎宁酸衍生物及其制备方法，以弥补上述不足。

本发明的另一目的还提供包含治疗有效量的上述化合物或其盐或其水合物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。

另外，本发明再一目的还提供在制备用于治疗或预防病毒疾病的所述化合物或其盐或其水合物的药物中的应用。

根据本发明，下述通式(I)所述的化合物或其盐或其水合物为，

式中：R为NH₂；

或任意单取代或双取代的C₁-C₆的直链或支链的烷胺基；

或任意取代的C₃-C₆的环烷胺基；

或任意取代的C₁-C₆的芳香胺基；

或四氢吡咯基；

或哌啶基；

Q₁，Q₂，Q₃，Q₄为H或如下式(II)所述的基团，且Q₁，Q₂，Q₃，Q₄不同时为H或Q₁，Q₂，Q₃，Q₄不同时为如下式(II)所述的基团。

其中，所述R为氨基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基、异丙氨基、四氢吡咯基、哌啶基、苯胺基、苄胺基、对甲苯胺基、环丙胺基。

通式(I)所述的化合物或其盐或其水合物包括如下化合物：

当R为环丙胺基时，包括式(1-1)、(1-2)、(1-3)、(1-4)、(1-5)及(1-6)等6个化合物。

当R为四氢吡咯基时，包括式(2-1)、(2-2)、(2-3)、(2-4)、(2-5)及(2-6)等6个化合物。

当R为甲氨基(NHCH₃)时，包括式(3-1)、(3-2)、(3-3)、(3-4)、(3-5)、(3-6)及(3-7)等7个化合物。

根据本发明，还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种如上所述的化合物或其盐或其水合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。其中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、植入剂或外用制剂。

通常，本发明的化合物以治疗有效量，通过所接受的起类似效用的药剂给药方式中任何一种给药。适宜的剂量范围通常为每天10mg～1000mg，优选每天200mg。这取决于众多因素，比如，治疗疾病的严重性、对象的年龄及其健康状况、所使用化合物的效力、给药途径和形式、给药针对的症状以及有关医师的喜好和经验。治疗这种疾病的领域中的普通技术人员将能够在不经过多的实验并且依据个人知识和本发明的公开内容的情况下，确定本发明的化合物对于给定疾病的治疗有效量。

可以将本发明的化合物与一种或多种常规的药学上可接受的载体或赋形剂放入药物组合物或单位剂量形式中。药物组合物或单位剂量形式可以包括常规比例的常规成分，含或不含另外的活性化合物或元素，并且单位剂量形式可以含有或将采用的预定每日剂量范围相应的任何适宜有效量的活性成分。药物组合物的采用形式可以是片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、植入剂或外用制剂。

根据本发明，进一步提供了制备如上所述的化合物或其盐或其水合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(1)由式4奎宁酸与R反应生成式3化合物；

(2)再由式3与式II反应生成通式I的化合物

式中：R为NH₂；

或任意单取代或双取代的C₁-C₆的直链或支链的烷胺基；

或任意取代的C₃-C₆的环烷胺基；

或任意取代的C₁-C₆的芳香胺基；

或四氢吡咯基；

或哌啶基；

当R为环丙胺基，四氢吡咯基及甲氨基时，相关化合物的按照如下的合成路线(化学反应式一和化学反应式二)和合成工艺进行：

化学反应式一

化学反应式二

上面，除R为环丙胺基，四氢吡咯基及甲氨基外，当R为其它基团时，例如NH₂、任意单取代或双取代的的C₁-C₆的直链或支链的烷胺基、任意取代的C₃-C₆的环烷胺基、任意取代的C₁-C₆的芳香胺、哌啶基，其相关化合物的合成工艺按照如上所述的方法进行。

