改良的嵌合毒素受体蛋白和用于治疗和预防炭疽的嵌合毒素受体蛋白

摘要

描述了具有与免疫球蛋白复合物联合的毒素受体的嵌合毒素受体蛋白，所述免疫球蛋白复合物具有至少部分免疫球蛋白重链和至少部分免疫球蛋白轻链。所述嵌合毒素受体蛋白与缺乏轻链的嵌合毒素受体蛋白相比，具有改善的稳定性。还描述了具有增高的稳定性的炭疽和肉毒杆菌嵌合毒素受体蛋白。

说明书

与相关申请的相互参考

本申请要求2005年8月2日提交的美国临时申请号60/704,829的权 利，据此将前述内容引入作为参考。

将这些申请中的每一个的完整内容，包括所有的图像、附图和序列列 表，引入本文作为参考。

关于联邦资助的研究或开发的陈述

联邦研究支持以联邦研究基金1R43AI053005-01 A1的形式提供。

发明领域

本发明涉及嵌合毒素受体蛋白，免疫黏附素，它们来自植物的产物， 和它们在治疗和预防毒性和病原体介导的疾病中的应用。

发明背景

起到毒素和病原体成分的诱杀剂作用的可溶性受体和结合蛋白是有 前途的治疗和预防毒性和其他病原体介导的作用的工具，所述毒素和病原 体成分介导感染和发病机理。

可用受体诱杀剂治疗的病症的一个实例是炭疽感染。已经识别了两种 PA(保护性抗原，即炭疽毒素的成分)的细胞表面受体：肿瘤内皮标记8 (TEM8)和毛细管形态发生蛋白2(CMG2)(30，31)。已显示这两种蛋 白质的细胞外结构域的可溶性形式抑制表达内源性毒素受体的细胞的中 毒。80nM的TEM8可溶性形式抑制50％的致命毒素作用(IC50＝80nM) (Bradley，K.A.，Mogridge，J.，Mourez，M.，Collier，R.J.& Young，J.A.炭疽 毒素细胞受体的识别(Identification of the cellular receptor for anthrax toxin). 自然(Nature)414，225-9(2001))。CMG2来源的蛋白质对170pM的 PA具有亲和性，并且在巨噬细胞保护测定中具有3.0nM(67ng/ml)的 IC50，这使其成为潜在地强有力的炭疽毒素作用抑制剂(Scobie，H.M.， Rainey，G.J.，Bradley，K.A.& Young，J.A.人毛细管形态发生蛋白2起到炭 疽毒素受体的作用(Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor).美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci U S A)100，5170-4(2003)；Wigelsworth，D.J.，Krantz，B.A.，Christensen，K.A.， Lacy，D.B.，Juris，S.J.& Collier，R.J.人类炭疽毒素受体，即CMG2和保护 性抗原相互作用的结合化学计量法和动力学(Binding stoichiometry and kinetics of the interaction of a human anthrax toxin receptor，CMG2，with protective antigen).生物化学杂志(J Biol Chem)279，23349-56(2004))。 在细胞培养测定中，可溶性CMG2细胞外结构域在与PA的摩尔比为3∶1 时，中和50％的致命毒素活性(Scobie等，美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci U S A)100，5170-4(2003))。然而，血液中的杆菌在活跃感染过 程中的高浓度暗示PA的浓度可能非常高，由此为了提供保护就需要高剂 量的抗毒素。

可用受体诱杀剂治疗的病症的另一个实例是感冒。感冒通常是相对轻 微的疾病。然而，由感冒引起的显著并发症，如中耳炎，窦炎和哮喘加剧 是普遍的。人类鼻病毒(HRV)导致高达所有成年人感冒的50％和儿童感 冒的25％(Bella和Rossmann，结构生物学杂志(J Struct Biol.)128：69-74， 1999，及Sperber和Hayden，抗微生物剂和化学疗法(Antimicrob Agents Chemother.)32：409-19，1988)。每年令社会付出的代价达到数十亿美元。 这些微小并且无包被的RNA病毒代表小RNA病毒的一个亚群(Rueckert， 病毒学(Virology)，第507-548页，eds.Fields，等，Raven出版社公司(Raven Press，Ltd.)纽约(New York)，1990)。鼻病毒的X射线结晶学识别直径 为300埃(1埃＝0.1nm)且二十面对称的壳体，其由60个拷贝的病毒外壳 蛋白VP1，VP2，和VP3的每一个复制构建而成(Rossmann，自然(Nature) 317：145-153，1985)。HRV的表面凹坑或“峡谷”被暗示为受体结合位点 (Colonno，等，美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA.) 85：5449-5453，1985；Rossmann，等，自然(Nature)317：145-153，1985)。在 102个表征化的HRV血清型中，91个(已知为主要组)共享它们的受体， 即称为细胞间黏着分子-1(ICAM-1)的细胞表面糖蛋白(Greve，等，细胞 (Cell)56：839-847，1989；Staunton，等，细胞(Cell)56：849-853，1989)；结 合位点位于N末端结构域1中(Greve，等，病毒学杂志(J Virol.) 65：6015-6023，1991；Staunton，等，细胞(Cell)61：243-254，1990)。

ICAM-1是膜蛋白，其具有5个细胞外结构域，疏水性跨膜结构域和 短细胞质结构域。ICAM-1表达于许多在免疫和炎性响应中重要的细胞中， 并且在其他细胞上是可诱导的(Casasnovas，等，美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci U S A).95：4134-9，1998)。ICAM-1起到白细胞整联蛋白 LFA-1和Mac-1的配体作用(Springer，细胞(Cell)76：301-14，1994； Staunton等，细胞(Cell)61：243-254，1990)。在该细胞表面上，由于与跨 膜结构域的联合，ICAM-1主要是二聚体(Miller，等，试验医学杂志(J Exp Med)182：1231-41，1995；Reilly，等，免疫学杂志(J Immunol.)155：529-32， 1995)。

已显示由5个细胞外结构域组成的ICAM-1重组可溶形式(sICAM-1) 在阻断人细胞体外鼻病毒感染中是有效的(Greve，等，病毒学杂志(J Virol.)65：6015-6023，1991；Marlin，等，自然(Nature).344：70-2，1990)。 sICAM-1对实验室品系和野生隔离种群的活性评估显示所有主要的HRV 品系都对sICAM-1敏感。不利用ICAM作为受体的次要的品系不受 sICAM-1的影响(Crump等.，抗病毒化学化学疗法(Antiviral Chem Chemother.)4：323-327，1993；Ohlin，等，抗微生物剂和化学疗法(Antimicrob Agents Chemother.)38：1413-5，1994)。

可溶性ICAM-1的体外抗病毒活性似乎是通过多于一种的机制介导 的。这些机制包括与细胞表面ICAM竞争结合位点，干扰病毒侵入或脱壳， 以及通过病毒RNA过早释放和侵入壳体的形成所引起的直接灭活(Arruda， 等，抗微生物剂和化学疗法(Antimicrob Agents Chemother.)36：1186-1191， 1992；Greve，等，病毒学杂志(J Virol.)65：6015-6023，1991；Marlin，等，自 然(Nature)344：70-2，1990；Martin等，病毒学杂志(J Virol.)67：3561-8， 1993)。

将HRV的宿主范围限定为灵长类。近期研究显示可溶性ICAM-1在 预防黑猩猩体内的鼻病毒感染中有效(Huguenel，等，美国呼吸危急护理医 学杂志(Am J Respir Crit Care Med.)155：1206-10，1997)。尽管黑猩猩没有 显示出临床症状，通过测量血清转化和病毒脱落证明了感染。单次剂量的 10mg鼻内喷雾形式的可溶性ICAM-1与HRV共同施用或者晚10分钟施 用该病毒时，有效预防HRV-16感染。

对可溶性ICAM-1的人类临床试验显示它减低试验HRV感冒的严重 性(Turner，等，JAMA 281：1797-804，1999)。在该试验中，总共196名受试 者接受多种剂型形式的可溶性ICAM-1或安慰剂。有些受试者在接种 HRV39前7小时开始接受可溶性ICAM-1或安慰剂，其它的在病毒接种后 12小时开始。药物以鼻内溶液或粉末的形式施用，以每日6次的剂量给药 7天(每天总共4.4mg)。在该研究中，如通过病毒分类或血清转化所测量 的，可溶性ICAM-1没有预防感染(安慰剂治疗的感染率92％对应于可溶 性ICAM-1治疗的感染率85％)。然而，可溶性ICAM-1确实对所有疾病 的测量具有影响。总症状评分降低了45％，患有临床感冒的受试者的比例 下降了23％，且鼻粘液重量减少了56％。使用粉末或溶液剂型之间，或接 种前的组和接种后的组之间不存在显著的区别。利用可溶性ICAM-1的治 疗没有引起任何的副作用或通过鼻粘膜吸收的证据。另外，不存在针对抗 HRV类型特异性抗体发育的抑制。

如所讨论地，ICAM-1是细胞表面上的二聚体。Martin等，在病毒学 杂志(J Virol.)67：3561-8，(1993)中首次提出通过多聚体可溶性ICAM的 HRV多价结合可以导致较高的有效亲和性，称为亲和力，并且由此促进病 毒的脱壳。他们构建了多价ICAM-1/免疫球蛋白分子，假定这些在中和 HRV中会比单价可溶性ICAM-1更有效，并且由此应该具有增高的治疗效 用。这些ICAM-1/免疫球蛋白分子包括ICAM-1氨基末端结构域1和2， 其与IgA1(IC1-2D/IgA)，IgM(IC1-2D/IgM)和IgG1(IC1-2D/IgG)的重链的 铰链和恒定结构域融合。另外，5个细胞外结构域与IgA1(IC1-5D/IgA)融 合。在HRV的结合、传染性和形成的测定中，将这些ICAM-1/免疫球蛋 白分子与具有两个(sIC1-2D)和5个(sIC1-5D)结构域的ICAM-1可溶性形 式进行比较。与可溶性ICAM-1相比，ICAM-1/IgA免疫球蛋白 (IC1-5D/IgA)200倍地，ICAM-1/IgM免疫球蛋白(IC1-2D/IgM)和ICAM- 1/IgG免疫球蛋白分子(IC1-2D/IgG)25倍和10倍地更加有效。这些分子高 效地抑制鼻病毒与细胞的结合并破坏病毒壳体的形成。ICAM-1/IgA免疫 球蛋白分子在纳摩尔浓度范围内有效。IC1-2D/IgA和IC1-2D/IgG的比较 显示所使用的Ig恒定区种类对功效具有很大的影响。

后来的研究比较了可溶性ICAM-1和IC1-5D/IgA对九种主要HRV血 清型和HRV-39的变体的抑制活性，所述HRV-39的变体是选出用于缓和 对可溶性ICAM-1的抗性的(Crump，等，抗微生物剂和化学疗法 (Antimicrob Agents Chemother.)38：1425-7，1993)。对标准血清型， IC1-5D/IgA比单体可溶性ICAM-1更加有效基于重量50-143倍，和基于 摩尔60-170倍。HRV-39变体对可溶性ICAM-1的抗性比野生型高38倍， 且它对IC1-5D/IgA的抗性仅高5倍。这与这样的假说相一致，所述假说 预期由多价分子引起的病毒从抑制的逃脱应该比由单体可溶性受体引起 的病毒从抑制的逃脱发生的频率更低(Martin，等，病毒学杂志(J Virol.) 67：3561-8，1993)。设计用于测量病毒灭活作用的测定显示可溶性ICAM-1 不直接灭活HRV-39和HRV-13到显著程度(＜0.5log₁₀传染性的降低)。然 而，利用IC1-5D/IgA的培养导致这些相同病毒传染性降低约1.0 log₁₀(Crump，等，抗微生物剂和化学疗法(Antimicrob Agents Chemother.) 38：1425-7，1994)。Martin等(病毒学杂志(J Virol.)67：3561-8，1993)的结 果暗示化合价越高，分子的效力越大。通过蔗糖梯度沉降可以将IC1-2/IgM 的二聚体和十聚体形式分开。十聚体形式在阻断HRV与HeLa细胞的结合 中比二聚体形式更有效5倍。

为了最小化确保功效所需要的受体诱杀剂蛋白的量，需要再进一步增 高受体诱杀剂的特异性活性或功效。因此，保持着对具有更高活性及改良 的药物动力学的有效诱杀剂的需要。

已经描述的受体诱杀剂具有若干缺点，包括费力的生产技术和与那些 生产方法有关的高成本。另外，这些受体诱杀剂作为苛刻环境中的多聚体， 具有有限的稳定性，在该苛刻环境中所述分子可能需要灭活病原体。因此， 存在着对具有增高稳定性的诱杀剂技术的需要，从而增加产量，且所述诱 杀剂可以以合理的成本进行商业可行量的生产。

发明概述

本发明预期嵌合毒素受体蛋白，其中病毒受体与免疫球蛋白复合物联 合，所述免疫球蛋白复合物具有至少免疫球蛋白重链的部分和至少免疫球 蛋白轻链的部分。毒素受体可以是与毒素或蛋白质结合的任意多肽，所述 毒素或蛋白质导致或发挥病原体作用。所述嵌合毒素受体蛋白与缺乏轻链 的嵌合毒素受体蛋白相比具有改良的稳定性。毒素受体和免疫球蛋白复合 物间的联合可以通过毒素受体和重链间的共价连接或毒素受体和轻链间 的共价连接来实现。典型地，共价连接是连接体，例如挠性的多肽序列 (Gly3Ser)3。在优选的实施方案中，嵌合病毒受体蛋白包括第一毒素受体 和重链间的共价连接，以及第二毒素受体和轻链间的共价连接。在一些实 施方案中，第一和第二毒素受体具有相同的氨基酸序列，但是在其他实施 方案中，所述受体具有不同的序列。

在所述嵌合毒素受体蛋白中的免疫球蛋白重链可以是任意的重链类 型，例如IgA，IgA₁，IgA₂，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgD，IgE，IgM，或嵌合免疫 球蛋白重链。当重链是IgA，IgD，或IgG重链时，重链的部分可以是恒定区 2和3。备选地，当重链是IgM或IgE重链时，重链的部分可以是恒定区 2，3和4。

免疫球蛋白轻链优选地包括轻链恒定结构域，并且可以κ或λ链。

在优选的实施方案中，嵌合毒素受体蛋白表达于植物中，包括作为植 物基因组一部分的单子叶植物和双子叶植物。烟草是优选的用于表达的植 物。与培养的哺乳动物细胞中的表达相反，植物中的表达容许了生产该嵌 合毒素受体蛋白成本的显著降低。

在优选的实施方案中，用于制造本发明嵌合毒素受体蛋白的所有蛋白 质都是人类蛋白质。除了在植物或植物细胞中的生产，本发明预期了在来 源于植物、脊椎动物或无脊椎动物的异源细胞，如哺乳动物细胞、发根细 胞或植物组织培养细胞中表达的嵌合毒素受体蛋白。

在另一个方面。本发明提供免疫黏附素，其包括本文所述的嵌合毒素 受体。在一些实施方案中，免疫黏附素是多聚体，其包括至少两个嵌合毒 素受体蛋白。在其他实施方案中，免疫黏附素包括与J链联合的嵌合毒素 受体蛋白。在另一个实施方案中，包含与J链联合的免疫黏附素的组合物 进一步与分泌性元件联合。

在一个实施方案中，本发明预期具有植物特异性糖基化的嵌合毒素受 体蛋白。在植物细胞中表达时，编码在其氨基酸序列内具有糖基化信号天 冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸的多肽的基因是通过与该序列的天冬酰胺残基连 接的寡糖被糖基化的，其中X可以是任意的氨基酸残基。为了获得对起糖 基化信号作用的多肽序列的一般性综述，参见Marshall，生物化学年度综 述(Ann.Rev.Biochem.)，41：673(1972)和Marshall，生物化学社会专题论 文(Biochem.Soc.Symp.)，40：17(1974)。在哺乳动物和植物细胞中对这 些信号进行识别。在它们成熟的末期，表达于植物或植物细胞中的蛋白质 与表达于其他细胞类型，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞中的蛋白质相比， 具有不同的糖基化模式。进行了表征植物特异性糖基化和将其与其他细胞 类型中的糖基化进行比较的具体研究，例如在Cabanes-Macheteau等，糖 生物学(Glycobiology)9(4)：365-372(1999)，和Altmann，糖缀合杂志 (Glycoconjugate J.)14：643-646(1997)所述的研究中。这些小组以及其他 小组显示了植物特异性糖基化产生聚糖，其具有连接(β(1，2))到甘露糖的木 糖，但是作为哺乳动物和昆虫细胞中糖基化的结果，木糖不连接(β(1，2))到 甘露糖。植物特异性糖基化导致连接(α(1，3))到邻近的GlcNAc的海藻糖， 而哺乳动物细胞中的糖基化导致连接(α(1，6))到邻近的GlcNAc的海藻糖。 此外，植物特异性糖基化不导致向蛋白质聚糖末端添加唾液酸，反之，在 哺乳动物细胞的糖基化中，添加了唾液酸。

在另一个实施方案中，前述组合物又与植物材料联合。植物材料目前 可以是植物细胞壁，植物细胞器官，植物细胞质，完整植物细胞，植物种 子，能萌发的植物，等。可能存在的特殊植物材料或植物高分子包括二磷 酸核酮糖羧化酶，光收获复合物，色素，次级代谢产物或叶绿素及其片段。 本发明的组合物除水之外可以具有嵌合毒素受体蛋白质量浓度 0.001％-99.9％。在另一个实施方案中，除水之外，嵌合毒素受体蛋白以质 量浓度0.01％-99％存在。在另一个实施方案中，本发明的组合物除水之外 具有以质量浓度0.01％-99％存在的植物材料或植物高分子。

在另一个方面，本发明提供通过使病原体抗原与嵌合毒素受体蛋白接 触而减少病原体抗原结合的方法，其中所述病原体可以是宿主细胞的致病 分子，致病病毒或致病细胞生物体。其它方面展示了降低病原体发病率和 死亡率以及由于致病分子如毒素引起的发病率和死亡率的方法。当本文涉 及该情况时，病原体抗原可以或不可以刺激抗体的形成。

在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包括本文所述的嵌合毒素 受体蛋白和药用载体。

在又一个方面，本发明提供表达载体系统，其包括编码免疫球蛋白重 链的部分的第一核苷酸序列；编码免疫球蛋白轻链的部分的第二核苷酸序 列；和编码第一毒素受体蛋白的第三核苷酸序列，其中随着在细胞宿主中 的表达，所述免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和第一毒素受体蛋白形成 嵌合毒素受体蛋白。

在再一个方面，本发明提供用于生产嵌合毒素受体蛋白的方法，其包 括提供一个或多个表达载体，其共同表达免疫球蛋白复合物，其中所述免 疫球蛋白复合物具有与免疫球蛋白轻链的部分联合的免疫球蛋白重链的 部分；和第一毒素受体蛋白，其中所述第一毒素受体蛋白与该免疫球蛋白 复合物联合；向细胞宿主中引入一个或多个表达载体；和表达所述免疫球 蛋白复合物和所述第一毒素受体蛋白，从而形成嵌合毒素受体蛋白。

本发明还预期炭疽嵌合毒素受体蛋白，其中炭疽毒素受体与免疫球蛋 白联合，所述复合物至少具有免疫球蛋白重链的部分。

在优选的实施方案中，炭疽毒素受体应该具有插入了冯维勒布兰德因 子类型A/整联蛋白(VW/I)的结构域。典型地，炭疽毒素受体应该具有 该受体分子的细胞外结构域。炭疽毒素受体可以是与保护性抗原结合的任 意多肽，其包括已知的受体肿瘤内皮标记8(TEM8)和毛细管形态发生 蛋白2(CMG2)。

在优选的实施方案中，炭疽毒素受体缺乏蛋白酶敏感性氨基酸序列。 例如，如果炭疽毒素受体是CMG2蛋白，则它优选地缺乏氨基酸序列 TEILELQPSSVCVG(SEQ ID NO：102)。