将奎宁酸(4)和环己酮在酸(如TSOH，硫酸等)催化下和用甲苯回流分水反应使得奎宁酸的3a，4a-羟基形成缩酮保护，同时1β位的羧基和5β位的羟基形成内酯结构得到化合物(5)。奎宁酸的3a位，4a位羟基除了可以用环己酮形成缩酮保护外，还可以用丙酮形成缩酮的形成加以保护；用有机胺类，如环丙胺、甲胺等对化合物(5)的内酯结构进行开环，从而使得1a位的羧基转化为酰胺结构得到化合物(6)，化合物(7)及化合物(8)等，所用溶剂可为THF、MeOH、EtoAc等，反应温度40～80℃；在酸性条件下，去除化合物(6)、(7)、(8)的3a，4a缩酮保护基，得到化合物(9)、(10)及(11)等，反应温度为室温～60℃；接下来的反应是化合物(9)、(10)及(11)等和O-烯丙基咖啡酰氯的成酯反应，所用溶剂可以为THF、EtOAc、CH₂Cl₂，CHCl₃等，所用碱可以为Et₃N，吡啶，K₂CO₃等，反应温度为-5℃～5℃；可制得化合物(12)～化合物(20)等；最后一步是去烯丙基保护，由于烯丙基醚对一般的酸碱都是很稳定的，因此，不能在这些条件下去除烯丙基保护基。

但用Rh(PPh₃)₃Cl/DABCO/EtOH和Pd(PPh₃)₄/Morpholine/THF等脱烯丙基的条件可以很容易的脱去化合物(12)～(20)等的烯丙基结构得到各目标化合物。

根据本发明，还提供一种在制备用于治疗或预防病毒疾病如上所述的化合物或其盐或其水合物的药物中的应用。其中，所述病毒为呼吸道合胞病毒、艾滋病病毒、乙肝病毒。

本发明的优点与效果：提供咖啡酰奎宁酸的新衍生物，用于治疗或预防病毒疾病，尤其在呼吸道合胞病毒及乙肝病毒，具有安全高效低毒的特性。其中，化合物(2-1)的体外抗呼吸道合胞病毒检测IC50＝1.37μg/ml

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

实施例1、化合物(5)的合成

将化合物(4)奎宁酸(100g)，甲苯(2L)，环己酮(167ml)，TsOH(1g)回流分水反应15h，冷却到室温，过滤，干燥，得类白色固体粉未132g化合物(5)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.348～1.702(m，10H)，1.848(dd，J＝3.2，17.6，1H)，2.173(m，2H)，2.326(d，J＝9，1H)，3.28(s，1H)，4.234(d，J＝6.4，1H)，4.433(m，1H)，4.475(q，1H)，6.013(s，1H)；[M+1]⁺：255。

实施例2、化合物(6)的合成

上述化合物(5)(5g)、环丙胺(6ml)及DME(75ml)回流反应5.5h，蒸去溶剂。用柱层析分离，洗脱剂为氯仿和甲醇，蒸去溶剂，干燥，得类白色固体粉末4.7g化合物(6)。[M+1]⁺：312

实施例3、化合物(7)的合成

化合物(5)(5g)，四氢吡咯(2ml)，THF(50ml)回流反应6.5h，蒸去溶剂，用柱层析分离纯化，洗脱剂为乙酸乙酯和丙酮，蒸去溶剂，干燥，得淡黄色固体5.3g化合物(7)。[M+1]⁺：326。

实施例4、化合物(8)的合成

将化合物(5)溶于THF(100ml)中，在回流温度下，通甲胺气体4h，蒸去溶剂，得油状物(9.4g)化合物(8)。此油状物可以直接进行接下的反应。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.335(d，J＝4.8，2H)，1.442～1.760(m，10H)，2.011(dd，J＝19.2，5.2，1H)，2.595(d，J＝4.4，3H)，3.762(m，2H)，4.301(m，1H)，4.937(dd，J＝15.2，3.8，1h)，5.152(s，1H)，7.705(q，J＝13.6，4.4，1H)；[M+1]：286。

实施例5、化合物(9)的合成

将化合物(6)(3g)、甲醇(30ml)及1M HCl(10ml)室温搅拌反应2h，减压蒸去溶剂，用异丙醇重结晶，干燥，得淡黄色固体1.48g化合物(9)。[M+1]⁺：232。

实施例6、化合物(10)的合成

将化合物(7)(3g)，甲醇(30ml)及1M HCl(10ml)室温搅拌，减压蒸去溶剂，用柱层析纯化，洗脱剂为CHCl₃和NaOH，得白色固体2g化合物(10)。[M+1]⁺：246。

实施例7、化合物(11)的合成

将化合物(8)(8.5g)、甲醇(85ml)、1M HCl(25ml)室温搅拌4h，蒸去溶剂，用乙醇重结晶，过滤、干燥、得白色粒状固体5.5g化合物(11)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.681(m，4H)，2.594(d，J＝5.2，3H)，3.228(t，J＝8.1H)，3.727(m，1H)，3.953(s，1H)，4.608(d，J＝4.4，1H)，4.837(d，J＝5.2，1H)，5.109(d，J＝3.2，1H)，5.419(s，1H)，7.727(d，J＝4.4，1H)；[M+1]⁺：206。

实施例8、化合物(1-1)的合成

将化合物(9)(2.53g)、吡啶(35ml)和CH₂Cl₂(48ml)加入三口瓶中液中。在氩气保住下，并将温度控制在0～5℃，滴加O-二烯丙基咖啡酰氯(由7.4g咖啡酸制得，制法参考文献Can.J.Chem，75，1997，1783-94)的CH₂Cl₂(52ml)溶液，滴加后再反应20min，用1mHCl水溶液调pH至3～4。再用饱和NaCl水溶液将CH₂Cl₂层洗至中性，无水MgSO₄干燥。过滤，蒸去溶剂，得油状物，此油状物用柱层析纯化，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚。蒸去溶剂，得油状物1.17g

将此油状物用THF(82ml)溶解，加吗啉(5.7ml)及催化量的Pd(PPh₃)₄，回流下反应1h，将反应液冷却到室温。将反应液用含1MHCl的饱和NaCl溶液洗pH3～4。再用饱和NaCl将THF层洗至中性，无水MgSO₄干燥、过滤，将THF蒸去，得油状物，用柱层析纯化，洗脱剂为氯仿、甲醇及甲酸，将溶剂蒸去，干燥，得淡黄色固体粉末0.38g化合物(1-1)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.158(t，J＝14.4，1H)，1.690～2.055(m，7H)，2.246～2.330(m，1H)，3.309(d，J＝6.8，2H)，3.710(d，J＝6，2H)，4.075(m，2H)，4.831(dd，J＝10.8，2.8，1H)，5.323(q，1H)，6.178(dd，J＝20.8，5.2，2H)，6.715(t，J＝16.8，2H)，6.883(q，2H)，7.013(s，2H)，7.394(dd，J＝21.6，4.8，2H)；[m+1]⁺：556。

实施例9、化合物(14)、(17)、(20)的合成

将化合物(11)溶于吡啶(6ml)及二氯甲烷(10ml)，温度控制在0～5℃滴加O-二烯丙基咖啡酰氯的CH₂Cl₂(10ml)溶液，滴加完毕后反应20min，加1mlHCl中止。CH₂Cl₂用1mlHCl洗至pH为4，再用饱和NaCl洗至pH为7，无水MgSO₄干燥过滤，浓缩，得油状物，用柱层析纯化。洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚。共收集3个组分。

化合物(14)：0.2g，¹H-NMR(d-DMSO)：1.159(m，1H)，1.841(d，J＝13.6，1H)，2.022(m，3H)，2.584(d，J＝4.4，3H)，4.333(s，1H)，4.407(m，9H)，4.966(dd，J＝12，2，1H)，5.213(t，J＝19.6，4H)，5.369(d，J＝17.6，4H)，5.601(s，2H)，5.890(d，J＝5.2，1H)，5.983(m，4H)，6.484(t，J＝25.5，2H)，6.946(t，J＝14，2H)，7.153(d，J＝8，2H)，7.320(s，2H)，7.519(t，J＝31.6，2H)，7.790(d，J＝12，1H)；[M+1]⁺：690，[M+Na]⁺：712。