在一些实施方案中，免疫球蛋白重链是具有所有重链恒定区1，2和3 的IgA，IgD，或IgG重链。在其他实施方案中，重链仅具有重链恒定区2 和3。

炭疽毒素受体蛋白和部分免疫球蛋白重链间的共价连接可以是免疫 球蛋白铰链或任何类型的连接物，优选地是具有(Gly3Ser)3氨基酸序列的 连接物。

炭疽嵌合毒素受体的优选实施方案包括以下：1)通过连接物共价连 接的具有CMG2受体VWA/I结构域的炭疽毒素受体蛋白和具有重链恒定 区1，2和3的免疫球蛋白重链的部分；2)通过连接物和免疫球蛋白铰链 共价连接的具有CMG2受体VWA/I结构域的炭疽毒素受体蛋白和具有重 链恒定区2和3的免疫球蛋白重链的部分；3)通过免疫球蛋白铰链共价 连接的具有CMG2受体VWA/I结构域的炭疽毒素受体蛋白和具有重链恒 定区2和3的免疫球蛋白重链的部分；4)通过连接物共价连接的具有 CMG2受体VWA/I结构域的炭疽毒素受体蛋白和具有重链恒定区1，2和 3的免疫球蛋白重链的部分；5)通过免疫球蛋白铰链和连接物共价连接的 具有CMG2受体VWA/I结构域的炭疽毒素受体蛋白和具有重链恒定区2 和3的免疫球蛋白重链的部分；和6)所述炭疽毒素受体蛋白细胞外结构 域的任意部分和具有至少部分IgA2重链的免疫球蛋白重链。

在另一个方面，炭疽嵌合毒素受体蛋白还包括在免疫球蛋白复合物中 与免疫球蛋白重链联合的免疫球蛋白轻链。如上所述，毒素受体和免疫球 蛋白复合物之间的联合可以通过毒素受体和重链之间的共价连接或毒素 受体和轻链之间的共价连接来实现。在某些实施方案中，嵌合毒素受体蛋 白包括第一毒素受体和重链之间的共价连接，以及第二毒素受体和轻链之 间的共价连接。在一些实施方案中，第一和第二毒素受体具有相同的氨基 酸序列，但是在其他实施方案中，所述受体具有不同的序列。

还预期了对所述受体蛋白或其部分的改变和修饰，只要该修饰不破坏 受体结合毒素、毒药、病原体或病原体成分的能力。

如上所述，对于所有类型的嵌合毒素受体蛋白，炭疽嵌合毒素受体蛋 白可以在植物和多种异源细胞中表达。在优选的实施方案中，用于制造本 发明的嵌合毒素受体蛋白的所有蛋白质是人类蛋白质。

在另一个方面，本发明提供免疫黏附素，其包括本文所述的炭疽嵌合 毒素受体，如具有至少2个炭疽嵌合毒素受体蛋白的多聚体，与J链联合 的炭疽嵌合毒素受体蛋白，以及与J链和分泌性元件联合的炭疽嵌合毒素 受体蛋白。

在其它实施方案中，本发明预期具有植物特异性糖基化的炭疽嵌合毒 素受体蛋白和前述还与植物材料联合的组合物。

在另一个方面，本发明展示了通过使PA与本文所述的炭疽嵌合毒素 受体接触，减少或预防炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原(PA) 与宿主细胞结合的方法。其他方面展示了用于降低炭疽发病率和死亡率以 及由于保护性抗原引起的发病率和死亡率的方法。

在其它方面，本发明提供包含炭疽嵌合毒素受体的药物组合物，该受 体的表达载体，和制造该受体的方法。

在另一个不同的方面，本发明提供嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白，其中 免疫球蛋白复合物具有与肉毒杆菌毒素受体蛋白联合的免疫球蛋白重链 的至少一部分。

附图简述

图1.举例说明pSSPHuA2载体，其中编码嵌合ICAM-1分子的DNA 与人IgA2m(2)的Fc区域融合[SEQ ID NO：9，48]，所述嵌合ICAM-1分子 含有人ICAM-1的前5个结构域。该载体包含用于驱动信号肽表达的 SuperMas启动子和人IgA2m(2)重链的恒定区。通过PCR扩增编码ICAM 结构域1-5的序列，从而使其在信号肽和Cα1结构域之间含有用于插入的 常规限制性位点(5′SpeI和3′SpeI)。将编码ER保留信号(RSEKDEL)[SEQ ID NO：5]的DNA附加在重链的3′末端，从而提高该构建体的表达水平。

图2举例说明嵌合ICAM分子。2A显示产生嵌合ICAM-1分子的DNA 表达盒。2B显示信号肽分裂后融合蛋白成熟形式的氨基酸序列[SEQ ID NO：8]。对通过克隆程序引入的氨基酸加下划线，并且标记了ICAM-1的 5个细胞外结构域和IgA2m(2)重链的Cα1-Cα3结构域间的接合。粗体的 N’s显示15个潜在的糖基化位点。

图3举例说明免疫黏附素在独立转化的烟草胼胝体中的表达。3A显 示非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹，其中含有不同转化烟草胼 胝体(C)和水性提取物(Aq)的样品流过该凝胶，并且对人ICAM的存 在进行探测。显示了分子量标记，且参考标准(R)是人ICAM(～75kD) 和人SigA(＞＞250kD)的混合物(各～75ng)。3B显示非还原的SDS-聚丙 烯酰胺凝胶的免疫印迹，该凝胶含有多种来自胼胝体RM107-11的部分纯 化的免疫黏附素级分。所分析的纯化级分是果汁(3)，G-100级分(G)， 无菌过滤的G-100级分(SG)，以及人SigA(75ng)和人ICAM-1(75ng) 的参考标准的混合物(RS)。用针对人ICAM(～ICAM)，人IgA重链(～α)， 人分泌性元件(～SC)和人J链(～J)的抗体探测标记。其次，必要地利 用酶缀合抗体标记与碱性磷酸酶的免疫阳性条带。

图4举例说明酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，其显示植物提取物 和可溶性ICAM-1之间对于结合抗ICAM mAb的竞争。对于该测定，用 0.25μg可溶性ICAM-1/ml包被96孔板。方块代表sICAM增高的浓度，圆 圈代表胼胝体提取物(来自G-100的无菌过滤的级分)的增加量，所述胼 胝体提取物用于为了恒定量的小鼠(抗人ICAM)抗体与黏着ICAM竞争。

图5举例说明测定的结果，其显示免疫黏附素抑制人鼻病毒杀死HeLa 细胞(细胞病理效应，或CPE，测定)的能力。5A显示这样的测定的结 果，该测定含有ICAM-Fc融合(IC1-5D/IgA)中的免疫黏附素或含有阿霉素 抗体的部分纯化的提取物存在下，比较人鼻病毒对HeLa细胞的CPE。(正 立和倒立的三角代表两种来源于Rhi 107-11的提取物，其含有免疫黏附 素)。5B显示这样的测定的结果，该测定在可溶性人ICAM-1或来自 ICAM-Fc融合(IC1-5D/IgA)中免疫黏附素的提取物的存在下，比较人鼻病 毒对HeLa细胞的CPE。插图显示在对可溶性ICAM(1.35μg/ml)和对 IC1-5D/IgA (0.12μg/ml；低11.3倍)IC50范围内的刻度扩展。

图6显示对为制造1克成品免疫黏附素的生产必需品的评估。在该图 表中，举例说明了在20％的产率，预料的表达水平和植物重量下，1克免 疫黏附素所需的植物的数量。在不同的免疫黏附素表达水平(mg/kg新鲜重 量)和总回收量(设置为20％)时，可以对在合理可能性窗口(圆点的方 块)内指定的生产目的(1g/收获)确定每棵植物的重量，以及因此植物的 总数。与特殊生长的数量和再生长时期相反，所需的植物数量减少。预料 的生物量生产、时间功能和生长条件影响收获的时间和收获之间的时间。 通过错开种植和收获的日期可以将这些生长时期调节到纯化时间表的现 实中。

图7显示列于表2中的各种免疫球蛋白基因和蛋白质的编码和氨基酸 序列[SEQ ID NO：15-47和SEQ ID NO：52-62]。

图8显示用于转化植物的质粒的序列，如实施例2中所述，从而用于 本发明的免疫黏附素表达的研究中。

图8A显示质粒PSSpICAMHuA2的核苷酸[SEQ ID NO：9]和蛋白质 [SEQ ID NO：48]序列。

图8B显示豆类豆球蛋白信号肽的核苷酸和蛋白质[SEQ ID NO：10]序 列。

图8C显示pSHuJ的蛋白质编码区的核苷酸[SEQ ID NO：11]和氨基酸 [SEQ ID NO：50]序列。

图8D显示pSHuSC的蛋白质编码区的核苷酸[SEQ ID NO：12]和氨基 酸[SEQ ID NO：51]序列。

图8E显示质粒pBMSP-1的核苷酸序列[SEQ ID NO：13]。

图8F显示质粒pBMSP-1spJSC的核苷酸序列[SEQ ID NO：14]。

图9包含ICAM-1和人IgA2的核苷酸和蛋白序列SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8，以及其他核苷酸序列。

图10显示ATR-IgA2融合(免疫黏附素)的完整核苷酸(SEQ ID NO：98) 和氨基酸(SEQ ID NO：99)序列。

图11显示质粒pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2的T-DNA边界间的序列 (SEQ ID NO：100)。

图12显示质粒pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC的T-DNA边界间的序列(SEQ ID NO：101)。

图13显示细胞病理效应测定。ICAM-1/IgA2(菱形)和可溶性ICAM-1 (方块)在不同浓度下与人鼻病毒混合，并且再加入到HeLa细胞中。在 4天中量化对细胞死亡的抑制。

图14显示CMG2-IgG构建体和变体的氨基酸序列。粗体版的半胱氨 酸(上方序列的Cys185，和公开的CMG2序列³¹的Cys218)是VWA/I 结构域的最后一个氨基酸。随后的14个氨基酸(斜体的)是部分CMG2， 但不是VWA/I结构域。序列上方的标记表示IgG1Cγ1，Cγ2和Cγ3的开端。 下面划线的序列是IgG1铰链区。显示了变体(V1，V2a，V2b和V3)的序列， 破折号代表缺失的氨基酸。氨基酸上方粗体版的数字表示测序片段的氨基 末端(正文中所述)。

图15是经蛋白质A纯化的CMG2-IgG和1H IgG的银染色凝胶。泳道 1和4，蛋白质尺寸标准；泳道2，还原的CMG2-IgG；泳道2，还原的1H； 泳道5和6，来自两种单独的制剂的非还原的CMG2-IgG；泳道7，非还 原的1H。重组蛋白质样品含有50ng蛋白质/泳道。右侧显示CMG2-IgG 免疫黏附素和可能的降解产物的卡通图像。

图16是CMG2-IgG及变体的考马斯染色SDS-PAGE。泳道1-7在非 还原条件下运行。泳道8-13在还原的条件(100mM DTT)下运行。泳道1 和8，原始的CMG2-IgG；泳道2和9，V1；泳道3和10，V2a；泳道4 和11，V2b，泳道5和12，V3；泳道6和13，CMG2-IgG+κ链；泳道7， 分子量标记。

图17是通过大小排阻层析分馏植物来源CMG2-IgG V2b的洗脱分布 图。将经蛋白质A纯化的来自烟草植物的CMG2-IgG V2b应用于Tosoh G4000SW柱，并用PBS洗脱。通过在280nm处的吸收监测蛋白质。在运 行前用分子量标准校准该柱。在该分布图中显示了保留时间和计算的分子 量。在分开前，将内部标准p-氨基苯酸(具有保留时间15.3分钟的峰)加 入到样品中。

图18显示由CMG2-IgG变体引起的致命毒素细胞毒性的中和。将 RAW 264.7小鼠巨噬细胞样细胞暴露于PA+LF加上渐增浓度(0-1.25μg/ml) 的原始CMG2-IgG(方块)，CMG2-IgG V2b(菱形)或不相关的由植物制 成的IgG(圆圈)。每个点均是三次重复的平均值。

图19是CMG2-IgG V2b的模型。具有一个与之结合的PA分子的抗毒 素同型二聚体的假想描述。将该抗毒素描述为通过Cγ3结构域间的非共价 相互作用结合，尽管在一部分分子的铰链区(CMG2和Cγ2之间)可能存 在二硫键。短线表示刻度。结构档案来自蛋白质数据库，并且利用来自加 利福尼亚大学旧金山分校的生物计算，显像和信息学资源(Resource for Biocomputing，Visualization，and Informatics)的UCSF嵌合程序包(UCSF Chimera package)产生分子图像(受到NIH P41RR-01081的支持)⁵⁴。

图20显示CMG2-κ变体。CMG2-κ表达在具有CMG2-IgG V1或 CMG2-IgG V3的N.benthamiana中，并且使经蛋白质A纯化的蛋白质进 行SDS-PAGE，并用考马斯染色。泳道1和2在非还原的条件下运行。泳 道3和4在还原的条件(100mM DTT)下运行；泳道5，分子量标记。

附表简述

表1列出ICAM-1的5个细胞外结构域的边界。

表2显示免疫球蛋白重链基因和该基因编码的蛋白质的GenBank编 号。

表3提供具有ICAM-1同源性的分子的实例的列表，所述分子可以用 于创建其他嵌合鼻病毒毒素受体蛋白。

表4显示已知的肉毒杆菌受体和推定的结合结构域。

表5显示实施例9中进行的随机化鼻病毒攻击研究的研究设计。

表6显示如实施例16中所述，瞬时转染的N.benthamiana叶子中的嵌 合炭疽毒素受体产物。

表7显示实施例18中计算的IC₅₀和在IC₅₀下抗毒素和PA的摩尔比。

表8描述实施例19中多种CMG-IgG嵌合变体的结构。

发明详述

定义

用于本文时，以下缩写和术语包括，但不必然受限于，下列定义。

除非另外说明，本发明的实践应该使用免疫学、分子生物学、微生物 学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，其处于本领域的技术范围内。 参见，例如Sambrook，等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(2nd edition)(1989)；分子生物学中当前的 方案(Current Protocols In Molecular Biology)(F.M.Ausubel，等eds.， (1987))；系列酶学方法(the series Methods In Enzymology)(学术出版社 (Academic Press，Inc.))；M.J.MacPherson，等，eds.Pcr 2：一个实践方法 (Pcr 2：A Practical Approach)(1995)；Harlow和Lane，eds，抗体：实验室 手册(Antibodies：A Laboratory Manual)(1988)，和H.Jones，分子生物学中 的方法(Methods In Molecular Biology)卷49，植物基因转移和表达方案 (″Plant Gene Transfer And Expression Protocols″)(1995)。

免疫黏附素：含有与免疫球蛋白恒定区的部分融合的嵌合毒素受体蛋 白分子，以及任选地含有分泌性元件和J链的复合物。

嵌合毒素受体蛋白：基于毒素受体的蛋白质，其具有至少一部分的来 源于毒素受体的它的氨基酸序列，和至少一部分的来源于免疫球蛋白复合 物。

毒素受体：用于本文时，该术语指任何以这样的亲和性和亲和力与本 文所定义的病原体抗原，毒素，或发挥或引起致病作用发挥的任何蛋白质， 脂蛋白，糖蛋白，多糖或脂多糖结合的多肽，所述亲和性和亲和力足以容 许嵌合毒素受体蛋白起到受体诱杀剂功能。例如，毒素受体可以是病毒附 着受体，如ICAM-1，人鼻病毒受体，或细菌毒素受体，如炭疽保护性抗 原或肉毒杆菌毒素受体中的一种。毒素受体用于本文时，应该至少含有结 合毒素/病原体成分的功能元件，但还可以任选地包括一种或多种另外的多 肽。

免疫球蛋白分子或抗体：多肽或多聚蛋白质，其含有由共价偶联在一 起的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的免疫学活性部分，并且能够与抗 原特异地结合。免疫球蛋白或抗体分子是大的分子家族，其包括若干类型 的分子，如IgM，IgD，IgG，IgA，分泌性IgA(SIgA)，和IgE。

免疫球蛋白复合物：多肽复合物，其可以包括免疫球蛋白重链的部分， 或免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链两种的部分。这两种成分可以通过多 种不同的方式，包括共价连接，如二硫键相互联合。

免疫球蛋白重链的部分：用于本文时，该术语指重链的区域，该区域 对于赋予本文所述嵌合毒素受体蛋白至少一种下列性质是必要的：多聚的 能力，效应子功能，被蛋白质G或A纯化的能力，或改良的药物动力学。 典型的，其包括至少部分恒定区。

免疫球蛋白轻链的部分：用于本文时，该术语指轻链的区域，该区域 对于增加所述嵌合毒素受体蛋白的稳定性以及由此增高产量是必要的。典 型的，其包括至少部分恒定区。

重链恒定区：含有至少重链免疫球蛋白恒定区的部分的多肽。典型的， 在其天然形式中，IgG，IgD和IgA免疫球蛋白重链含有3个恒定区，其与 一个可变区相连接。IgM和IgE含有4个恒定区，其与一个可变区相连接。 如本文所述，从最接近可变结构域的区域顺序编号恒定区。例如，在IgG， IgD，和IgA重链中，区域命名如下：可变区，恒定区1，恒定区2，恒定 区3。对于IgM和IgE，区域命名如下：可变区，恒定区1，恒定区2，恒 定区3和恒定区4。

嵌合免疫球蛋白重链：免疫球蛋白来源的重链，其至少含有来源于不 同同种型或亚型，或一些其他肽、多肽或蛋白质的免疫球蛋白重链的它的 氨基酸序列的一部分。典型地，嵌合免疫球蛋白重链具有来源于至少两种 不同同种型或亚型的免疫球蛋白重链的它的氨基酸残基序列。

J链：在免疫球蛋白的聚合和多聚免疫球蛋白经上皮细胞的传送中有 所涉及的多肽。参见，免疫球蛋白助手：免疫球蛋白基因中的J链(The Immunoglobulin Helper：The J Chain in Immunoglobulin Genes)，在第345 页，学术出版社(Academic Press)(1989)。在五聚体IgM和二聚体IgA 中发现了J链，且其典型地通过二硫键附着。已经在小鼠和人中研究了J 链。

分泌性元件(SC)：分泌性免疫球蛋白成分，其帮助保护免疫球蛋白 免遭灭活试剂的作用，从而增加分泌性免疫球蛋白的生物有效性。该分泌 性元件可以来自任何哺乳动物或啮齿动物，包括小鼠或人。

连接体：用于本文时，该术语指任何用于促进重组所产生的多肽的折 叠和稳定性的多肽序列。优选地，该连接体是挠性的连接体，例如，由多 肽序列，如(Gly3Ser)3或(Gly4Ser)3组成的连接体。

转基因植物：遗传改造的植物或遗传改造植物的后代。转基因植物通 常包含来自至少一种不相关生物体，如病毒，另一种植物或动物的材料。

单子叶植物：胚芽具有一个子叶(cotyledon或seed leaf)的开花植物。 单子叶植物的实例是：百合；草；玉米；谷类，包括燕麦、小麦和大麦； 兰花；鸢尾；洋葱和棕榈。

双子叶植物：胚芽具有两个子叶(seed leaf或cotyledon)的开花植物。 双子叶植物的实例是：烟草；番茄；豆类，包括紫花苜蓿；橡树；枫树； 玫瑰；薄荷；南瓜；雏菊；胡桃；仙人掌；紫罗兰和毛茛。

糖基化：通过寡糖的蛋白质修饰。为获得有关起糖基化信号功能的多 肽序列的一般性综述，参见，Marshall，生物化学年度综述(Ann.Rev. Biochem.)，41：673(1972)和Marshall，生物化学社会专题论文(Biochem. Soc.Symp.)，40：17(1974)。在哺乳动物和植物细胞中识别这些信号。

植物特异性糖基化：在植物表达蛋白质中发现的糖基化模式，其区别 于在哺乳动物或昆虫细胞中制成的蛋白质中发现的糖基化模式。在植物或 植物细胞中表达的蛋白质具有与其他类型细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫 细胞中表达的蛋白质不同的糖基化模式。由Cabanes-Macheteau等，糖生 物学(Glycobiology)9(4)：365-372(1999)，Lerouge等，植物分子生物学 (Plant Molecular Biology)38：31-48(1998)和Altmann，糖缀合杂志 (Glycoconjugate J.)14：643-646(1997)进行了表征植物特异性糖基化和与 其他细胞类型中的糖基化相比较的具体研究。植物特异性糖基化产生聚 糖，其具有连接(β(1，2))到甘露糖的木糖。哺乳动物或昆虫的糖基化均不产 生连接(β(1，2))到甘露糖的木糖。植物没有与聚糖末端连接的唾液酸，而哺 乳动物细胞有。另外，植物特异性糖基化导致与最接近的GlcNAc连接 (α(1，3))的海藻糖，而哺乳动物细胞中的糖基化导致与最接近的GlcNAc连 接(α(1，6))的海藻糖。

病原体抗原：任何发挥或引起致病作用发挥的分子，例如毒素。病原 体抗原可能能够或可能不能够刺激抗体的形成。

炭疽毒素受体：用于本文时，该术语指任何以这样的亲和性和亲和力， 与保护性抗原(PA)，即三种被炭疽杆菌用于破坏宿主细胞的相互作用蛋 白之一结合的多肽，所述亲和性和亲和力足以起到容许嵌合炭疽毒素受体 蛋白作为受体诱杀剂功能。在本领域中已经识别了两种内源细胞炭疽毒素 受体：炭疽毒素受体/肿瘤内皮标记8(ATR/TEM8)(Bradley等，2001)和毛 细管形态发生因子(CMG2)(Scobie等，2001)。这些ATRs的细胞外结构域 含有如下所述的VWA/I结构域。本文所使用的炭疽毒素受体应该至少含 有用于结合PA的功能元件，但还可以任选地包括一种或多种另外的多肽 (例如，改良炭疽毒素受体作为受体诱杀剂的应用的多肽)，所述多肽可 以通过将所述一种或多种另外的多肽的编码序列剪接到炭疽毒素受体编 码序列中产生。

VWA/I结构域：用于本文时，该术语指冯维勒布兰德因子类型A结构 域(VWA结构域)，也普遍命名为插入整联蛋白的结构域(I结构域)，其 为两种已知的炭疽毒素受体，即TEM8和CMG2的细胞外结构域中的结 构域，且认为其含有金属离子依赖性粘附位点(MIDAS)，该位点是PA 和受体恰当结合的基础。

嵌合炭疽毒素受体蛋白：基于炭疽毒素受体的蛋白，其具有至少一部 分的来源于炭疽毒素受体的它的氨基酸序列和来源于免疫球蛋白复合物 的至少一部分。免疫球蛋白复合物可以仅含有免疫球蛋白重链的部分，或 者它可以含有重链的部分和轻链的部分。

肉毒杆菌毒素受体：任何以这样的亲和性和亲和力与肉毒杆菌毒素结 合的多肽，所述亲和性和亲和力足以容许嵌合炭疽毒素受体蛋白起到受体 诱杀剂功能。实例包括SV2和突触结合蛋白。

有效量：本发明的免疫黏附素的有效量足以可探测地抑制病毒或细菌 感染(当可能是该情形时)，细胞毒性或复制；或足以减少感染的严重性 或持续的时间。

构建体或载体：将被转移到靶植物组织或细胞中的人工装配DNA片 段。典型地，该构建体应该包括的一种或多种特殊兴趣基因，标记基因和 适当的对照序列。术语“质粒”指自发地自我复制的染色体外DNA分子。 含有适当的调节元件的质粒构建体还称为“表达盒”。在优选的实施方案 中，质粒构建体还含有筛选或选择性标记，例如抗生素抗性基因。

选择性标记：编码容许转基因组织在选择性培养基上生长的产品的基 因。选择性标记的非限制性实例包括编码抗生素抗性，如氨苄青霉素、卡 那霉素等的基因。本领域技术人员应该知道其他选择性标记。 具有改良的稳定性的嵌合毒素受体蛋白

本文所述的嵌合毒素受体蛋白具有与免疫球蛋白复合物联合的毒素 受体，所述免疫球蛋白复合物含有免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。毒 素受体蛋白可以与该重链，轻链或两者联合。在一些实施方案中，J链以 单独或与分泌性元件联合的形式，与嵌合毒素受体蛋白联合，从而形成免 疫黏附素。在其他实施方案中，嵌合毒素受体蛋白具有植物特异性糖基化。

不希望受到理论的限制，相信本文所述的嵌合毒素受体蛋白应该具有 超越现存的单克隆抗体或基于受体诱杀剂的预防药或疗法的显著优势，其 包括由于受体的多价性引起的较高活性，免疫球蛋白Fc的效应子功能， 由Fc引起的改良的药物动力学，和当在植物中制造时的较低生产成本。

通过人ICAM-1的细胞外结构域和免疫球蛋白重链的融合证明了多价 性的优势(Martin，S.，Casasnovas，J.M.，Staunton，D.E.& Springer，T.A.由嵌 合ICAM-1/免疫球蛋白分子引起的对鼻病毒的有效中和和破坏(Efficient neutralization and disruption of rhinovirus by chimeric ICAM-1 /immunoglobulin molecules).病毒学杂志(J Virol)67，3561-8(1993))。 ICAM-1是人鼻病毒(HRV)，即常见的感冒病毒，的细胞表面受体。嵌合 免疫黏附素在抑制HRV与细胞的融合以及破坏病毒壳体的形成中，比可 溶性ICAM-1更加有效得多(Martin等，病毒学杂志(J Virol)67，3561-8 (1993))。在转基因烟草中表达了ICAM-1/IgA2嵌合体(RhinoRx)，其具有 高于可溶性ICAM-1保护细胞免遭HRV细胞病理效应特异性能力10倍的 能力。

Fc区域的存在应该赋予免疫球蛋白效应子功能，如在补体存在下介导 特异性细胞溶解的能力。免疫球蛋白的重链恒定区结构域赋予含有该结构 域的特殊分子多种性质，已知为抗体效应子功能。实例效应子功能包括补 体固定，胎盘转移，与葡萄球菌蛋白的结合，与葡萄球菌G蛋白的结合， 与单核细胞、嗜中性粒细胞或肥大细胞和嗜碱细胞的结合。具有这些效应 子功能的特殊结构域和特殊免疫球蛋白同种型的联合是众所周知的，且例 如，描述在以下文献中：免疫学(Immunology)，Roitt等，Mosby St.Louis， Mo.(1993年第3版)。

另外，Fc与FcRn的结合应该容许免疫黏附素在循环中坚持更长时间 (Ober，R.J.，Martinez，C，Vaccaro，C，Zhou，J.& Ward，E.S.通过MHC类相 关受体，即FcRn显现IgG补救的位点和动力学(Visualizing the Site and Dynamics of IgG Salvage by the MHC Class I-Related Receptor，FcRn).免疫 学杂志(J Immunol)172，2021-2029(2004))。这可以容许将抗毒素用作预 防药。

当在宿主细胞，宿主组织或宿主生物体，植物细胞，植物组织或完整 植物中生产时，嵌合毒素受体蛋白和免疫黏附素分子或复合物的产率的增 长导致加工时较高的分子产率和较低的生产成本。所述较高的产率可以是 生产嵌合毒素受体蛋白的组成链和免疫黏附素或免疫黏附素复合物中较 高的效率，和/或装配免疫黏附素复合物较高的效率所引起的结果。在尤其 是包含免疫球蛋白重链的部分和免疫球蛋白轻链的部分的嵌合毒素受体 蛋白或免疫黏附素的情形中，纯化的或部分纯化的免疫黏附素活性的明显 水平增高可以归因于组成链可用性的增加和/或装配复合物中较高的效率， 和/或受体或所有上述各项的组合的多价性。

技术人员应该理解，当需要去除蛋白酶敏感的结构域，以及当必须改 良功能和稳定性时包含连接体时可以将本文所述的嵌合毒素受体蛋白进 行修饰。引入所述修饰的方法在本领域中众所周知；然而，不能通过推理 得知该修饰的准确性质(例如，去除哪个结构域，连接体的长度和位置)。

毒素受体

毒素受体是任何以这样的亲和性和亲和力与病原体抗原，毒素或任何 发挥或引起致病作用发挥的蛋白质结合的多肽，所述亲和性和亲和力足以 容许嵌合毒素受体蛋白起到受体诱杀剂的功能。例如，在抗病毒或抗菌实 施方案中，使用了有效地与兴趣病毒，一种或多种细菌或其亚成分结合的 一种或多种受体蛋白，如由病毒或细菌产生并且对于病毒或细菌开始发挥 或引起其致病作用发挥的步骤所必需的蛋白质。已知许多这样的受体蛋 白，并且本领域中的那些普通技术人员可以在不进行过度试验的条件下， 实现这些受体蛋白在本发明的适当方面中的应用。

毒素受体的实例是ICAM-1，即人鼻病毒受体。Staunton，等，细胞 (Cell)52：925-933(1988)；Greve，等，(Cell)56：839-847(1989)；Greve， 等，免疫学杂志(J.Virology)65：6015-6023(1991)；Staunton，等，细胞(Cell)， 61：243-254(1990)已经确定并表征了ICAM-1的核苷酸序列，并将其记述 为SEQ ID NO：3和GenBank编号M24283。ICAM-1分子是膜蛋白(SEQ ID NOS：1和2)，其具有5个细胞外结构域，疏水性跨膜结构域和短细胞质 结构域。这些性质被记述在Casasnovas，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，95：4134-4139(1998)和Staunton，等，细胞(Cell) 52：925-933(1988)中。

在所述嵌合毒素受体蛋白中使用的毒素受体可以是完整的毒素受体 或仅是足以赋予亲和性和亲和力的部分，所述亲和性和亲和力足以用于容 许嵌合毒素受体蛋白起到受体诱杀剂功能。

例如，如果毒素受体是ICAM-1，则在本发明适当方面中的特殊应用 的是负责与人鼻病毒结合的ICAM-1分子的结构域，其已被定位为N末端 结构域1和2(Greve，等，病毒学杂志(J.Virol)，65：6015-6023 1991，和 Staunton，等，细胞(Cell)，61：243-2451990)。还预期的是鼻病毒受体蛋 白部分，其包括ICAM-1分子细胞外结构域1，2，3，4和5的任意组合。 在特别优选的实施方案中，鼻病毒受体蛋白部分包括ICAM-1分子的结构 域1和2，并且在其他优选的实施方案中，存在ICAM-1分子的结构域1， 2，3，4和5。

该5个ICAM-1细胞外结构域的边界在本领域中是众所周知的，且将 其记述在Staunton，等，细胞(Cell)52：925-933(1988)中。SEQ ID NO：2 的近似结构域边界显示于下表1中：

                      表1

                                            

        ICAM-1结构域             氨基酸

                                            

        1                        1-88

        2                        89-105

        3                        106-284

        4                        285-385

        5                        386-453

                                              

用于本发明的一些方面和实施方案时，ICAM-1结构域1是约残基1 -约残基88；结构域2是约残基89-约残基105；结构域3是约残基106 -约残基284；结构域4是约残基285-约残基385；和结构域5是约残基 286-约残基453。本领域的技术人员应该理解这些结构域的准确边界是可 以变化的。

在标题为“炭疽嵌合毒素受体”的部分更加详细地描述了用于本发明 的炭疽受体和合适的结构域。

在标题为“肉毒杆菌嵌合毒素受体”的部分更加详细地描述了用于本 发明的肉毒杆菌受体和合适的结构域。

免疫球蛋白复合物

免疫球蛋白复合物可以包括免疫球蛋白重链的部分或免疫球蛋白重 链和轻链两者的部分。这两种成分可以通过多种不同的方式，包括共价连 接，如二硫键相互联合。免疫球蛋白复合物与至少一种毒素受体蛋白联合。 该联合可以通过共价连接，离子相互作用，氢键，离子键，范德瓦尔斯力， 金属-配体相互作用，或任何其他类型的相互作用来进行。

免疫球蛋白重链

嵌合毒素受体蛋白含有至少免疫球蛋白重链的部分，其足以赋予多聚 化附着的炭疽受体蛋白的能力，赋予抗体效应子功能，稳定植物中的嵌合 蛋白，赋予能够被蛋白质A或G纯化的能力，或改良药物动力学。

这些性质是由重链的恒定区赋予的。如果嵌合毒素受体蛋白仅含有免 疫球蛋白重链，则免疫球蛋白复合物中的重链的部分优选地含有至少结构 域CH2和CH3，并且更优选地，仅含CH2和CH3。如果嵌合毒素受体蛋 白含有重链和轻链，则免疫球蛋白复合物中的重链的部分优选还含有CH1 结构域。

本领域的技术人员应该能够容易地识别免疫球蛋白重链恒定区序列。 例如，通过GenBank可以获得大量免疫球蛋白DNA和蛋白质序列。表2 显示免疫球蛋白重链基因和这些基因所编码的蛋白质的GenBank编号。

                       表2

                                                        

GENBANK编号   人免疫球蛋白序列名称     SEQ NO.ID

                                                        

J00220        Ig_α1重链恒定区          15，52

              编码序列

J00220        Ig_α1重链恒定区          16

              氨基

              酸序列

J00221        IgA₂重链恒定区           17，53

              编码

              序列

J00221        IgA₂链恒定区             18

           氨基

           酸序列

J00228     Ig_γ1重链恒定区       19，54

           编码

           序列

J00228     Ig_γ1重链恒定区       20

           氨基酸序列

J00230     IgG₂重链恒定区        21，55

           编码

V00554     序列

J00230     IgG₂重链恒定区        22

           氨基

V00554     酸序列

X03604     IgG₃重链恒定区        23，57

           编码

M12958     序列

X03604     IgG₃重链恒定区        24

           氨基

M12958     酸序列

K01316     IgG₄重链恒定区        25

           编码序列

K01316     IgG₄重链恒定区        26

           氨基酸序列

K02876     IgD重链恒定区         27

           编码序列

K02876     IgD重链恒定区         28，30，32

           氨基酸序列

K02877     IgD重链恒定区         29

           编码序列

K02877     IgD重链恒定区         28，30，32

          氨基酸序列

K02878    种系IgD重链编码                    31

          序列

K02878    种系IgD重链氨基                    28，30，32

          酸序列

K02879    种系IgD重链C-δ-3                  33

          结构域编码序列

K02879    种系IgD重链C-δ-3                  28，30，32

          氨基酸序列

K01311    种系IgD重链J-δ                    58

          区域：C-δ

          CH1编码序列

K01311    种系IgD重链J-δ                    28，30，32

          区域：C-δ

          CH1氨基酸序列

K02880    种系IgD重链基因                    36

          C-区域，分泌性末端

          编码序列

K02880    种系IgD重链基因                    28，30，32

          C-区域，分泌性末端

          氨基酸序列

K02881    种系IgD重链基因                    38

          C-区域，膜末端编码序列的第一结构域

K02881    种系IgD重链基因                    28，30，32

          C-区域，膜末端氨基酸序列的第一结构

          域

K02882    种系IgD重链编码                    40

          序列

K02882    种系IgD重链氨基                    28，30，32

          酸序列

K02875      种系IgD重链基因                42

            C-区域，C-δ-1结构域编码

            序列

K02875      种系IgD重链基因                28，30，32

            C-区域，C-δ-1结构域氨基

            酸序列

L00022      IgE重链恒定区                  59

            编码

J00227      序列

V00555

L00022      IgE重链恒定区                  60

            氨基

J00227      酸序列

V00555

X17115      IgM重链完整                    61

            序列

            编码序列

X17115      IgM重链完整                    62

            序列

            氨基酸序列

                                                    

因此，在某些实施方案中，来源于免疫球蛋白重链的部分嵌合分子可 以含有小于完整的重链，只要它仍然含有足以赋予上述性质的部分。

免疫球蛋白重链可以来自任意类型的免疫球蛋白，如IgA，IgA₁，IgA₂， IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgD IgE，IgM，或嵌合免疫球蛋白重链。部分免疫球 蛋白重链可以含有IgA，IgG，或IgD重链的CH1，CH2，或CH3，或IgM 或IgE重链的CH1，CH2，CH3，或CH4。还预期了这些恒定区多种组合 和亚组合。

在优选的实施方案中，部分重链是部分IgM或IgA重链，其容许免疫 球蛋白重链与J链结合，并由此与分泌性元件结合。预期来源于免疫球蛋 白重链的部分嵌合炭疽毒素受体蛋白可以由单独的结构域组成，所述单独 的结构域选自IgA重链或IgM重链或选自一些其他重链同种型。还预期可 以在分子水平上改造来源于除IgA或IgM外的免疫球蛋白重链或来源于免 疫球蛋白轻链的免疫球蛋白结构域，从而与J链结合，并且由此可用于产 生本发明的免疫球蛋白和免疫黏附素。

在优选的实施方案中，嵌合毒素受体蛋白至少含有小鼠或人IgA1， IgA2或IgM的CH1，CH2，CH3结构域。本发明的其他优选实施方案包含 免疫球蛋白结构域，其包括至少IgM的Cμ1，Cv2，Cμ3，或Cμ4结构域。

本领域的技术人员应该理解免疫球蛋白由大约100-110个氨基酸残基 的结构域组成。这些多样的结构域在本领域中是众所周知，且具有已知的 边界。通过现代分子生物学，可以轻易地完成单一结构域的去除以及利用 另一个抗体分子的结构域对其进行的替代。所述结构域是球状结构，其通 过链内二硫键稳定。这赋予其离散的形状，并且使所述结构域成为自给自 足(self-contained)的单位，其可以被其他相似形状的结构域取代或交换。

重链嵌合免疫球蛋白

不同的方面和实施方案预期嵌合毒素受体分子来源于不同的重链免 疫球蛋白同种型，其中所述嵌合毒素受体分子中的免疫球蛋白结构域包含 重链。本领域的技术人员应该理解利用分子技术，这些结构域可以取代相 似的结构域，并且由此产生这样的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白是两个不 同免疫球蛋白分子间的杂合体。这些嵌合免疫球蛋白容许构建免疫黏附 素，所述免疫黏附素含有多种不同并且需要的性质，该性质是由不同的免 疫球蛋白结构域所赋予的。

在某些实施方案中，嵌合毒素受体分子含有来自两种不同人免疫球蛋 白重链同种型的结构域。

在一些实施方案中，嵌合重链免疫球蛋白含有部分IgA或IgM，其负 责J链与IgA和IgM的联合。因此，通过使用嵌合毒素受体分子中的嵌合 免疫球蛋白，J链可以与嵌合免疫球蛋白联合，所述嵌合免疫球蛋白是不 与J链或分泌性元件结合的同种型的特优种。

预期了来源于诸如人、小鼠或其他哺乳动物物种的嵌合重链免疫球蛋 白。本发明预期了嵌合重链免疫球蛋白，其含有来源于至少两种不同哺乳 动物免疫球蛋白同种型的免疫球蛋白结构域。通常，任何哺乳动物免疫球 蛋白可以用在优选的实施方案中，如下列同种型：任意的IgG同种型，任 意的IgA，IgE，IgD或IgM同种型。本发明还预期了嵌合分子，其含有来 源于两种不同啮齿动物或灵长类动物免疫球蛋白同种型的免疫球蛋白结 构域。所述啮齿动物或灵长类动物免疫球蛋白同种型是本领域中众所周知 的。

本发明的嵌合分子可以含有免疫球蛋白来源的重链，其含有下列免疫 球蛋白结构域中的至少一个：小鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgE， 或IgD的CH1，CH2，或CH3结构域；小鼠IgE或IgM的CH1，CH2，CH3 或CH4结构域；人IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，或IgD的CH1 结构域；人IgM或IgE的CH1，CH2，CH3，CH4结构域；哺乳动物IgG同 种型，IgA，IgE，或IgD同种型的CH1，CH2，或CH3结构域；哺乳动物IgE 或IgM的CH1，CH2，CH3或CH4结构域；啮齿动物IgG，IgA，IgE，或IgD 同种型的CH1，CH2，或CH3结构域；啮齿动物IgE或IgM的CH1，CH2， CH3或CH4结构域；动物IgG同种型，IgA，IgE，或IgD同种型的CH1，CH2， 或CH3结构域；和动物IgE或IgM的CH1，CH2，CH3，或CH4结构域。