化合物(17)：0.1g，¹H-NMR(d-DMSO)，1158(m，1H)，1.891(m，3H)，2.144(d，J＝11.6，1H)，2.631(d，J＝4.4，3H)，4.196(m，2H)，4.567(m，8H)，4.865(dd，J＝11.6，3.2，1H)，5.255(t，J＝4.4，4H)，5.354(m，6H)，5.970(m，4H)，6.462(d，J＝16，2H)，6.950(q，2H)，7.162(q，2H)，7.311(t，J＝4.4，2H)，7.528(dd，J＝19.6，3.6，2H)，7.912(d，J＝4.8，2H)；[M+1]+：690，[M+Na]⁺：712。

化合物(20)：50mg，¹H-NMR(d-DMSO)：1.764(q，1H)，1.870(q，3H)，2.619(d，J＝4，3H)，4.022(q，1H)，4.154(s，1H)，4.615(m，6H)，5.255(d，J＝11.4，2h)，5.395(d，J＝17.6，2H)，6.005(m，1H)，6.518(d，J＝16，1H)，7.007(d，J＝8.4，1H)，7.233(d，J＝8，1H)，7.357(s，1H)，7.591(d，J＝16.1H)，7.809(d，J＝4.8，1H)；[M+1]⁺：447。

实施例10、化合物(3-1)的合成

将化合物(14)(9.3g)，THF(150ml)，吗啉(45ml)及催化量的Pd(pph₃)₄在氩气保护下回流1h，冷却到室温。用1mHCl的饱和NaCl溶液洗THF层，直到pH值3～4，再用饱和NaCl洗THF层至中性；无水MgSO₄干燥，过滤，蒸去溶剂，得油状物。此油状物用柱层析纯化，洗脱剂为CH₃Cl、甲醇及甲酸。蒸去溶剂，干燥，得泡沫状固体粉末化合物(3-1)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.162～1.242(m，1H)，1.1846～2.131(m，5H)，2.629(d，J＝4，3H)，4.015(q，1H)，4.330(s，1H)，4.959(d，J＝9.2，1H)，5.383～5.634(m，1H)，6.161(t，J＝14.4，29.2，2H)，6.731(q，3H)，7.060(t，J＝34.4，2H)，7.809(d，J＝4.8，1H)；[m+1]⁺：530

实施例11、化合物(3-4)的合成

将化合物(17)(1.34g)，THF(21ml)，吗啉(7ml)及催化量的Pd(pph₃)₄在氩气保护下回流1h，冷却到室温。用1mHCl的饱和NaCl溶液洗THF层，直到pH值3～4，再用饱和NaCl洗THF层至中性；无水MgSO₄干燥，过滤，蒸去溶剂，得油状物。此油状物用柱层析纯化，洗脱剂为CH₃Cl、甲醇及甲酸。蒸去溶剂，干燥，得泡沫状固体粉末化合物(3-4)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.756～1.967(m，4H)，2.621(d，J＝4.4，3H)，3.276(d3，6H)，4.141～4.199(m，1H)，4.816(dJ＝12，1H)，5.346～5.468(m，3H)，6.178(dd，J＝22，6.4，2H)，6.628～6.785(m，2H)，6.925(t，J＝15.6，2H)，7.020(s，2H)，7.879(d，J＝4.8，1H)；[m+1]⁺：530

实施例12、化合物(3-5)的合成

将化合物(20)(0.5g)，THF(56ml)，吗啉(2ml)及催化量的Pd(pph₃)₄回流0.5h，冷却到室温。用1mHCl的饱和NaCl溶液洗THF层，直到pH值3～4，再用饱和NaCl洗至中性；无水MgSO₄干燥，过滤，将溶液蒸去，得油状物。用柱层析纯化，洗脱剂为CH₃Cl、甲醇及甲酸。得淡黄色固体粉末化合物(3-5)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.785～1.983(m，4H)，.69(d，J＝4，3H)，4.066(q，1H)，4.177(s，1H)，4.626(t，J＝9.6，1H)，6.317(d，J＝16，1H)，6.807(d，J＝4，1H)，7.005(d，J＝8，1H)，7.088(s，1H)，7.521(d，J＝8，1H)，7.879(d，J＝4.4，1H)，8.216(s，1H)；[M+1]⁺：367