本发明还预期将来源于这样的分子的蛋白质结构域替代和添加到嵌 合分子中，所述分子是免疫球蛋白超家族的成员。属于免疫球蛋白超家族 的分子具有与免疫球蛋白同源的氨基酸残基序列和核酸序列。通过氨基酸 或核酸序列的同源性可以识别作为免疫球蛋白超家族一部分的分子。参 见，例如免疫球蛋白基因(Immunoglobulin Genes)的第361页，学术出 版社(Academic Press)(1989)。

轻链免疫球蛋白

本文所述的部分免疫球蛋白轻链是足以增高所表达的嵌合毒素受体 稳定性的部分免疫球蛋白轻链。优选地，本发明的轻链包括至少恒定区或 至少部分恒定区，其足以变得与本文所述的任意重链联合。因此，该链可 以含有小于完整的结构域。轻链可以是λ或κ链。

可以调节与轻链共价连接的毒素受体的特性，从而影响嵌合毒素受体 蛋白/免疫黏附素的亲和性和亲和力。例如，如果与轻链共价连接的毒素受 体是与重链所联合的相同的毒素受体，相同的但由于不同受体结构域的存 在具有不同氨基酸序列的毒素受体，或对该相同毒素备选的受体，则它可 以增加嵌合毒素受体蛋白的亲和力。备选地，轻链可以与另一个毒素的受 体共价连接，由此创建适合用作多种毒素诱杀剂的嵌合毒素受体蛋白。

轻链结构域和可变结构域之间的联合可以通过任何种类的键来实现。 例如，该键可以是挠性的多肽连接体，如(Gly3Ser)3连接体。

预期如本文所述的轻链还可以存在于那些与对本发明重链所描述的 相似变体中。例如，轻链恒定区可以来源于不同的生物体或物种。

毒素受体和免疫球蛋白复合物之间的连接

免疫球蛋白复合物和毒素受体之间的连接可以通过轻链和毒素受体 之间的联合，更优选地重链和毒素受体之间的联合，以及最优选地这两种 联合来实现。这些联合可以通过任意类型的连接，该连接为本文所述的免 疫黏附素作为受体诱杀剂使用提供足够的挠性。优选地，所述连接是共价 的，例如共价肽键。

例如，所述连接可以是天然氨基酸序列，如在IgG，IgD，和IgA的CH2 和CH3之间发现的免疫球蛋白铰链，或挠性的合成多肽连接体，诸如 (Gly3Ser)3连接体或(Gly4Ser)3。一个嵌合毒素受体可以含有任意数量的不 同类型连接体。

免疫黏附素

本发明还包括免疫黏附素，其为包含至少一种嵌合毒素受体蛋白的多 肽。在一些实施方案中，本文所述的免疫黏附素还包含J链和/或分泌性元 件。在其他实施方案中，免疫黏附素包含多于一种嵌合毒素受体蛋白。

J链

除嵌合毒素受体蛋白外，本发明的免疫黏附素可以包含与免疫球蛋白 来源的重链连接的J链。在优选的实施方案中，本发明的免疫黏附素包含 2或3种嵌合炭疽毒素受体蛋白和与至少一种嵌合蛋白结合的J链。本领 域描述并已知J链。参见，例如，M.Koshland，免疫球蛋白助手：J链(The Immunoglobulin Helper：The J Chain)，在免疫球蛋白基因(Immunoglobulin Genes)中，学术出版社(Academic Press)，伦敦(London)，第345页，(1989) 和Matsuuchi等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)， 83：456-460(1986)。在美国多种数据库中可以获得J链的序列。

分泌性元件

免疫黏附素还可以具有与嵌合毒素受体蛋白联合的分泌性元件。该联 合可以通过氢键、二硫键、共价连接、离子相互作用或这些不同键的组合 实现。

本发明预期来自不同物种，包括人、大鼠、兔、牛等的分泌性元件的 应用。这些分子的核苷酸序列是本领域中众所周知的。例如，美国专利号 6,046,037含有许多序列，并将该专利引入本文作为参考。本发明含有分泌 性元件、嵌合炭疽受体蛋白和J链的免疫黏附素典型地通过下列各项之一 键合在一起：氢键、二硫键、共价连接、离子相互作用或这些键的组合。

多聚体免疫黏附素

本发明还预期包含多于一个受体蛋白分子的免疫黏附素，例如，它们 可以含有嵌合毒素受体分子，其为单体单位且不与其他嵌合毒素受体分子 二硫键合。在优选的实施方案中，免疫黏附素确实含有与其他嵌合毒素受 体分子联合形成二聚体和其他多价分子的嵌合毒素受体分子。典型地，由 于嵌合分子免疫球蛋白部分的联合，嵌合毒素受体分子以二聚体形式存 在。嵌合毒素受体分子的免疫球蛋白部分容许两个嵌合炭疽毒素受体分子 联合，从而形成二聚体分子，该二聚体分子具有两个由毒素受体蛋白部分 组成的活性结合部分。在优选的实施方案中，二聚作用通过二硫键合实现， 所述二硫键合通常发生在作为天然存在免疫球蛋白分子的一部分的免疫 球蛋白结构域之间。本领域的技术人员应该理解这些通常存在于天然免疫 球蛋白分子中的二硫键在仍然维持其形成嵌合毒素受体分子二聚体能力 的同时，可以被修饰、移动和去除。

在一些优选的实施方案中，免疫黏附素的多聚体形式应该具有4个嵌 合毒素受体分子，其中2个来源于毒素受体和免疫球蛋白重链融合的嵌合 毒素受体分子是相互二硫键合的，并且每个所述二硫键合的嵌合毒素分子 也同样地与来源于毒素受体和免疫球蛋白轻链融合的其他嵌合毒素受体 分子二硫键合，由此形成四聚体结构。如果所述四聚体嵌合毒素受体分子 的免疫球蛋白重链来源于IgA分子，则添加J链容许形成含有2种上述每 种四聚体结构的复合物和具有8个嵌合毒素受体分子的复合物。

在其他优选的实施方案中，由于J链和嵌合毒素受体分子的免疫球蛋 白部分的联合，免疫黏附素含有嵌合毒素受体分子的多聚体形式。J链和 2个嵌合毒素受体分子的二聚体的联合容许免疫黏附素四聚体形式形成。 在优选的实施方案中，嵌合毒素受体分子的免疫球蛋白部分来源于IgA分 子，且添加J链容许含有4个嵌合毒素受体分子和4个结合位点的四聚体 复合物的形成。在其他优选的实施方案中，该嵌合分子的免疫球蛋白重链 部分来源于IgM，且可以形成含有10或12个分子的多价复合物。在其他 优选的嵌合毒素受体分子使用嵌合免疫球蛋白重链的实施方案中，嵌合毒 素受体分子可以通过来自IgA或IgM的负责J链结合的结构域形成二聚体 或其他更高级的多价复合物。在其他嵌合免疫球蛋白分子中，可以将负责 两个免疫球蛋白重链之间的二硫键合和/或免疫球蛋白轻链和重链之间的 二硫键合的部分免疫球蛋白置于嵌合免疫球蛋白分子中，从而容许二聚体 或其他更高级的多价复合物的形成。

植物特异性糖基化

在本发明的某些实施方案中，通过产生具有植物特异性糖基化的蛋白 质的方法表达上述免疫黏附素和嵌合毒素受体蛋白。本领域中众所周知， 糖基化是真核细胞，包括植物、哺乳动物和昆虫细胞中蛋白质的主要修饰 (Lerouge等，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)38：31-48，1998)。 糖基化过程通过将前体寡糖共翻译转移到新生多肽链的特异性残基，起始 于内质网中。由于糖蛋白从内质网移动到其最终目的地，所以将该寡糖向 不同类型聚糖的加工发生在分泌性途径中，所述不同类型的聚糖在存在的 残基的类型和该残基间的键的性质方面不同。本领域的技术人员应该理解 在它们成熟结束时，在植物或植物细胞中表达的蛋白质具有与在其他类型 细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞中表达的蛋白质不同的糖基化模式。 进行了这样的具体研究，所述研究表征植物特异性糖基化并将其与其他细 胞类型中的糖基化进行比较，例如在Cabanes-Macheteau等，糖生物学 (Glycobiology)9(4)：365-372(1999)，和Altmann，糖缀合杂志 (Glycoconjugate J.)14：643-646(1997)所述的研究中。这些小组以及其他 小组显示了植物特异性糖基化产生聚糖，其具有连接(β(1，2))到甘露糖的木 糖，但是作为哺乳动物和昆虫细胞中糖基化的结果，木糖不连接(β(1，2))到 甘露糖。植物特异性糖基化导致连接(α(1，3))到邻近的GlcNAc的海藻糖， 而哺乳动物细胞中的糖基化导致连接(α(1，6))到邻近的GlcNAc的海藻糖。 此外，植物特异性糖基化不导致向蛋白质聚糖末端添加唾液酸，反之，在 哺乳动物细胞的糖基化中，添加了唾液酸。

已知形成本发明免疫黏附素和嵌合毒素受体蛋白的所有多肽的氨基 酸序列。本领域的技术人员应该知道糖基化位点是三肽Asn-X-Ser/Thr，其 中X可以是除脯氨酸和天冬氨酸外的任何氨基酸(Kornfeld和Kornfeld，生 物化学年度综述(Annu Rev Biochem)54：631-664，1985)。因此本领域技 术人员应该知道哪些形成本文所述蛋白的多肽的氨基酸具有植物特异性 糖基化。

在本发明的其他优选方面和实施方案中，具有植物特异性糖基化的免 疫黏附素进一步包含与所述嵌合分子联合的J链和分泌性元件。由于对于 嵌合分子是正确的，所以本领域的技术人员能够识别J链和分泌性元件序 列中的植物特异性糖基化位点。

如果需要，通过添加序列可以修饰植物特异性糖基化，所述序列将形 成嵌合毒素受体蛋白的产生植物的多肽和免疫黏附素的翻译后加工指引 到除内质网以外的位点，从而导致修饰的翻译后糖基化，其中基本 (substantively)减少或消除了木糖和海藻糖键。向编码免疫球蛋白C末 端的序列添加KDEL导致这种类型的修饰糖基化。

在本发明的其他优选方面和实施方案中，可能需要消除N连接的或O 连接的糖基化或者这两种形式的糖基化，特别是如果功能性嵌合毒素受体 蛋白/免疫黏附素产物不需要Fc受体的相互作用来预防或提供治疗病毒、 细菌、真菌或由此产生的毒素分子的致病作用或在施用了该产物的受试者 中存在的其他致病作用的方法。

功能性衍生物

本文还提供免疫黏附素和嵌合毒素受体蛋白的功能性衍生物。“功能 性衍生物”意指本发明多肽或核酸的“化学衍生物”，“片段”或“变体”， 其保持至少部分该蛋白质功能，例如与特异于该蛋白质的抗体的反应性， 酶活性或结合活性，从而允许它按照本发明的效用。本领域众所周知地， 由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸序列可以编码相同的氨基酸序 列。同样本领域众所周知地，可以进行氨基酸的保守改变，从而得出保持 其原始功能性的蛋白质或多肽。在这两种情形中，本公开意欲包含所有的 改变。

按照常规方法，也可以改造衍生物，从而包含亲和性纯化标记物，以 便可以产生大量和/或相对纯净或独立量(isolated quantity)的免疫黏附素。 存在许多不同的标记物形式，所述标记物形式可以被引入一种或多种免疫 黏附素成分中，优选地，在缺乏标记的条件下，不破坏所需的免疫黏附素 结合活性。可以将所述标记物改造为可表达的编码核酸序列，其与编码本 发明的免疫黏附素的核酸序列融合。可以进一步将标记物改造为可去除 的，例如，利用可商业购买的酶。

此外，可能删除密码子或用除简并密码子以外的密码子取代一个或多 个密码子，从而产生结构上修饰的多肽，而其具有与由未修饰核酸分子产 生的多肽基本相同的效用和活性。如在本领域所公认地，这两种多肽在功 能上可以与引起它们产生的两种核酸分子等价，即使该核酸分子间的区别 与遗传密码简并性无关。

可以实现这种类型的操作以及生产后的化学衍生化作用，例如，从而 改良稳定性、溶解性、吸收，生物的或治疗作用，和/或生物半衰期。公开 了能够介导所述作用的部分，例如在Remington′的制药科学 (Pharmaceutical Sciences)，第18版，马克出版社公司(Mack Publishing Co.)，Easton，Pa.(1990)中。本发明范围内所倾向的功能性衍生物是“变体” 多肽，其与天然多肽相比，缺乏一个或多个氨基酸或含有另外的或取代的 氨基酸。该变体可以来源于天然存在的复合物成分，其通过适当修饰蛋白 质DNA编码序列，从而在C末端、N末端和/或天然序列内一个或多个位 点处添加、去除和/或修饰一个或多个氨基酸的密码子实现。如上所述，理 解所述具有添加的、取代的和/或另外的氨基酸的变体保持天然蛋白质的一 个或多个表征部分。

利用本领域普通技术人员所熟知的标准技术可以制备具有删除的、插 入的和/或取代的氨基酸残基的蛋白质功能性衍生物。例如，利用位点定向 的诱变技术可以产生功能性衍生物的修饰成分(如由Adelman等，1983， DNA 2：183所例证的)，其中利用如上所述的那些技术修饰DNA编码序列 中的核苷酸，以便产生修饰的编码序列，并且随后在原核或真核宿主细胞 中表达该重组DNA。备选地，利用本领域所熟知的方法，通过直接的化 学合成可以方便地制备具有氨基酸删除、插入和/或取代的蛋白质。典型地， 所述蛋白质的功能性衍生物表现出与天然蛋白质相同性质的生物活性。

另外，本发明的免疫黏附素可以不仅是嵌合受体蛋白/Ig免疫黏附素， 还可以包含其他天然受体蛋白质家族成员，同种型和/或其他同源氨基酸序 列，例如人、灵长类动物、啮齿动物、犬、猫、牛、鸟等。此外，用于免 疫黏附素的Ig类型可以改变，例如，可以呈现给定物种之内或之外的不同 Ig家族成员的特性。Ig是多样的，并且具有众所周知的序列，普通技术人 员可以对其进行开发，从而创建不同的免疫黏附素，其在待接受治疗的给 定生物体中具有或多或少的不同效用。例如，具有ICAM-1同源性的分子 实例的例证性非详尽列表包括下表中的那些，其中所述分子可以用于创建 其他嵌合鼻病毒受体蛋白。

表3

炭疽嵌合毒素受体蛋白和免疫黏附素

本发明还包括嵌合炭疽毒素受体蛋白，其具有与含有免疫球蛋白重链 的免疫球蛋白复合物联合的炭疽毒素受体。任选地，该复合物包含免疫球 蛋白轻链，从而改善稳定性。备选地，该复合物包含与免疫球蛋白轻链或 该免疫球蛋白轻链的片段联合的炭疽毒素受体，在每种情形中均优选地位 于其N末端，从而改善稳定性和/或提供另外的炭疽毒素受体以改善与炭 疽毒素的结合。

炭疽毒素受体蛋白可以与重链、轻链或两者联合。在一些实施方案中， J链和分泌性元件与嵌合炭疽毒素受体蛋白联合，从而形成免疫黏附素。 在其他实施方案中，该嵌合毒素受体蛋白具有植物特异性糖基化。

嵌合炭疽毒素受体蛋白

本文所述的嵌合炭疽毒素受体蛋白含有至少一种炭疽毒素受体蛋白， 其与含有免疫球蛋白重链的免疫球蛋白复合物联合。

炭疽毒素受体

炭疽毒素受体是以这样的亲和性与保护性抗原(PA)结合的任意多肽， 所述亲和性足以容许嵌合炭疽毒素受体蛋白起到受体诱杀剂的作用。

本文所述的炭疽毒素受体可以是在本领域识别的两种内源细胞炭疽 毒素受体之一：炭疽毒素受体/肿瘤内皮标记8(ATR/TEM8)(Bradley等， 2001)和毛细管形态发生因子2(CMG2)(Scobie等，2001)。这两种受体均起 到类型1跨膜蛋白的功能，并且共享共同的性质，如信号肽、细胞外结构 域和单次跨膜区域。通过备选的剪接，预测了若干蛋白同种型，包括可溶 性变体。

本文所述的炭疽毒素受体应该至少含有用于结合PA的功能元件，且 还可以任选地包括更多另外的多肽中的一个(例如，改良炭疽毒素受体作 为受体诱杀剂的应用的多肽)。已经充分地表征了介导ATR和PA结合的 结构域(32-27)。冯维勒布兰德因子类型A结构域(VWA结构域)，也称 为插入整联蛋白的结构域(I结构域)，其含有金属离子依赖性粘附位点 (MIDAS)，该位点似乎是PA和该受体恰当结合的基础。参见Scobie HM， Rainey GJ，Bradley KA，Young JA(2003)人毛细管形态发生蛋白2起到炭 疽毒素受体的功能(Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor).美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA) 100：5170-5174.Bradley KA，Mogridge J，Mourez M，Collier RJ，Young JA (2001)炭疽毒素细胞受体的识别(Identification of the cellular receptor for anthrax toxin).自然(Nature)414：225-229。在优选的实施方案中，炭疽 毒素受体蛋白包含受体完整的细胞外结构域。

在优选的实施方案中，对炭疽毒素受体进行了改造，从而去除蛋白酶 敏感位点。例如，如果炭疽毒素受体是CMG2蛋白，则它优选地缺乏14 个氨基酸，所述氨基酸不是VWA/I结构域的一部分。以下提供这14个氨 基酸序列及其相应的核苷酸序列：

TEILELQPSSVCVG(SEQ ID NO：102)

act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg(SEQ ID NO：103)

肉毒杆菌嵌合毒素受体蛋白和免疫黏附素

本发明还包括嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白，其具有与含有免疫球蛋白 重链的免疫球蛋白复合物联合的肉毒杆菌毒素受体。任选地，该复合物包 含免疫球蛋白轻链，从而改善稳定性。备选地，该复合物包含与免疫球蛋 白轻链或所述免疫球蛋白轻链片段联合的肉毒杆菌毒素受体，在每种情形 中均优选地位于其N末端，从而改善稳定性和/或提供另外的肉毒杆菌毒 素受体以改善与肉毒杆菌毒素的结合。

肉毒杆菌毒素受体蛋白可以与重链、轻链或两者联合。在一些实施方 案中，J链和分泌性元件与嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白联合，从而形成免 疫黏附素。在其他实施方案中，该嵌合毒素受体蛋白具有植物特异性糖基 化。

嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白

本文所述的嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白含有至少一种肉毒杆菌毒素 受体蛋白，与含有免疫球蛋白重链的免疫球蛋白复合物联合。

肉毒杆菌毒素受体

肉毒杆菌毒素受体是以这样的亲和性和亲和力与肉毒杆菌毒素结合 的任意多肽，所述亲和性和亲和力足以容许嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白起 到受体诱杀剂的作用。

存在7种肉毒杆菌毒素(BoNT/A-G)。还必须确定所有肉毒杆菌毒素的 受体和推定的结合结构域，但是本领域技术人员应该理解一旦确定了该受 体，可以对它们进行修饰，从而产生本文所述的嵌合肉毒杆菌毒素受体。

下表提供已知的受体和推定的结合结构域：

表4

  肉毒杆菌   神经毒素   血清型   蛋白   质受   体   推定的结合结构域   参考文献   A                                 SV2A     SV2B     SV2C         氨基酸529-536(小鼠SV2C编号)   SV2A：  NTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLVNSTFLH   NK(SEQ ID NO：104)     SV2B：    DTYFKNCTIESTTFYNTDLYKHKFIDCRFINSTFLE   QK(SEQ ID NO：105)   SV2C：  NTYFKNCTFIDTLFENTDFEPYKFIDSEFQNCSFLH   NK(SEQ ID NO：106)   Dong，M等   (2003)细胞生物     学杂志(J Cell   Biol)162(7)：     1293-1303             B，G             突触   结合     蛋白I   Syt I：    GEGKEDAFSKLKQKFMNELHK(SEQ ID NO：107)   (人Syt I的氨基酸40-60)   Nishiki，等   (1996).FEBS书   信(FEBS Lett)     378：253-257；