实施例13、化合物(1-3)的合成

将化合物(6)(0.4g)，DMAP(0.1g)，用CH₂Cl₂(10ml)溶解，加吡啶(6ml)，室温下滴加O-二烯丙基溴咖啡酰氯的CH₂Cl₂(16ml)溶液，滴加定后再反应1h，用2M HCl将pH调到3左右，室温再搅拌2h，滤去不溶物，分液，CH₂Cl₂层用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水MgSO₄干燥、过滤，蒸去CH₂Cl₂得油状物，此油状物用柱层析纯化，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚，得固体0.56g化合物(1-3)。[M+1]⁺：529。

实施例14、化合物(3-7)的合成

将化合物(11)溶于吡啶(6ml)及二氯甲烷(10ml)，温度控制在0～5℃滴加O-二烯丙基咖啡酰氯的CH₂Cl₂(10ml)溶液，滴加完毕后反应20min，加1mlHCl中止。CH₂Cl₂用1mlHCl洗至pH为4，再用饱和NaCl洗至pH为7，无水MgSO₄干燥过滤，浓缩，得油状物，用柱层析纯化。洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚。

将上述化合物(9.3g)，THF(150ml)，吗啉(45ml)及催化量的Pd(pph₃)₄在氩气保护下回流1h，冷却到室温。用1mHCl的饱和NaCl溶液洗THF层，直到pH值3～4，再用饱和NaCl洗THF层至中性；无水MgSO₄干燥，过滤，蒸去溶剂，得油状物。此油状物用柱层析纯化，洗脱剂为CH₃Cl、甲醇及甲酸。蒸去溶剂，干燥，得泡沫状固体粉末化合物(3-7)。

¹H-NMR(d-DMSO)：1.959(d，1H，J＝12)，2.089(t，2H，J＝10)，2.310(m，1H)，2.673(s，3H)，5.151(m，1H)，5.515(m，2H)，5.635(m，1H)，6.101(m，2H)，6.302(d，1H，J＝4)，6.666(m，9H)，7.377(m，3H)，7.822(d，1H，J＝5.2)，7.846(s，1H)，8.220(s，1H)，9.411(s，6H)；[M+1]⁺：706.

实施例15、对体外抗呼吸道合孢病毒(RSV)抑制作用

对以上制备得到的部分化合物进行了体外抗呼吸道合孢病毒(RSV)实验，以Hep-2细胞(人喉癌细胞)为病毒宿主，测定样品抑制呼吸道合孢病毒(RSV)引起Hep-2细胞病变程度，72小时观察细胞病变程度，用Reed-Muench法分别计算样品对呼吸道合孢病毒(RSV)的半数抑制浓度(IC₅₀)以及样品对Hep-2细胞的最大无毒浓度(TC₀)和半数有毒浓度(TC₅₀)。

测试材料和方法：

病毒株：RSV，Long株

样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，用培养液作3倍稀释，共8个稀释度。

阳性对照药：利巴韦林(RBV)

测试方法：Hep-2细胞种96孔培养孔，24小时后分别感染呼吸道合孢病毒(RSV)(200TCID50感染量)吸附4小时，弃病毒液，按以上稀释度加入样品，同时设阳性药细胞对照孔，正常细胞对照孔和病毒对照孔，72小时观察细胞病变程度(CPE)，用Reed-Muench法分别计算样品对呼吸道合孢病毒(RSV)半数抑制浓度(IC₅₀)以及样品对Hep-2细胞的最大无毒浓度(TC₀)和半数有毒浓度(TC₅₀)。