尽管一些上述推定的结合结构域边界是对于非人蛋白质的，本领域技 术人员应该能够容易地使用序列比较技术确定对于人蛋白质的类似残基。

本文所述的肉毒杆菌毒素受体应该至少含有用于结合肉毒杆菌毒素 的功能元件，且还可以任选地包括更多另外的多肽中的一个(例如，改良 肉毒杆菌毒素受体作为受体诱杀剂的应用的多肽)。

以下提供了关于肉毒杆菌毒素及其受体的其他参考文献，并引入它们 所讲述的全部内容：

BoNT或双向毒素：

Ahnert-Hilger，G和Bigalke，H(1995).破伤风和肉毒杆菌神经毒素中毒的 分子方面(Molecular Aspects of Tetanus and Botulinum Neurotoxin Poisoning).神经生物学学报(Prog Neurobiol)46：83-96. Arnon，SS，Schecter，R，Inglesby，TV，Henderson，DA，Bartlett，JG，Ascher，MS， Eitzen，E，Fine，AD，Hauer，J，Layton，M，Lillibridge，S，Osterholm，MT， O′Toole，T，Parker，G，Perl，TM，Russell，PK，Swerdlow，DL和Tonat，K(2001) 作为生物武器的肉毒中毒毒素：医学和公共健康管理(Botulism toxin as a biological weapon：medical and public health management).JAMA 283(8)： 1059-1070.还见于：

http://jama.amaassn.org/cgi/content/full/285/8/1059？maxtoshow＝&HITS＝10&hits＝10&RESULTFORMAT＝&fulltext＝botulism&searchid＝1049721556467 1604&storedsearch＝&FIRSTINDEX＝0&journalcode＝jama

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含有嵌合毒素受体蛋白和免疫黏附素的载体、细胞和植物

本发明还预期含有本发明嵌合毒素受体和免疫黏附素的表达和克隆 载体、细胞和植物。分离编码该蛋白质不同部分的基因的技术是本领域技 术人员所熟知的，并且可以应用于向表达载体和克隆载体插入多种需要的 基因，所述表达载体和克隆载体诸如可以引入到真核细胞，包括植物细胞， 植物和转基因植物中的那些载体。

本发明预期一种装配免疫黏附素的方法，其包括下列步骤：向生物体 中引入编码嵌合受体蛋白分子，即J链的DNA片段，和向该相同的生物 体中引入编码分泌性成分的DNA。优选的分泌性元件包含至少一个人类 多聚体免疫球蛋白受体(pIgR)氨基酸残基序列的氨基酸残基1-残基约606 的片段或来自其他物种的类似氨基酸残基(Mostov，发育免疫学年刊(Ann Dev.Immu.)12：63-84 1994)。除前述人pIgR以外可以使用的分泌性元件 序列中是包含至少人类pIgR的氨基酸残基1-约627的片段的那些。

本发明预期包含本发明的嵌合毒素受体和免疫黏附素的真核细胞，包 括植物细胞。本发明还预期包含编码本发明嵌合毒素受体和免疫黏附素不 同成分的核苷酸序列的植物细胞。本领域技术人员应该理解编码分泌性元 件保护蛋白和嵌合受体蛋白分子的核苷酸序列以及J链典型地与启动子可 操作地连接，并且作为表达载体或盒的一部分存在。典型地，如果所使用 的真核细胞是植物细胞，则所使用的启动子是能够在植物细胞中操作的启 动子。将嵌合受体蛋白基因，分泌性元件基因和J链基因分离后，它们典 型地与表达载体中的转录启动子可操作地连接。本发明还预期包含编码嵌 合受体蛋白分子的核苷酸序列的表达载体，所述序列已被可操作地连接于 表达调节序列。这些表达载体在特定细胞中将核苷酸序列放置在启动子序 列的3’，导致核苷酸序列的转录和表达。表达载体还可以含有多种增强子 序列，其提高该转录的效率。另外，可以包含作为终止子，多聚腺苷化作 用(多聚A)位点和其他3’末端加工信号的序列，从而提高特定细胞中转 录的核苷酸序列的量。

在所选生物中成分表达可以来源于独立复制质粒，或来源于染色体的 永久成分，或来源于可以瞬间引起编码该成分的转录子的DNA的任何片 段。适合于转化的生物体可以是原核或真核的。复合物成分的引入可以是 通过直接的DNA转化，通过向生物体中的生物射弹递送的，或由其他生 物体如例如通过植物细胞上重组土壤杆菌作用介导。转基因生物体中蛋白 质的表达通常需要共同引入适当的启动子元件和多聚腺苷化作用信号。在 本发明的一个实施方案中，启动子元件潜在地引起所述成分在所有植物细 胞中的组成性表达。在大多数或全部细胞中发生的组成性表达将确保前体 可以占据这样的细胞内膜系统，所述细胞内膜系统与发生装配可能需要的 相同。

表达载体

与宿主细胞兼容的表达载体，优选地，与植物细胞兼容的用于表达本 发明基因的那些。在植物中有效表达基因的典型表达载体为本领域所熟 知，并且包括来源于诱导肿瘤(Ti)的根癌土壤杆菌质粒的载体，如Rogers 等，酶免疫学中的方法(Meth.in Enzymol.)，153：253-277(1987)所述。然 而，已知若干其他表达载体系统在植物中起作用。参见例如，Verma等，PCT 公开号WO87/00551；和Cocking和Davey，科学(Science)，236：1259-1262 (1987)。

上述表达载体含有表达控制元件，包括启动子。待表达的基因可操作 地与该表达载体连接，从而容许启动子序列指导RNA聚合酶的结合以及 所需多肽编码基因的合成。在表达该基因中有效的是可诱导的、病毒的、 合成的、组成的、和受调节的启动子。如本领域所熟知地，对使用哪个表 达载体以及编码本发明部分免疫黏附素的核苷酸序列最终可操作地连接 于哪个启动子的选择直接依赖于所需要的功能性质，例如蛋白质表达的位 置和时间，且依赖于待转化的宿主细胞，这些是构建重组DNA分子技术 中固有的限制。然而，有效实践本发明的表达载体至少能够指导复制，且 优选地还能够指导多肽编码基因的表达，所述多肽编码基因包括在与其可 操作地连接的DNA片段中。

在优选的实施方案中，用于表达所述基因的表达载体包含选择标记， 其在植物细胞中有效，优选地是药物抗性选择标记。优选的药物抗性标记 是这样的基因，所述基因的表达导致卡那霉素抗性，即含有胭脂氨酸合成 酶启动子，Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂氨酸合成酶3’非翻译区域的嵌 合基因，如Rogers等，在植物分子生物学方法(Methods For Plant Molecular Biology)，a.Weissbach和H.Weissbach，eds.，学术出版社公司(Academic Press Inc.)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚(Calif.)(1988)中所述。 有效的植物表达载体可以购自Pharmacia，Piscataway，N.J。在美国专利号 5,188,642；5,349,124；5,352,605，和5,034,322中描述了在植物中表达异种 蛋白的表达载体和启动子，将这些文献引入本文所有参考。

表达载体的结构

已经开发了多种通过互补粘性末端有效地将DNA连接于载体的方法。 例如，可以将互补同聚物踪迹加入到DNA片段中，所述DNA片段将被插 入载体DNA中。然后通过互补同聚物尾部之间的氢键连接载体和DNA片 段，从而形成重组的DNA分子。备选地，含有一个或多个限制性核酸内 切酶位点的合成连接体可以用于连接DNA片段和表达载体。通过在酶的 存在下用过量合成连接体分子培养平端DNA片段，该合成连接体附着于 平端DNA片段，所述酶能够催化平端DNA分子的连接反应，诸如抗菌素 T4DNA连接酶。因此，该反应的产物是在其末端携带合成连接体序列的 DNA片段。然后用适当的限制性核酸内切酶分裂这些DNA片段，并且将 其连接到经酶分裂的表达载体中，所述酶产生与合成连接体末端兼容的末 端。含有多种限制性核酸内切酶位点的合成连接体可以从许多来源购买， 包括新英格兰生物实验室(New England BioLabs)，Beverly，Mass。

将编码本发明的分泌性元件，J链和嵌合受体蛋白分子的核苷酸序列 直接地或通过下列步骤引入到相同的植物中，所述步骤是：将每种成分引 入植物细胞并再生植物，以及交叉杂交不同的成分，从而产生含有全部所 需成分的最终植物细胞。

嵌合毒素受体和免疫黏附素的表达

可以使用任意方法将编码本发明嵌合毒素受体和免疫黏附素组分的 核苷酸序列引入到真核细胞中。例如，用于将基因引入到植物的方法包括 土壤杆菌介导的植物转化，原生质体转化，向花粉内基因转移，向生殖器 官的注射和向未成熟胚芽的注射。这些方法中的每种均具有不同的优点和 劣点。因此，一个将基因引入特定真核细胞或植物物种的特定方法可能不 必然对其他真核细胞或植物物种最有效。

植物

例如，用于将基因引入植物的方法包括土壤杆菌介导的植物转化，原 生质体转化，向花粉内基因转移，向生殖器官的注射和向未成熟胚芽的注 射。这些方法中的每种均具有不同的优点和劣点。因此，一个将基因引入 特定真核细胞或植物物种的特定方法可能不必然对其他真核细胞或植物 物种最有效。

可以以瞬时方式将基因引入到植物细胞中，将所述瞬时方式设计为在 不永久地或稳定地改变植物或其后代基因组的条件下快速产生兴趣蛋白。 可以如何实现这些瞬时表达的一个实例是通过下列步骤：利用含有二重 (binary)载体中的一个或多个兴趣基因的根癌土壤杆菌混悬液对完整植 物叶片中细胞间气室进行渗透，并收获所述叶片，从而在之后某时提取蛋 白质。Voinnet O，Rivas S，Mestre P，Baulcombe D(2003)植物中增强的瞬时 表达系统基于通过番茄从缩病毒p19蛋白对基因沉默的抑制(An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19protein of tomato bushy stunt virus).植物杂志(The Plant Journal) 33：949-956。

根癌土壤杆菌介导的转移是可以广泛应用的向植物细胞引入基因的 系统，其原因在于它避开了对从原生质体再生完整植物的需要，可以向完 整植物组织中引入DNA。土壤杆菌介导的表达载体向植物细胞引入DNA 的应用为本领域所熟知。参见，例如，Fraley等，生物技术(Biotechnology)， 3：629(1985)和Rogers等，酶学中的方法(Methods in Enzymology)， 153：253-277(1987)中所描述的方法。此外，Ti-DNA的整合是相对准确的 过程，其引起较少的重排。如Spielmann等，分子常规遗传学(Mol.Gen. Genet.)，205：34(1986)和Jorgensen等，分子常规遗传学(Mol.Gen.Genet.)， 207：471(1987)所述，通过边缘(border)序列定义待转移的DNA区域， 并且通常将干扰DNA插入到植物基因组中。最新的(modem)土壤杆菌 转化载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中复制，这容许如Klee等，在植物 DNA传染性试剂(Plant DNA Infectious Agents)，T.Hohn和J.Schell，eds.， Springer-Verlag，纽约(New York)，第179-203页(1985)中所述的便利操 作。关于用于土壤杆菌介导的基因转移载体的更新技术进展已经改善了载 体中基因和限制性位点的排列，从而促进载体的构建，该载体能够表达多 种多肽编码基因。在Rogers等，酶学方法(Methods in Enzymology)， 153：253(1987)中所述的载体为了直接表达插入的多肽编码基因，具有便利 的多聚连接体区域，其侧接启动子和多聚腺苷化作用位点，并且适合于该 目的。

在土壤杆菌介导的转化在其中有效的那些植物物种中，由于基因转移 表面的和确定的性质，土壤杆菌介导的转化是选择的方法。土壤杆菌介导 的叶盘和其他组织的转化似乎受到根癌土壤杆菌天然感染的植物物种的 限制。因此，土壤杆菌介导的转化在双子叶植物中最有效。

很少有单子叶植物看起来是土壤杆菌的天然宿主，尽管如Bytebier等， 美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，84：5345(1987)所述已 经利用土壤杆菌载体在芦笋中产生了转基因植物。因此，必须利用其他方 法转化商业上重要的粮谷，如稻米、玉米和小麦。利用基于磷酸钙沉淀， 聚乙二醇处理，电穿孔，以及这些处理的组合方法可以实现植物原生质体 的转化。参见，例如Potrykus等，分子常规遗传学(Mol.Gen.Genet.)， 199：183(1985)；Lorz等，分子常规遗传学(Mol.Gen.Genet.)，199：178 (1985)；Fromm等，自然(Nature)，319：791(1986)；Uchimiya等，分子常规 遗传学(Mol.Gen.Genet.)，204：204(1986)；胼胝体等，基因和发育(Genes and Development)，1：1183(1987)；和Marcotte等，自然(Nature)，335：454 (1988)。

这些方法对不同植物物种的应用依赖于从原生质体再生那种特定植 物物种的能力。在下列文献中描述了从原生质体再生谷类的例证性方法： Fujimura等，植物组织培养书信(Plant Tissue Culture Letters)，2：74(1985)； Toriyama等，理论和应用遗传学(Theor Appl.Genet.)，73：16(1986)；Yamada 等，植物细胞报告(Plant Cell Rep.)，4：85(1986)；Abdullah等，生物技术 (Biotechnology)，4：1087(1986)。

为了转化不能成功地从原生质体再生的植物物种，可以使用其他方法 向完整细胞或组织引入DNA。例如，从未成熟胚芽或外植体再生谷类可 以受到如Vasil，生物技术(Biotechnology)，6：397(1988)所述的影响。另 外，可以使用“颗粒枪”或高速显微弹射技术。如Klein等，自然(Nature)， 327：70(1987)；Klein等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.)，85：8502(1988)；和McCabe等，生物技术(Biotechnology)，6：923 (1988)所述，利用所述技术，DNA在小(0.525μm)金属粒子表面上被运 送穿过细胞壁并进入细胞质，已将所述小金属粒子加速到每秒一到数百米 的速度。所述金属粒子穿过细胞的数层，并由此容许组织外植体内的细胞 转化。已经利用金属粒子成功地转化了玉米细胞并产生了可繁殖的，稳定 转化的烟草和大豆植物。组织外植体的转化消除对经过原生质体阶段的需 要，并由此加速了转基因植物的产生。

如Zhou等，酶学中的方法(Methods in Enzymology)，101：433(1983)； D.Hess，细胞学实习综述(Intern Rev.Cytol.)，107：367(1987)；Luo等，植 物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Reporter)，6：165(1988)所述，还可以 通过指导DNA向花粉内的转移将DNA引入到植物中。如Pena等，自然 (Nature)，325：274(1987)所述通过向植物的生殖器官内注射DNA可以获 得多肽编码基因的表达。如Neuhaus等，理论和应用遗传学(Theor.Appl. Genet.)，75：30(1987)；和Benbrook等，在生物发现学报(Proceedings Bio Expo)1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，第27-54页(1986)中所述，还 可以将DNA直接注射到未成熟胚芽和粉状胚芽的再水合细胞中。

植物从单一植物原生质体或多种外植体的再生为本领域所熟知。参 见，例如，植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)， A.Weissbach和H.Weissbach，eds.，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)， 圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚(Calif).(1988)。该再生和生长过程 包括下列步骤：细胞和茎干转化体的选择，转化体茎干的生根和小植物在 土壤中的生长。

如Horsch等，科学(Science)，227：1229-1231(1985)所述，可以获得 含有异源基因的植物的再生，所述异源基因是通过来自叶片外植体的根癌 土壤杆菌引入的。在该步骤中，转化体在选择性试剂的存在下和诱导植物 物种中茎干再生的培养基中生长，所述植物物种是以如Fraley等，美国国 家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，80：4803(1983)所述的方式被 转化的。典型地，该步骤在2-4周内产生茎干，并且然后将这些转化体茎 干转移到适当的诱导根的培养基中，所述培养基含有选择性试剂和抗生素 以防止细菌的生长。然后将在选择性试剂存在下生根形成小植物的转化体 茎干移植到土壤中，从而容许根的生成。这些步骤应该依赖所使用的特定 植物物种而改变，该变化在本领域中是众所周知的。

可以在任何植物细胞中产生本发明的免疫黏附素，所述植物细胞包括 来源于双子叶或单子叶，茄属，紫花苜蓿，豆类，含油种子的植物如红花， 或烟草植物的植物细胞。

可以从任何可有性交配的植物物种产生本发明的转基因植物，其中所 述任何可有性交配的植物物种是可以利用本领域技术人员已知的任意方 法转化的。有效的植物物种是双子叶植物，包括烟草，番茄，豆类，紫花 苜蓿，橡树，和枫树；单子叶植物，包括草，玉米，谷类，燕麦，小麦， 和大麦，和低级植物，包括裸子植物，松类，马尾，石松，地钱，金鱼藻， 苔藓，藻类，配偶体，孢子体或羊齿类。

真核细胞

本发明还预期了在真核细胞，包括哺乳动物细胞中表达嵌合毒素受体 和免疫黏附素。本领域中的技术人员应该理解多种可用于在哺乳动物细胞 中进行表达的系统，并且可以容易地改进那些系统，从而在那些细胞中表 达免疫黏附素和嵌合蛋白受体分子，例如ICAM-1分子。在优选的ICAM 实施方案中，将本发明的嵌合ICAM-1，J链和分泌性元件分子置于载体 pCDM8中，所述载体pCDM8已被预先记述在Aruffo，等，美国国家科学 院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，84：8573-8577(1987)中。PCDM8 构建体的使用决不是唯一的，并且可以利用许多其他真核表达系统，所述 真核表达系统不使用cog细胞表达系统，并且可以与嵌合ICAM-1以及其 他免疫黏附素分子一起使用。

含有嵌合毒素受体和免疫黏附素的组合物

本发明还预期含有本发明的嵌合毒素受体或免疫黏附素以及植物高 分子或材料的组合物。典型地，这些植物高分子或植物材料来源于任意在 本发明中有效的植物。植物高分子在例如，植物细胞中，植物细胞提取物 中，或植物中，与本发明的嵌合毒素受体或免疫黏附素共同存在。组合物 中典型的植物高分子是二磷酸核酮糖羧化酶，光获得复合色素(LHCP)，次 级代谢产物或叶绿素。本发明的组合物除水之外含有质量浓度为0.01％- 99％的植物材料或植物高分子。其他组合物除水之外包括含有质量浓度为 1％-99％的本发明的嵌合毒素受体或免疫黏附素的组合物。其他组合物除 水之外包括质量浓度为50％-90％的嵌合毒素受体或免疫黏附素。

本发明的组合物除水之外可以包括质量浓度为0.1％-5％的植物高分 子。典型地，存在于组合物中的质量由植物高分子和本发明的嵌合毒素受 体或免疫黏附素组成。当本发明的蛋白质以较高或较低的浓度存在时，存 在于组合物中植物高分子的浓度将会相反地改变。在其他实施方案中，植 物高分子组合物除水之外以质量浓度为0.12％-1％存在。

本发明预期了物质组合物，其包括全部或部分下列各项：嵌合蛋白受 体分子，J链或分泌性元件。如前所述，这些组件形成复合物，并且是联 合的。典型地，组合物还含有来源于植物的分子。还可以在产生功能性嵌 合毒素受体或免疫黏附素以及植物来源的分子的提取步骤后，获得该组合 物。

提取方法包括以下步骤：向含有复合物的植物施力，由此植物的质外 体区室破裂释放所述复合物。该力涉及诸如释放质外体液的主要方法的切 力。所述完整植物或植物提取物含有嵌合毒素受体/免疫黏附素和多种其他 植物高分子的混合物。包含在该混合物中的高分子之一是二磷酸核酮糖羧 化酶(RuBisCo)或RuBisCo的片段。另一种高分子是LHCP。另一种分子 是叶绿素。其他制备组合物的有效方法包括用多种溶剂的提取和对植物材 料使用真空装置。本发明的组合物除水之外可以含有质量浓度约0.1％- 5％的植物高分子。

本发明还预期植物来源分子和动物来源分子的相对比例可以改变。除 水之外，特异性植物蛋白，如RuBisCo或叶绿素的质量的可以低至提取物 质量的0.01％，或高至99.9％。

本发明还预期治疗组合物，其可以用于患者或动物的治疗中。可以在 从植物或其他转基因生物体中提取之前或之后施用所述治疗组合物。一旦 经提取，嵌合毒素受体/免疫黏附素还可以进一步通过常规技术，如尺寸排 除，离子交换，或亲和层析法纯化。植物分子可以与所述复合物共同施用。

本发明还预期治疗植物提取物在不进行进一步特异性治疗成分纯化 的条件下的直接应用，所述治疗植物提取物含有嵌合毒素受体/免疫黏附 素。施药可以通过局部施用，口服摄取，鼻内喷雾或任何其他适于向粘膜 靶病原体递送嵌合毒素受体/免疫黏附素的方法。

药物组合物，剂型和施药途径

本发明所述的嵌合毒素受体/免疫黏附素可以优选地，以合适的药物组 合物的形式施用于患者。这些组合物可以包括除上述那些之外的，或代替 上述那些的成分。施用时，所述组合物优选地表现出治疗和预防特性之一 或全部二者。所述组合物的制备可以按照本领域的常规方法学进行，并且 可以采用多种形式中的任何一种，例如液体溶液，混悬液或乳化剂，和适 合于摄取前液体中内含物的固体形式。多肽和蛋白质剂型和施药技术可见 于雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，马克出版公司 (Mack Publishing Co.)，Easton，Pa.，最近期的版本。利用这些步骤，普通 技术人员在不进行过度试验的条件下，可以使用本发明的免疫黏附素获得 成功。

施药途径

对本发明合适的施药途径包括，例如，口服，鼻内，吸入，眼内，咽 喉，支气管，穿粘膜，静脉内，肌肉内，腹膜内或肠内施药。备选地，可 以以局部方式，例如通过注射或化合物的其他施用，将所述化合物施用到 优选的作用位点。

剂型

本发明的药物组合物可以以一种自身已知的方式，例如通过常规的混 合，溶解，粒化，糖衣化，粉碎，乳化，胶囊化，包埋或冻干步骤制造。 一种或多种包含赋形剂和/或其他辅助剂的生理可接受载体可以用于促进 将活性化合物处理为药物制剂。适当的剂型依赖于选择的特殊施药途径。

为了注射，可以将本发明的试剂配制在水性溶液中，优选地在生理相 容性缓冲液，如Hanks′s溶液，Ringer′s溶液或生理盐水缓冲液中。

为了穿粘膜施药，在该剂型中使用了适合于穿透屏障的渗透剂。所述 渗透剂在本领域中普遍已知。

为了口服施药，所述化合物可以通过组合活性化合物和本领域熟知的 药用载体而容易地配制。所述载体能够将本发明的化合物配制为片剂、丸 剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、泥浆、混悬液等，从而被待治疗 的患者口服摄取。合适的载体包括赋形剂，诸如例如，填充剂，诸如糖， 例如乳糖、蔗糖、甘露糖和/或山梨糖；纤维素制剂，诸如，例如玉米淀粉、 小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基 甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要， 可以加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，如 褐藻酸钠。

向糖衣丸剂核(dragee core)提供合适的包衣。为了这个目的，可以 使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷 酮，卡伯波(carbopol)凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和合 适的有机溶剂或溶剂混合物。为了识别或表征不同的活性化合物剂量组 合，可以向片剂或糖衣丸剂的包衣中添加染料或色素。

可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推适(push-fit)胶囊，以 及由明胶和可塑剂，诸如甘油或山梨糖制成的软密封胶囊。所述推适胶囊 可以含有与下列物质混合的活性成分，所述物质为：填充剂，如乳糖，粘 合剂，如淀粉，和/或润滑剂，如滑石或硬脂酸镁，以及任选地，稳定剂。 在软胶囊中，活性化合物可以溶解于或混悬于合适的液体中，诸如脂肪油， 液体石蜡，或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。所有用于口服施药 的剂型应该处于适合该施药的剂量。

为了颊含施药，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的 形式，或处于水溶凝胶的形式。

为了通过吸入施药，用于按照本发明使用的化合物可以在使用合适的 推进剂的条件下，以气雾剂喷雾传递的形式便利地从受压的包装或喷雾器 中释放出，所述推进剂例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷， 二氧化碳或其他合适的气体。在受压气雾剂的情形中，剂量单位可以通过 提供定量释放阀确定。可以将在呼吸器或吹药器中使用的胶囊和盒例如明 胶配制为含有所述化合物和合适的粉末基底如乳糖或淀粉的粉末混合物。

备选地，在使用前，活性成分为了与合适的媒介物，例如无致热原的 无菌水构建，可以处于粉末形式。

另外，还可以将所述化合物配制为储存制剂。这种长期起作用的剂型 可以通过移植(例如，皮下地或肌肉地)或通过肌肉注射施用。因此，例 如，可以用下列物质配制所述化合物，所述物质为：合适的聚合或疏水性 材料(例如，如可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂，或如保守的可 溶性衍生物，例如，如保守的可溶性盐。

另外，利用持续释放系统，如含治疗试剂的固体疏水性聚合体的半透 明基质，可以递送所述化合物。已经确定了多种持续释放材料，并且这些 材料是本领域技术人员所熟知的。依赖于其化学性质，持续释放胶囊可以 释放所述化合物几周到长达超过100天。依赖于所述治疗试剂的化学性质 和生物稳定性，可以使用另外的蛋白质稳定方案。

所述药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶状态的载体或赋形剂。 所述载体或赋形剂的实例包括但不仅限于碳酸钙，磷酸钙，多种糖，淀粉， 纤维素衍生物，明胶，和聚合体，如聚乙二醇。

利用许多酸可以形成药物相容盐，所述酸包括，但不仅限于盐酸，硫 酸，乙酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸，柠檬酸等。盐倾向于更易溶 于水性或其它质子溶剂中，其为相应的自由碱形式。在溶液中，也常规地 使用对pH的操作。从而最优化所需的特性。

确定有效剂量和剂量方案

适合于用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中含有有效实 现预期目标，例如治疗和/或预防应用的量的活性成分。药物有效量意指有 效预防，减轻或改善疾病症状或延长被治疗受试者生存的化合物的量。药 物有效量的确定是完全处于本领域技术人员能力范围内的，并且典型地假 定约0.5pg/kg/天-约500g/kg/天的量，其具有典型地包含约1纳克-几 克免疫黏附素的单次剂量。

对于用于本发明的方法中的任意化合物，可以最初从细胞培养测定估 算治疗有效剂量。例如，对不同的动物或细胞培养可以施用不同的剂量， 并比较其作用。在该方法中，可以确定所需的浓度范围，并相应地制备和 施用所述量。最优化对本领域的普通技术人员是常规的。

技术人员除了考虑药物功效，还根据细胞培养或试验动物中标准药物 程序，例如确定LD50(致死种群50％的剂量)和ED₅₀(有效治疗种群50％ 的剂量)考虑毒性。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以 将其表达为LD₅₀和ED₅₀之间的比例。表现出高治疗指数的化合物是优选 的。获自这些细胞培养测定和动物研究的数据可以用于配制用于人类的剂 量范围。所述化合物的剂量优选地处于包括具有很少或无毒性的ED₅₀的 浓度范围内。依赖于使用的剂型和利用的给药途径可以在该范围内改变剂 量。准确的剂型、施药途径和剂量可以由各个医师鉴于患者的病症进行选 择(参见例如，Fingl等，1975，在“治疗学的药理学基础”(″The Pharmacological Basis of Therapeutics，″)第1章，第1页中)。

可以调节剂量用量和频率，从而提供嵌合毒素受体或免疫黏附素的循 环水平，其足以维持或提供药物作用，例如治疗和/或预防。最小有效浓度 (MEC)对每种剂型不同，但是可从体外和/或体内数据估算。获得MEC 所必须的剂量依赖于个体特征和施药途径。然而，如本文所述的测定可以 用于确定循环浓度，可以将所述循环浓度再进一步最优化为用量和准确的 剂型。

还可以利用MEC值确定剂量间隔。可以利用这样的方案施用化合物， 所述方案在10-90％的时间，30-90％的时间，或最优选地50-90％的时间内， 维持循环水平高于MEC。

如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配装置中，所述包装或分 配装置含有一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。包装可以例如包括 金属或塑料薄片，如水泡包装。包装或分配装置可以附加施药说明。包装 或分配装置还可以附加公告，该公告以由管理医药品制造、使用或销售的 政府机构规定的形式，与包装容器联合，该公告反映了由该机构批准用于 人或兽医施药的免疫黏附素形式。所述公告，例如，可以是由美国食品和 药品管理局批准的处方药的标签，或批准的产品的插入物。还可以制备包 含在相容药物载体中配制的本发明化合物的组合物，将其置于适当的容器 中，并且为治疗指定的病症进行标记，例如治疗或预防由宿主有机体/患者 蛋白受体分子介导的疾病。

治疗和预防感染的方法

可以对需要本发明的治疗和/或预防性嵌合毒素受体/免疫黏附素的患 者，例如为了反击炭疽感染，施用药物有效量的所需的嵌合毒素受体/免疫 黏附素，优选地作为如上述确定、生产和施用的药物组合物的一部分。这 些剂型和递送形式可以广泛地改变。以下所述的是可以用于推断有效量和 毒性的初步程序，并且可以再将其便利地用于确定人和其他动物中治疗和 预防参数和方案。这些程序仅仅是例证性的，且不意欲成为本发明的限制。 此外，这些程序对于本领域普通技术人员是常规的。

嵌合毒素受体/免疫黏附素降低人中的传染性的能力：剂量扩大耐受性研究

例如，利用随机化对照试验，可以测试本发明的嵌合毒素受体/免疫黏 附素，从而确定施药，例如静脉内或肌肉施药对感染的作用。可以使用其 他施药途径。存在多种可以用于监测作用的测定。这些研究可以估算被患 者受试者摄取的嵌合毒素受体/免疫黏附素可以治疗或预防感染的程度。例 如，可以向感染的和暴露但未感染的受试者施用嵌合毒素受体/免疫黏附 素，并且对其评估一段时间疗程，从而估计其与相似的感染的或暴露但未 治疗的受试者相比的疾病发展。

可以将本发明的嵌合毒素受体/免疫黏附素配制为内部具有变化量的 嵌合毒素受体/免疫黏附素的缓冲盐水，并且以多种时间间隔将其施用于患 者。单次增加剂量和多次增加剂量研究可以用于评估免疫黏附素的安全 性。在每种情形中，在每种剂量水平可以评估一名或多名受试者，一些接 受免疫黏附素，且一名或多名任选地接受安慰剂。在每种研究中，可以评 估多剂量水平。剂量水平可以改变，但是典型地在纳克-克的范围内。

可以在数秒、数分钟、数小时、数周和数月中施用剂量，且评估其毒 性和/或药物作用。

可以估计安全性和毒性，例如，通过表观检查鼻黏膜的刺激或发炎的 信号。血液安全性评估还可以根据常规方法使用，并且利用敏感测定，如 ELISA确定多种血液成分，包括循环免疫黏附素和鼻病毒的量。根据常规 方法学，可以相似地进行鼻灌洗测试。

可以使用常规统计学分析和计算，从而确定对单一患者和/或患者接受 者群经过一段时间疗程所预测的功效和毒性。

如果受到嵌合毒素受体蛋白靶向的病原体，例如炭疽细菌和炭疽孢 子，在对照临床试验中不能被合乎规格地施用给人类受试者，则可以用试 验方法在适当的动物物种中确定在人类中计划的剂量功效，所述适当的动 物物种可以包括暴露于炭疽细菌或孢子的灵长类动物物种。通过在不同的 嵌合毒素受体蛋白施药浓度和途径下接受治疗和对照动物的存活可以确 定有效剂量。可以从受试者获取血清、粘液和/或组织样品，从而确定所施 用的嵌合毒素受体蛋白的药物动力学和药效学，且从该数据可以确定保护 动物受试者的嵌合毒素受体蛋白的最小有效浓度和施药途径。为了确定对 于人受试者的最小有效浓度，可以通过与上述动物受试者试验中确定为有 效的相同施药途径，将嵌合毒素受体蛋白给药于正常男性和女性受试者， 并且应该从这些人类受试者中获取血清、粘液和或组织样品。可以调节在 人类受试者体内施用的嵌合毒素受体蛋白的浓度，从而获得与先前在动物 测试和样品中表现为有效且保护的相同的浓度。

美国食品和药品管理局已经公布了确定产品治疗和/或预防对病原体， 如炭疽，肉毒杆菌毒素，兔热病等致命暴露的安全性和功效的动物和人类 试验方针，并且在多种公开文献中为公众所已知，所述公开文献包括：联 邦注册(Federal Register)：2002年5月31日(卷67，号105)，规则制度 (Rules and Regulations)，第37988-37998页。该规则可以通过GPO访问 获自联邦注册在线(Federal Register Online)[wais.access.gpo.gov]，并且 可以见于联邦制度法规(Code ofFederal regulations)，食品和药品管理局， 21CFR的部分314和601。

下列实施例举例说明了所公开的发明的多种方面和实施方案。这些实 施例决不限制所要求的发明的范围。

实施例

实施例1：ICAM-1免疫黏附素表达盒的构建

由PCR克隆制备编码ICAM-1细胞外结构域D1-D5的盒。具体地， 利用下列寡聚核苷酸引物，从质粒pCDICl-5D/IgA(Martin，et al.病毒学杂 志(J.Virol.)67：3561-8，1993)扩增含有全部5个ICAM-1细胞外Ig状结构域 的片段：

5′-TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATC(SEQ ID NO：6)

TGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3′

5′-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCT(SEQ ID NO：7)

CGCGG-3′

将这两种引物设计用于在PCR片段的5’和3’末端(加下划线的核苷 酸)引入SpeI位点。用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR，从而减少错误的 积累。将PCR片段克隆到载体PCRScript(Stratagene)中，并且在与人IgA2 盒(在羧基末端具有或没有SEKDEL[SEQ ID NO：4])融合前对其进行测 序。

开发了人J链和分泌性元件，以及人IgA2重链在植物中表达的构建 体。制造了重链表达盒载体，并称为pSSpHuA2(见图1)。它包含编码大 豆豆球蛋白信号肽的序列(Baumlein等，核酸研究(Nucleic Acids Res.) 14(6)，2707-2720，1986)。以GenBank编号X03677提供大豆豆球蛋白序列， 并且所述大豆豆球蛋白信号肽序列是SEQ ID NO：10(也见于图8)，且其 间具有SpeI和SacI位点的IgA2m(2)恒定区，以及驱使信号肽表达的 SuperMas启动子和人IgA2m(2)重链的恒定区。

编码人ICAM-1的前5个结构域和人IgA2m(2)的Fc区域的扩增的 DNA在植物表达盒中融合，从而制造嵌合ICAM-1分子表达构建体，显 示于图2A中。这是通过将编码ICAM-1的5个细胞外结构域的片段克隆 到载体pSSPHuA2中，从而产生pSSPICAMHuA2而完成的。方便的限制 性位点(5′Spe I和3′Spe I)容许扩增的片段插入到信号肽和Cα1结构域 之间。在由此产生的构建体中，嵌合ICAM-1分子的表达受到组成型的启 动子″superMAS″(Ni等，1995)和nos 3′末端区域的控制。

由此产生的嵌合ICAM-1分子构建体不包含可变区。随着mRNA的翻 译，预知信号肽分裂将ICAM-1重链融合置于植物细胞内质网(ER)中。 编码ER保留信号(RSEKDEL，SEQ ID NO：5)的DNA附加在重链的3’末 端，从而促进所述构建体的表达水平。氨基酸序列SEKDEL(SEQ ID NO：4) 是用于植物细胞内质网中蛋白质的保留的共有信号序列。该序列已经显示 出提高抗体在植物中的积累水平(Schouten等，植物分子细胞学(Plant Molecular Biology)30：781-793，1996)。所述嵌合ICAM-1分子构建体的氨 基酸序列显示在图2B中。在将该构建体的DNA序列和翻译框架用于粒子 轰击前，对其进行了检验。

近期显示J链和IgA的装配发生在高尔基体中(Yoo等，生物化学杂志 (J.Biol.Chem.)274：33771-33777，1999)，并且也同样地制造不含SEKDEL (SEQ ID NO：4)的重链构建体。将ICAM-1片段克隆到含有IgA2m(2)恒定 区表达盒中，其不含SEKDEL(SEQ ID NO：4)。

实施例2：装配的ICAM-1免疫黏附素在植物中的表达

A.免疫黏附素表达载体

质粒pSSPICAMHuA2[SEQ ID NO：9和图8A]的长度是6313bp。核苷 酸49-1165代表超启动子(Superpromoter)(Ni等，植物杂志(Plant Journal) 7：661-676，1995)。核苷酸1166-3662包含编码人ICAM-1/人IgA2m(2)定型 杂种的序列和连接体序列。包括共有的Kozak序列(Kozak，细胞(Cell) 44(2)：283-92，1986)(nt 1186-1192)，从而促进翻译的起始，以及来自蚕豆(V. faba)豆球蛋白的信号肽(nt 1189-1257；Baumlein等，核酸注册(Nucleic Acids Reg.)14(6)：2707-2720(1986)。先前已经公开了人IgA2m(2)恒定区 的序列(nt 3663-3633)(Chintalacharuvu，等，免疫学杂志(J.Imm.)152： 5299-5304，1994)。将编码内质网保留信号SEKDEL[SEQ ID NO：4]的序列 附加在重链(nt 3634-3654)的末端。核苷酸3663-3933源自胭脂氨酸合成酶 3’末端(转录终止和多腺苷酸化信号；Depicker等，1982)。质粒的残余部 分源自载体pSP72(Promega)。

质粒pSHuJ(图8C)的长度为4283bp。核苷酸14-1136代表超启动子(Ni et al.，植物杂志(Plant Journal)7：661-676，1995)，以及核苷酸1137-1648显 示于图8中[SEQ ID NO：11]，并包含编码人J链的序列，包括天然信号肽 (Max和Korsmeyer，人类杂志(J hum.)152：5299-5304，1985)，连同连接 体序列。包括共有的Kozak序列(Kozak，细胞(Cell)44(2)：283-92，1986)(nt 1162-1168)，从而促进翻译的起始。核苷酸1649-1902源自胭脂氨酸合成 酶3’末端(转录终止和多腺苷酸化信号；Depicker等，分子应用遗传学杂 志(J Mol Appl Genet)1(6)：561-73，1982)。质粒的残余部分源自载体pSP72 (Promega)。

质粒pSHuSC(图8D)的长度为5650bp。核苷酸13-1136来源于超启 动子(Ni等，植物杂志(Plant Journal)7：661-676，1995)，以及核苷酸 1137-2981包含编码人分泌性元件的序列，包括天然信号肽(Krajci，等，生 物化学和生物物理研究交流(Biochem.and Biophys.Res.Comm)158：783， 1994)，连同连接体序列[SEQ ID NO：12]。包括共有的Kozak序列(Kozak， 细胞(Cell)44(2)：283-92，1986)(nt 1151-1157)，从而促进翻译的起始。核 苷酸2982-3236源自胭脂氨酸合成酶3’末端，其提供转录终止和多腺苷酸 化信号，在Depicker等，分子应用遗传学杂志(J Mol Appl Genet) 1(6)：561-73，1982中有所记述。质粒的残余部分源自载体pSP72(Promega)。

质粒pBMSP-1[SEQ ID NO：13和图8E]来源于pGPTV-KAN。Becker 等，在植物分子生物学(Plant Molecular Biology)20，1195-1197，(1992)中 描述了新型植物二重载体，其具有位于最接近左侧T-DNA边界的选择性 标记，和左右边界外侧的序列。pBMSP-1的核苷酸18-187代表右侧T-DNA 边界，且核苷酸1811-775代表superMAS启动子。核苷酸2393-2663代表 NOS启动子(Depicker等，分子应用遗传学杂志(J Mol Appl Genet) 1(6)：561-73，1982)，核苷酸2698-3492编码NPTII基因(赋予对卡那霉素 的抗性)，且核苷酸3511-3733来自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)基因7 的多腺苷酸化信号(Gielen等，Embo杂志(Embo J)3：835-46，1984)。核 苷酸1768-976编码NPTII基因，且核苷酸4317-4464代表左侧T-DNA边 界。