具体数据见表1。

表1：体外抗呼吸道合孢病毒(RSV)抑制作用

  样品  TC₅₀  (μg/ml)  TC₀  (μg/ml)  IC₅₀  (μg/ml)  1-1  111.11  37.04  ＞111.11  1-3  12.35  4.12  ＞12.35  2-1  111.11  37.04  1.37  2-3  12.35  4.12  ＞12.35  3-1  64.15  37.04  16.25  3-3  111.11  37.04  ＞111.11  3-4  37.04  12.35  7.13  3-5  37.04  12.35  7.13  3-7  64.15  37.04  ＞64.15  RBV  333.33  111.11  1.37

注：RBV为对照品，利巴韦林

实施例16、对体外抗HIV-1IIIB/H9病毒抑制作用

对以上制备得到的部分化合物进行了体外抗HIV-1IIIB/H9实验，用MT-4细胞培养，采用CPE法测定对细胞的毒性，采用测定细胞培养上清P24抗原方法测定化合物对HIV-1IIIB的抑制作用，分别得到样品的半数抑制浓度(IC₅₀)以及样品的半数有毒浓度(TC₅₀)。

测试材料和方法：

病毒株：HIV-1IIIB病毒株

细胞：T淋巴细胞MT-4

样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，细胞培养液配制。

阳性对照药：齐多夫定(AZT)

HIV-1P24抗原检测试剂盒：用荷兰BioMerieux公司产品。

测试方法：用CPE法测定药物对细胞的毒性(TC₅₀和TC₀)，将2×10⁵细胞/ml 100ul接种于96孔细胞培养板内，同时分别加3倍稀释的样品或阳性药齐多夫定的8个浓度的药液100ul，每个稀释度重复3孔，设细胞对照组。置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养，加药后第4天(96小时)观察细胞CPE，记录细胞病变情况，计算TC₅₀和T_C0。

用ELISA方法测定HIV-1P24抗原，MT-4细胞计数后以100TCID50病毒量感染细胞，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内吸附1.5小时。以2×10⁵/ml浓度接种96孔培养板，100ul/孔。加入稀释药物100ul/孔。37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养4天(96小时)。取细胞上清液，进行1：3000稀释。按HIV-1P24抗原试剂盒提供的操作步骤测定HIV-1P24滴度，加药组与病毒对照组比较，计算样品的半数有效浓度(IC₅₀)。

具体数据见表2。

表2：体外抗HIV-1IIIB/H9病毒抑制作用

  样品  TC₅₀  (μg/ml)  IC₅₀  (μg/ml)  2-1  32.08  1.18  3-1  32.08  1.83  3-4  32.08  0.93  3-7  32.08  1.02  AZT  20.00  0.0042

注：AZT为对照品，齐多夫定

实施例17、对体外抗乙型肝炎病毒(HBV)DNA病毒抑制作用

对以上制备得到的部分化合物进行了体外抗乙型肝炎病毒(HBV)DNA实验，在乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系中，研究对细胞毒性和对HBV DNA分泌的抑制效果。分别得到样品的半数抑制浓度(IC₅₀)以及样品的半数有毒浓度(TC₅₀)，在2.2.15细胞培养内对HBV DNA的抑制率。

测试材料和方法：

病毒株：乙肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系。

样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，4℃保存，使用时用2.2.15细胞培养液配成所需浓度。

阳性对照药：拉米夫定(3TC)

测试方法：样品配成20mg/ml母液，用2.2.15细胞培养液配成所需的浓度，然后用培养液从200ug/ml开始5倍稀释共8个浓度，加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照组，以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制率。按用Reed-Muench法分别计算半数有毒浓度(IC₅₀)，最大无毒浓度(TC₀)。各浓度组药液的及细胞对照组的2.2.15细胞按分子克隆实验技术方法提取HBV DNA、各样品斑点杂交、放射自显影、测量各杂交点的IOD值或OD值后，计算抑制率。

具体数据见表3。

表3：体外抗乙型肝炎病毒(HBV)DNA病毒抑制作用

注：3TC为对照品，拉米夫定。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由所附权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。