质粒pBMSP-1spJSC[SEQ ID NO：14和图8F]是pBMSP的衍生物，其 包含受到超启动子控制的J和SC。在该质粒中，核苷酸1-149代表左侧 T-DNA边界。核苷酸955-733是来自根癌土壤杆菌基因的多腺苷酸化信号， 核苷酸1768-976编码NPTII基因(赋予对卡那霉素的抗性)，且核苷酸2073- 1803代表NOS启动子。核苷酸2635-3768代表superMAS启动子，核苷 酸3774-5595编码人分泌性元件，且核苷酸5603-5857代表NOS多腺苷酸 化信号。核苷酸5880-6991代表superMAS启动子，核苷酸7007-7490编 码人连接链，且核苷酸7504-7757代表NOS多腺苷酸化信号。核苷酸 7886-8057代表右侧T-DNA边界。

编码赋予潮霉素抗性的酶的质粒pGPTV-HPT可以购自 Max-Planck-Institut fur Zuchtungsforschung(德国)。其记述于Becker的植物 分子生物学(Plant Molecular Biology)20，1195-1197(1992)中。

B.植物转化和ICAM-1免疫黏附素在植物中的表达

上述表达盒用于在植物中产生装配的免疫黏附素。将质粒 pSSPICAMHuA2，pSHuJ，pSHuSC和pBMSP-1共轰击到烟草叶组织(烟草 (N.tabacum)栽培种Xanthi)中，并且在存在卡那霉素的营养琼脂上选 择转化的微胼胝体。从双亲组织切割指示独立转化事件的个体微胼胝体， 并且在具有卡那霉素的营养琼脂上进行繁殖。

针对转基因表达筛选胼胝体。通过免疫印迹和PCR显示出胼胝体 #7132表达嵌合ICAM-1免疫黏附素和J链(数据未显示)。该胼胝体不拥 有编码SC的DNA。该胼胝体在培养基中良好地生长，并且随着积累足够 质量，#7132再次受到轰击，这一次使用上述两种质粒，即PBMSP-1SpJSC， 其含有J链和SC的表达盒，和pGPTV-HPT，其含有赋予潮霉素抗性的 hpt I基因表达盒。在营养琼脂上选择和生长一段时期后，通过免疫印迹识 别了若干个独立的转化体，其表达处于若干装配阶段的嵌合ICAM-1分子， J链和SC。

图3举例说明了嵌合ICAM-1分子在独立转化的烟草胼胝体中的表 达。图3A显示非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的免疫印迹，含有不同转化 的烟草胼胝体(C)和水性提取物(Aq)的样品在所述凝胶上运行并探测人 ICAM的存在。免疫黏附素的溶解性使我们确信可以容易地进行提取，并 且信号的相似性导致我们相信表达的重复性。图3B显示非还原SDS-聚丙 烯酰胺凝胶的免疫印迹，所述凝胶含有多种从胼胝体Rhi 107-11部分纯化 的免疫黏附素级分。用对抗人ICAM(～ICAM)，人IgA重链(～α)，人分泌 性元件(～SC)人J链(～J)的抗体探测所述印迹。其次，作为对用碱性磷酸酶 标记免疫阳性条带必要地使用酶缀合抗体。通过在非表达胼胝体的提取物 中失败地探测免疫阳性条带进一步证明了免疫印迹的特异性(未显示)。 对无糖基化的二聚体嵌合ICAM-1分子预测的MW是173，318；该形式由 于对ICAM-1和重链是免疫阳性的，所以很可能存在于移动到刚刚低于 250kD标记的条带中。该条带还对SC(总预测MW为～248kD)是免疫阳 性的，但是对J链不是免疫阳性的，这在假设SIgA装配的规范途径的条 件下是有点出乎意料的，所述SIgA装配的规范途径涉及2种细胞类型(在 哺乳动物中)并且在SC装配前要求J链的存在。含有单分子J链和单分 子SC的四聚体免疫黏附素在糖基化前具有～440kD的预测MW。若干具 有充分超过200kD分子量，对四种探针免疫阳性的物种是容易地显而易见 的。

利用覆盖DNA的微射弹的轰击用于在植物和动物中产生稳定的转化 体(通过Sanford等，酶学中的方法(Meth.Enz.)217：483-509，1993综述)。 利用有Bio-Rad制造的PDS-1000/He粒子加速装置进行了由粒子介导的编 码本发明免疫黏附素载体的转化。PDS-1000/He粒子加速装置系统使用氦 压力将覆盖DNA的微粒子加速到靶细胞。该技术的物理性质使其非常通 用和容易使用。我们已经成功地同时用全部四种分泌性IgA成分转化了烟 草。

基础生物发射程序如下进行：通过在1ml无水乙醇中混合60mg粒子 制备微射弹的储存混悬液。涡旋该混悬液，并且移出25-50μl，加入到无 菌微量离心管中。微量离心30秒后，移除乙醇，并将沉沉重新混悬于1ml 无菌水中，并且离心5分钟。然后移除水，并将沉淀重新混悬于25-50μl 的含有通常，但不总是等摩尔量质粒DNA混合物的DNA溶液中。所添加 的质粒的量在0.5ng-1μg/制备之间变化。顺序添加下列各项：220μl无菌水， 250μl的2.5MCaCl2，和50μl的0.1M亚精胺。涡旋该混合物至少10分钟， 并且再离心5分钟。去除上清液，并且在600μl无水乙醇中沉淀DNA/微 射弹，对其进行混合并离心1分钟。去除乙醇并将沉淀重新混悬于36μl 乙醇中。尽可能平均地将10μl该混悬液应用到由Kapton(DuPont)制造的大 载体片层的中心上，并且蒸发乙醇。将大载体片层和破裂盘置于所述单位 中。将含有表面无菌烟草页的培养皿置于停止筛下方。将腔抽空至28-29 mm Hg，并且轰击目标一次。该方案已经是对烟草最优化的，但是通过改 变参数，如He压力，覆盖的粒子的量，大载体和停止筛间的距离以及停 止筛到组织的飞行距离，也可以对其他植物进行最优化。

也在二重载体中装配嵌合ICAM-1分子的表达盒，从而用于土壤杆菌 介导的转化。将为表达人J链和人分泌性元件，以及卡那霉素抗性而设计 的土壤杆菌二重载体引入根癌土壤杆菌菌株LBA4404。另一个二重载体中 的嵌合ICAM/IgA分子也用于转化LBA4404。按照标准方案，这两种菌株 的过夜培养用于同时与烟草叶片共培养(Horsch等，科学(Science) 227：1229-1231，1985)。

使用了再生受轰击和土壤杆菌转化的烟草页盘的标准方案(Horsch等， 科学(Science)227：1229-1231，1985)。因为再生于受轰击组织的转化植物 随着成熟频繁地经历基因沉默，所以通过土壤杆菌介导的转化制备转基因 烟草植物，这提供了表达成熟植物的高产量。

实施例3：装配的ICAM-1免疫黏附素的纯化

纯化了按照实施例2表达的免疫黏附素。大量生长胼胝体，从而促进 提取程序的发展。部分纯化时间表为随后色谱技术的研究提供可用于多种 缓冲液条件中的稳定浓缩物，从而进一步纯化免疫黏附素(见图3)。胼胝 体当浸泡在含有柠檬酸钠(0.6M，pH 7.4)和尿素(最终浓度2M)的缓冲液 中时，在榨汁机中被提取，所述榨汁机在两个不锈钢齿轮间碾碎组织。在 经过粗棉布粗过滤后，用0.67体积的饱和硫酸铵沉淀该汁液(～1ml/g鲜 重)。在离心后收集到绿色沉淀，并利用Dounce匀浆器，在小体积的50mM 柠檬酸钠(pH 6.6)中对其进行彻底提取。另外的离心后，通过流过Sephadex G-100柱，在缓冲液以脱盐模式交换过程中，收集并部分纯化清澈的棕色 上清液。该脱盐/缓冲液交换步骤容许了在所需缓冲液中制备部分纯化的浓 缩物(～0.2ml/g鲜重胼胝体)；用0.25X的磷酸盐缓冲液洗脱所述G-100 柱。该洗脱看起来在2-8℃稳定至少10天。

实施例4：ICAM-1免疫黏附素抑制人鼻病毒的传染性

证明了由人鼻病毒引起的细胞传染性受到按照实施例3制备的免疫黏 附素的抑制。按照实施例3制备的胼胝体提取物成功地为抗ICAM单克隆 抗体和可溶性ICAM-1的结合而竞争。图4显示来自酶联免疫吸收测定 (ELISA)的数据。为了所述测定，用0.25μg可溶性ICAM-1/ml包被96 孔板。方块代表增高浓度的sICAM，且圆圈代表增加量的胼胝体提取物(来 自G-100的无菌过滤级分)，其用于为了恒定量的小鼠(抗人ICAM)抗 体与黏着ICAM竞争。洗涤孔后，用与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠抗体 探测黏着小鼠抗体。在490nm处，用邻-苯二胺作为底物测量黏着酶活性。 通过OD490＝y＝y0+a/[1+e-{(x-x0)/b}]形式的siginoid充分地描述了该数据 (方块，sICAM；圆圈，提取物)，其中a＝y最大，y0＝y最小，b＝曲线迅速 改变部分的斜度，且X0＝50％响应时的X值。相对于可溶性ICAM-1，在 此测试的免疫黏附素提取物含有250μg ICAM/ml的等价量；由于所预测的 二聚体和四聚体ICAM-1重链融合装配的亲和力作用，这是估计过高的。 因此，该ELISA证明了免疫黏附素与可溶性ICAM-1竞争结合于抗ICAM mAb。

竞争性ELISA通过比较多种级分提供50％响应所需的标准化量，容许 对活性恢复的定量评估。随着纯化，可以将免疫黏附素制剂的滴定量表达 为倒数稀释度，或为提供50％响应必须将毫克免疫黏附素稀释于其中的毫 升数。该ELISA促进免疫黏附素纯化步骤的发展。

细胞病理效应测定(CPE)证明了部分纯化的免疫黏附素抑制由人鼻 病毒引起的人细胞的传染性的特异性能力(图5)。在33℃用HeLa S3细 胞接种每种混合物前，用人ICAM-1，ICAM/IgA融合(Tim Springer博士 的礼物)，或用来自胼胝体的提取物预培养鼻病毒血清型HRV-39，所述胼 胝体的提取物表达我们的ICAM-1/SIgA免疫黏附素或另一种不同的抗体。 3天后，固定活细胞，并用结晶紫甲醇溶液对其进行染色；570nm处的光 密度提供与细胞生存力成比例的测量。

两种源自Rhi107-11且含有免疫黏附素的提取物，明显地抑制病毒感 染和杀死HeLa S3细胞的能力(图5A，右侧正立和倒立的三角)。因为所述 提取物仅是部分纯化的，我们还测定了相似制备的提取物，其含有直接对 抗阿霉素的人IgA2m(2)，即化学疗法试剂。该提取物，含有具有无关结合 特异性的相似的免疫球蛋白，不能抑制鼻病毒的传染性，并且证明ICAM-1 重链融合的表达赋予该抑制特异性。如所预料地，CPE测定证明了可溶性 ICAM-1和IC1-5/IgA(Martin，等，1993)抑制病毒传染性的不同能力(图 5B)。图5B中的插入物在对可溶性ICAM-1的IC₅₀(1.35μg/ml)和对 IC1-5/IgA的IC₅₀(0.12μg/ml；低11.3倍)范围内刻度扩展。

实施例5：为了临床和毒物学研究生产和纯化免疫黏附素

通过制造转基因烟草植物，进行免疫黏附素的生产，其对提议的临床 和毒物学需要是充足的。通过土壤杆菌介导的转化，产生表达免疫黏附素 (无ER保留信号)的转基因植物。预期ER保留信号的缺失提高装配， 其原因在于初生的SIGA是经过完整高尔基体，包括，特别地，穿高尔基 加工的，其中如通过脉冲追踪试验所暗示地，SC共价连接于dIgA (Chintalacharuvu & Morrison，免疫技术(Immunotechnology)4：165-174， 1999)。由于土壤杆菌介导的转化更可能产生具有一致转基因表达水平的植 物，所以这些植物的后代可能应该用于产生临床等级的免疫黏附素。

为了最大化表达水平和创建纯育品系，需要创建纯合植物。收集种子 前，最高生产的植物(代T0)可以在温室中自体受精。预期四分之一的 T1植物是纯合的。这些在温室中生长，并且来自若干植物的种子样品分 别在含有卡那霉素的培养基上发芽。预期来自纯合阳性植物的全部后代 (T2)是绿色的。预期一些杂合植物的后代是白色或微黄色的。通过与野 生型回交和免疫印迹所述后代的提取物证实纯合性。

收获和处理可以在生产活动中连续地密切配合，特别是由于多次收获 可以获自单次种植，即为了收获被切断至土壤水平的植物再生，从而进行 随后的收获。在发展产生免疫黏附素的规模的意义上，必须按照表达水平 决定所需的完成免疫黏附素的量(mg存在的免疫黏附素/kg烟草鲜重)， 已知植物的生长率和预期的平均植物重量，以及纯化时间表的总产量(设 定为20％)。将总需要设定为3g成品免疫黏附素需要制备4次收获，每次 具有1g成品免疫黏附素的预期产量。

给定这些目标和参数，确定了所需的植物数量以及由此对植物生长的 空间需要。图6显示对制造1克成品免疫黏附素的生产必需品的评估。在 该图表中，举例说明了当20％的产率，预期的表达水平和植物重量时，1g 免疫黏附素所需要的植物数量。在不同免疫黏附素表达水平(mg/kg鲜重) 和总恢复(没定为20％)时，可以在合理可能性范围(虚线的方块)内对特 殊的生长目标(1g/收获)确定每株植物的重量，以及因此植物的总数。所 需要的植物的数量减少，其与特定生长和再生时期的数量相反。预期的生 物量生产，时间和生长条件的功能，影响收获的时间和收获之间的时间。 通过交错排列种植和收获的日期可以将这些生长时期调节为纯化时间表 的现实(realities)。例如，但收获200g/植物的重量时，1g来自植物的， 具有合理表达水平的成品免疫黏附素，100mg免疫黏附素/kg鲜重，需要 250株植物(发芽后～80天)。以这种规模，这些植物需要约10m²的生长 空间，并且在150天内收获2次。

每次处理50+kg的生物量需要几次适度大规模的操作，其在食品处理 工业中均具有相似情况(counter-parts)。这些包括大量材料加工，尺寸减 少，榨汁和过滤。Vincent挤压和Durco过滤系统用于有效地处理这些数 量。榨汁步骤使用被证明的和简单的柠檬酸钠和尿素缓冲液。这些成分缓 冲所述提取物，帮助防止酚类化合物(phenolics)的氧化及它们与相关蛋 白质结合(Gegenheimer，酶学中方法(Methods in Enzymology) 182：174-193，1990；Loomis，酶学中方法(Methods in Enzymology)， 31：528-544，1974；Van Sumere，等，植物蛋白的化学和生物化学(The Chemistry and Biochemistry of Plant Proteins)，1975.)，并且在随后的酸沉 淀过程中确保免疫黏附素的溶解性。

在过滤酸不可溶性液体和蛋白质(总量的～90％)后进行切向流超过滤， 从而浓缩免疫黏附素并且去除小蛋白质，特别是酚类化合物。Diafiltration 增强小分子的去除，并且在为了短期储存和随后的层析法的制剂中交换缓 冲液。SP-琼脂糖(在pH5.0或更低时结合)或Q-琼脂糖(在pH5.5或更 高时结合)是可以用于过滤免疫黏附素的离子交换物之一。它们是易于使 用的，可升级的，强有力的并且具有高容量。特别地，它们可用于膨胀床 形式，其降低先前过滤步骤的严格性。首先使用了阳离子交换层析法，其 比阴离子交换层析法更具选择性。从潜在存在的若干种类蛋白质中纯化免 疫黏附素，以到达至少所述蛋白质的95％处于ICAM-1/IgA，ICAM-1/dIgA 或ICAM-1/SIgA形式，其原因在于二和四价ICAM-1结构域的存在对有效 的抗病毒活性是至关重要的。然后测试纯化的免疫黏附素对内源毒素，生 物碱，如烟碱以及对生物负担的可接受水平。另外，监测了潜力水平(通 过ELISA和CPE测定定义)，蛋白质浓度，pH和外观。随后，确定许多 免疫黏附素的临床批次的稳定性，从而确保患者接受完全有效的免疫黏附 素。发现当冷冻时，即使是部分纯化的提取物可以稳定10天。在储存在-20 ℃，2-8℃和37℃时，在3-6个月的时期内，也测试临床配制的免疫黏附 素的滴定量和潜力。

实施例6：免疫黏附素具有植物特异性糖基化

分析了所产生的免疫黏附素，从而确定存在的糖基化模式。 Cabanes-Macheteau等，糖生物学(Glycobiology)9(4)：365-372(1999)证明了 若干典型的植物糖基部分在植物表达抗体结构上的存在。他们的方法用于 证明按照实施例1，2和3产生的免疫黏附素具有植物特异性糖基化模式。 我们预期该差异还应该是免疫黏附素可变性的来源。由于粗提取物已经显 示出在体外具有抗病毒活性(数据未显示)，同样地，糖基化似乎不影响 潜力。N-连接的糖基化(图2显示在单独的嵌合ICAM-1分子上存在15 个潜在的位点)可能为免疫印迹中观察到的条带的多样性做出贡献。在印 迹前，用N-糖苷酶A消化免疫黏附素制剂，这显示出条带模式的区别断 裂为较少的不连续条带。在该方法中，最初用还原和非还原的聚丙烯酰胺 凝胶来表征糖形式。另外，在CPE测定和竞争ELISA中测试消化的和模 拟消化的级分，其证明了N连接糖基化对体外潜力和滴定的作用。

实施例7：ICAM-1免疫黏附素灭活人鼻病毒

测定按照实施例1，2和3制备的免疫黏附素通过与病毒结合，阻断 病毒侵入，和减少空病毒壳体的形成灭活HRV的能力。为了测量免疫黏 附素和HRV的结合，用[³H]亮氨酸标记的HRV-39培养免疫黏附素30分 钟，并再将其加入到HeLa细胞中1小时。洗涤后，用Triton X-100分离 细胞和结合的病毒，并且在闪烁计数器中测量[³H]。

将通过用免疫黏附素培养引起的HRV-39的培养灭活与通过sICAM-1 引起的HRV灭活进行比较。通过用单体sICAM-1培养不将HRV-39直接 灭活至显著程度(＜0.5log 10传染性的降低)，而用IC1-5D/IgA培养将传 染性降低大约1.0log10(Arruda，等，抗微生物剂和化学疗法(Antimicrob. Agents Chemother.)36：1186-1191，1992；Crump，等，抗微生物剂和化学疗 法(Antimicrob.Agents Chemother.)38：1425-7，1994)。为了测试免疫黏附 素灭活HRV-39的能力，在33℃，在摇动平台上将106个50％组织培养传 染性剂量(TCID₅₀)的HRV-39培养在含有一定浓度sICAM-1或免疫黏附 素的培养基或简单培养基中1小时，所述浓度等于每种分子对那种病毒的 IC50的10倍。然后再将每种病毒-免疫黏附素或病毒-培养基混合物以10 倍稀释进行连续稀释，并且在96孔板中的HeLa细胞上确定滴定量。

通过在存在或缺乏免疫黏附素的条件下，用MOI为0.3的HRV-39接 种HeLa细胞测试免疫黏附素对HRV与宿主细胞的附着作用的影响。吸收 在4℃进行1小时，洗涤细胞，并且用加上或减去免疫黏附素替换培养基。 将细胞在33℃培养10分钟(从而容许一轮复制)，并且通过冻/融细胞收 获病毒。在HeLa细胞上滴定病毒。

在减少HRV中构象改变方面，ICAM-IGA(IC1-5D/IgA)比Sicam-1 更有效，从而导致空的非传染性病毒粒子的形成(Martin，等.病毒学杂志(J. Virol.)67：3561-8，1993)。为了检验按照实施例1，2和3制备的免疫黏附 素减少HRV中构象改变，从而导致病毒RNA释放的能力，用[³H]亮氨酸 标记的HRV-39培养纯化的免疫黏附素30分钟，并且再将病毒覆盖在 5-30％蔗糖梯度上。在40,000rpm离心90分钟后，收集级分，测量[³H]， 并评估级分的传染性(完整HRV沉淀物位于蔗糖梯度的149S处；而缺乏 RNA的空壳体的沉淀物位于75S处(Martin，等.病毒学杂志(J.Virol.) 67：3561-8，1993))。由于其增高的化合价，我们预测ICAM/SIgA免疫黏附 素在减少空的非传染性颗粒方面比ICAM-IgA更有效。

应该利用CPE测定检验纯化的免疫黏附素对一组主要和次要(不使用 ICAM-1作为受体的)HRV血清型的抑制作用。ICAM-1抑制HRV感染的 能力在病毒分离株之间变化。已经显示出(Crump，et al.，Antimicrob.Agents Chemother.38：1425-7，1994)当利用HeLa细胞在一组HRV主要受体血清型 测定中测试时，sICAM-1的EC₅₀在0.6μg/ml-＞32μg/ml间变化。我们 的组包括9种主要血清型(HRV-3，-13，-14，-16，-23，-39，-68，-73，和-80)和 次要受体血清型HRV-1A。

实施例8：临床研究证明ICAM-1免疫黏附素降低在人类中传染性的能力： 剂量增加耐受性研究

在两种随机化对照试验中测试本发明免疫黏附素，从而确定鼻内施用 免疫黏附素对感染，IL-8响应和试验鼻病毒感冒中疾病的作用。这两种研 究评估了在鼻病毒接种之前和之后由受试者获取的免疫黏附素。此处使用 的临床方案基于先前在评估重组可溶性ICAM-1分子对抗鼻病毒感染功效 中所使用的方案(Turner，等，JAMA 281：1797-804，1999)。

A.受试者

从Charlottesville的维吉尼亚大学大学社区中征募受试者。要求受试者 具有良好的健康，非抽烟者，并且年龄在18-60岁之间。如果受试者具有 过敏性疾病或非过敏性鼻炎的病史，异常鼻骨骼或粘膜，或在前2周内患 有呼吸道感染，则将其拒绝之外。还拒绝怀孕或泌乳的女性或不服用医学 批准避孕药的女性。在试验性病毒攻击研究中(阶段I/II，见下)，要求受 试者对研究的病毒敏感，其通过在该测试开始90天内确定的对所述病毒 的血清中和抗体滴定量为1∶4或更低来证明。

B.研究的药物

将本发明的免疫黏附素配制为含有2.6mg/ml的磷酸盐缓冲液(PBS) 喷雾溶液。安慰剂由PBS组成，并且在外观上与活性制剂相同。利用装有 定量鼻喷雾泵的药剂瓶施用所述溶液。该泵每次喷雾递送70μl溶液，其含 有183μg的免疫黏附素。以2次喷雾/鼻孔，6次/日(以3小时为间隔)施 用所述药剂，从而达到总的每日剂量为4.4mg。这与在tremacamra研究感 染中对可溶性ICAM-1使用的，以mg蛋白质/日为单位的剂量相同(Turner， 等，JAMA 281：1797-804，1999)。1摩尔免疫黏附素具有1摩尔sICAM-1质 量的大约2倍。然而，假设sICAM-1和ICAM/IgA融合之间体外活性的区 别，免疫黏附素在摩尔基础上比sICAM-1更有效许多倍。因此，所述量是 对所需要量的保守计算。除了在剂量增加研究揭示处于该剂量的问题的情 形中以外，均使用所述量。

C.研究的设计

单次增加剂量和多次增加剂量的研究用于评估免疫黏附素的安全性。 在每种情形中，在每种剂量水平评估了3名受试者，其中两名接受免疫黏 附素和一名接受安慰剂。在单次增加剂量研究中，评估了4种剂量水平。 最低的单独剂量是预期在攻击研究中使用的剂量的一半，且最高单独剂量 是预期攻击研究剂量的2倍。剂量水平如下：每鼻孔一次喷雾(总共 366μg)，每鼻孔两次喷雾(总共732μg)，每鼻孔三次喷雾(总共1098μg)， 每鼻孔四次喷雾(总共1464μg)。

在多次增加剂量研究中使用了相同的剂量水平。受试者每三小时接受 一剂(每日6次)，接受5天。在这两种研究中，在每种剂量水平评估受 试者，交错每种后继水平的起始直到在先前的水平上明显不存在急性毒 性。在第一剂药后，使全部受试者恢复到单次剂量21天，并且再追踪6 周(为了确定对抗免疫黏附素的血清抗体)。

向另外一组12名受试者提供一剂：2次喷雾/鼻孔(总共732μg)，并 且在1，2，4，8和16小时进行鼻灌洗(每个时间点两名受试者)。在通过对 免疫黏附素的ELISA的全景研究(Panorama Research)中测定洗涤，从而 计算其体内半衰期。在剂量增加和半衰期确定研究(总共28名受试者) 中使用的免疫黏附素的总量应该是大约270mg。

D.安全性评估

除了常规有害事件记录以外，以三种方法评估了免疫黏附素的安全 性。第一，在第一剂前和最后一剂后，研究人员进行鼻粘膜的表观检查， 特别是寻找刺激或炎症的信号。注意任何的可见的改变。第二，在研究的 第1，4和8天(和在多次增加剂量研究中的第21天)对治疗前和最后一 剂药后收集的样品进行标准血液安全性评估。第三，保存，冷冻血清样品， 从而用于确定免疫黏附素是否能够穿过鼻粘膜进入血液。这通过两种方法 实现。第一，通过ELISA测量血清样品中免疫黏附素的存在。在该测定中， 吸附在微滴定板上的抗人IgA抗体捕获血清中任意的免疫黏附素，这是通 过抗ICAM抗体探测的。利用掺加了已知浓度免疫黏附素的正常人血清样 品确定所述测定的敏感性。备选地，抗ICAM抗体可以吸附于板上，从而 捕获血清中的可以被抗IgA探测的免疫黏附素。第二，利用ELISA方法 测定对免疫黏附素的免疫响应的存在，所述ELISA方法使用吸附在微滴定 板上的免疫黏附素。血清中任何抗免疫黏附素的抗体结合，并用抗人IgG 或抗人IgM检测。比较了处理前和处理后血清样品，并且将滴定量中的任 何改变认为吸收免疫黏附素的证据。如果存在任何抗免疫黏附素抗体的阳 性证据，则应该进行另外的测定，从而区分抗ICAM-1和抗IgA活性。

针对对免疫黏附素过敏反应的发展筛选了患者。(在先前的研究中， 不存在与局部应用于鼻子中的可溶性ICAM或局部应用于口腔中的植物 产抗体发生的不良反应的事件。)利用灵敏性两步骤ELISA(R&D系统 (R&D Systems))测试表现出鼻过敏症状的个体在鼻灌洗液中的抗免疫 黏附素特异性IgE抗体。

E.统计学分析

这些研究的样品尺寸基于先前利用鼻病毒攻击模型的研究。为该保护 研究所设计的样品尺寸足以检测临床感冒发生频率的降低，其由安慰剂组 中的75％降到活性治疗组中的25％，其具有1-α的有边水平(sided level) ＝0.05和1-β＝0.80。另外，样品尺寸足以检测5单位总症状评分的改变， 假设SD是5.8单位。

实施例9：临床研究证明免疫黏附素降低人类中传染性的能力：攻击研究

攻击研究用于证明用本发明的免疫黏附素的治疗在病毒攻击后防止 临床感冒或减少感冒的症状。

A.攻击病毒

用于该研究的攻击病毒是鼻病毒39(HRV-39)。鼻病毒类型39是为 与细胞的附着需要ICAM-1的主要鼻病毒组。按照一致认可的指导方针对 攻击病毒的集合进行安全性测试(Gwaltney，等，医学病毒学进展(Prog. Med.Virol.)39：256-263，1992)。用大约200个培养基组织培养传染性剂量 (TCID50)对所有的受试者进行接种。在受试者仰卧时，以在两种接种体中 250μl的滴剂/鼻孔，相隔大约15分钟，施用所述病毒。

表5

注释

在两个研究中，在第1-5天，在第0，3，6，9，12，和15小时提供剂量

m＝上午

e＝晚间

B.研究的设计

进行了两个随机化鼻病毒攻击研究(见表5)。在接种前和接种后的研 究中评估了相同剂型的本发明免疫黏附素。在这两个研究中，以每天6剂 的方式施用药剂5天。随机地分配受试者，使其在登记每个研究时接受免 疫黏附素或匹配的安慰剂。所有的研究都是双盲的，且全部临床试验人员， 受试者和全景研究的职工均保持双盲，直到收集了所有的数据。

在接种前研究中，在病毒攻击前4小时开始药物治疗(2剂)。第二剂 免疫黏附素(或安慰剂)后1小时施用病毒攻击，并且按照时间表提供第 一天的剩余4剂的研究药剂。在该研究中，18名受试者接受活性治疗，18 名受试者接受安慰剂。

在接种后研究中，病毒攻击后24小时开始药物治疗。因为在其他防 止病毒攻击的研究中使用了该时间点，并且因为感冒症状明显存在，所以 选择了该时间点(Harris & Gwaltney，临床传染病(Clin.Infect.Dis.) 23：1287-90，1996)。在研究第0天的上午，即在研究第1天上午的第一剂 研究药剂前大约24小时，施用该研究中的病毒攻击。在该研究中，36名 受试者接受活性治疗，18名受试者接受安慰剂。

在研究第0天(病毒攻击的当天)-研究第6天，将受试者隔离在单 独的饭店房间中。在这些天中的每一天，在第一剂药剂前的上午进行症状 评分和为了病毒分离的鼻灌洗，并且在每天晚间进行第二症状评分。在研 究第6天，将受试者从隔离中释放出来，但是继续在每天晚间记录症状评 分直到第14天。受试者在研究第21天回到研究场所，就在那时收集用于 检测抗免疫黏附素抗体的最终血清样品。用于这两种病毒攻击研究(总共 54名受试者)中的免疫黏附素的总量大约是1200mg。

C.病毒的分离

通过在细胞培养中的病毒分离检测病毒的释放。通过向每个鼻孔灌输 5ml 0.9％的盐水收集鼻洗涤样本。然后将该洗涤剂排出到塑料杯中，并保 持冷冻1-2小时，直到进行病毒培养。通过用吸附到琼脂糖支持体(Affi-Gel 10，Bio-Rad实验室，Hercules，Calif.)上的抗ICAM-1抗体的处理，从所述样 本中除去免疫黏附素。将每种处理的样本的一部分储存在-80℃，并将另一 部分接种到两管HeLa-1细胞，即富含ICAM-1产物的HeLa细胞系中 (Arruda，等，临床微生物学杂志(J.Clin.Microb.)34：1277-1279，1996)。 通过显现典型的细胞病理效应识别鼻病毒。认为在攻击研究后任意一天中 具有阳性病毒培养的受试者是感染的。通过在微滴定板上培养HeLa细胞 的连续10倍稀释物，确定储存在-80℃的样本中的病毒滴定量。

通过利用标准方法进行血清中和滴定检测攻击病毒的抗体(Gwaltney， 等，对病毒的立克次氏体和衣原体感染的诊断程序(Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections)，第579-614页，美国公共健 康协会(American Public Health Association))。在筛选过程中，紧挨着病 毒攻击(急性)前，和再在21天后(康复期)收集用于抗体测试的血清 样本。认为当康复期的血清样品与急性血清样品比较时，具有至少增高4 倍的对攻击病毒抗体滴定量的受试者是感染的。

D.疾病严重性的评估

如前所述地评估疾病的严重性(Turner，等，JAMA 281：1797-804， 1999)。在病毒攻击前(基线)，和其后的6天内以大约24小时间隔每天2 次地记录症状评分。在研究的第7-14天，每名受试者每天1次地在晚间记 录他/她的症状评分。在每次评估中，要求受试者判断下列8种症状在自从 上一次症状评估开始的时间间隔内的最大严重性：打喷嚏，鼻液溢，鼻塞， 咽喉痛，咳嗽，头痛，不适，和寒冷。对每种症状分配0-3的严重性评分， 其对应于缺乏，轻度，中度或严重的症状严重性报告。如果症状出现在基 线，则从报告的症状评分中减去基线症状评分。取两次每日评估中较高的 作为对每种症状的每日症状评分。将对8种独立的症状的每日症状评分相 加，从而产生每日症状总分。将病毒攻击后前5天(研究的第1-5天)的 每日症状总分相加，并且在研究第5天的晚间，询问全部受试者“你是否 感觉患上了感冒？”将这样的受试者定义为患有临床感冒，所述受试者具 有症状总分至少为6并且至少3天鼻液溢或受试者主观感觉患有感冒。

在第1-7天，通过对全部受试者提供经预称重的鼻组织包装确定排出 的鼻分泌物的重量。使用所述组织后，将其储存在密封的塑料袋中。每天 上午，收集并称重使用过的组织和来自原始包装的任何未使用过的组织。

E.IL-8测定

近期的研究已经显示出宿主的炎症反应，特别是白介素8(IL-8)，在 由于鼻病毒感染引起的常见感冒症状发病机制中起作用。如前所述(Turner， 等，JAMA 281：1797-804，1999)，利用可商业获得的ELISA(R&D系统， Minneapolis，Minn.)，确定IL-8在鼻灌洗中的浓度。

F.安全性评估

在活性研究中进行了与实施例8中所述的剂量增加研究中相同的评 估。

G.统计学分析

与对实施例8中所述的剂量增加研究所述相似地进行统计学分析。

当前述实施例和讨论主要专注于ICAM-1免疫黏附素时，可以便利地 被技术人员改变从而完成和实现对的应用，所述其他类型免疫黏附素对其 他类型或亚型病毒和细胞病原体具有活性。下列实施例举例说明了抗细菌 免疫黏附素的实施方案，其利用炭疽毒素受体(ATR)作用受体蛋白。

实施例10：ATR免疫黏附素表达盒的构建

通过PCR克隆制备编码人炭疽毒素受体(ATR)的一部分细胞外结构 域的盒。特别地，利用下列寡核苷酸引物，从质粒ATR(Bradley et al.，2001) 或从质粒TEM8(St Croix et al.，2000)扩增编码氨基酸44-216(所谓的冯维 勒布兰德因子类型A结构域)的523bp的片段：

5′-GACCTGTACTTCATTTTGGACAAATCAGG-3′(SEQ ID NO：91)

5′-GAGCTCAAAATTGAGTGGATGATGCCT      (SEQ ID NO：92)

TGCAGAG-3′

为了向ATR细胞外结构域编码区域的3’末端引入Sac I位点(实下划 线)，设计了第二引物(SEQ ID NO：92)。用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR， 从而减少错误的累积。利用下列寡核苷酸引物，从质粒8ATG-TOPO#4(其 为Invitrogen克隆载体pCR4-TOPO中，对植物最优化的5’未翻译区域和 信号肽的PCR克隆)扩增124bp的第二片段，其包括5’未翻译区域和植 物信号肽：

5′-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3′ (SEQ ID NO：93)

5′-GTCCAAAATGAAGTACAGGTCAGCCAA    (SEQ ID NO：94)

ACTAGTAGAGGTGAACAAAAGC-3′

为了向PCR片段的5’末端引入Kpn I位点(实下划线)，设计了第一 引物(SEQ ID NO：93)。这两个PCR片段具有20nt的互补序列(虚下划线)。 将这两个PCR片段混合在一起，并且利用SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：92 扩增626bp的片段。将由此产生的PCR片段克隆到载体PCRScript (Stratagene)中，并且在载体pMSP-coICAM中Kpn I和Sac I位点间克隆， 及由此产生质粒pMSP-ATR-IgA2之前，进行测序。这导致ATR细胞外结 构域和人IgA2恒定区的遗传融合。为了使用对烟草细胞中的表达最佳的 密码子，合成了所述的人IgA2恒定区。ATR-IgA2融合(免疫黏附素)的 完整核苷酸和氨基酸序列显示于图10中。在由此产生的构建体中，嵌合 ATR-IgA2分子的表达受到组成型的启动子″superMAS″(Ni等，1995)和ags 3′终止区域的控制。

利用限制性酶Asc I，从pMSP-ATR-IgA2中去除完整的表达盒(启动 子+ATR-IgA2+终止子)，并且将其克隆到二重土壤杆菌Ti质粒载体 pGPTV-kan-ocs中，从而产生质粒pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2。载体 pGPTV-kan-ocs来源于pGPTV-kan(Becker等.，1992)，其经历了下列方式 的修饰。将pGPTV-kan的Eco RI和Hind III位点之间，包括完整uid A基 因的序列去除，并用导向npt II基因的ocs 3′终止区域(MacDonald等，1991) 和对Asc I和Sac I的限制性位点对其进行替换。这个与T-DNA右侧边界 相邻的终止子的目的是消除与转基因的转录干扰，所述干扰是由于右侧边 界外的植物DNA中的转录起始引起的(Ingelbrecht等，1991)。

质粒pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2的T-DNA边界之间的序列显示于图11 中。左侧和右侧边界外的序列如所述(Becker等，1992)。核苷酸18-187代 表右侧T-DNA边界。核苷酸311-630代表ocs 3′终止区域。核苷酸927-1976 代表superMAS启动子。核苷酸1990-2017代表来自Nicotiana sylvestris psaDb基因的5’未翻译区域(Yamamoto等.，1995)。设计了起始ATG周围 的前后序列(核苷酸2012-2026)，从而与高表达植物基因中所发现的相匹 配(Sawant等，1999)。核苷酸2018-2086包含编码蚕豆豆球蛋白的信号肽 修饰形式的序列(Baumlein等，1986)。核苷酸2087-2605包含编码ATR的 冯维勒布兰德因子类型A结构域的序列(Bradley等，2001)。核苷酸 2606-3631包含编码人IgA2m(2)恒定区的序列(Chintalacharuvu等，1994)。 核苷酸3794-4108来源于农杆氨酸合酶(ags)终止子。核苷酸4530-4800 代表NOS启动子(Depicker等，1982)。核苷酸4835-5626编码npt II基因(赋 予对卡那霉素的抗性)。核苷酸5648-5870是来自根癌土壤杆菌基因7的多 聚腺苷化作用信号(Gielen等，1984)。核苷酸6454-6602代表左侧T-DNA 边界。

还开发了用于在植物中表达人J链和分泌性元件的构建体。该构建体， 即pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC，基于载体pGPTV-hpt-ocs，所述载体以与对以 上pGPTV-kan-ocs所述的相同的方式来源于pGPTV-hpt。质粒 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC的T-DNA边界之间的序列显示在图12中。左侧和 右侧边界外的序列如所述(Becker等，1992)。核苷酸1-149代表左侧T-DNA 边界。核苷酸733-955(互补体)代表来自根癌土壤杆菌基因7的多聚腺 苷化作用信号(Gielen等，1984)。核苷酸980-2002(互补体)代表hpt基因 (赋予对潮霉素的抗性)。核苷酸2049-2318(互补体)代表NOS启动子 (Depicker等，1982)。核苷酸2898-3230代表花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子，其驱使人分泌性元件基因，包括其天然信号肽(核苷酸3236-5056) 的表达，且核苷酸5060-5445代表来自豌豆rbcS-E9基因的多聚腺苷化作 用信号(Mogen等，1992)。核苷酸5457-5788代表CaMV 35S启动子的第二 复制，其驱使人连接(J)链基因，包括其天然信号肽(核苷酸5797-6273) 的表达，且核苷酸6281-6494代表基因7终止子。核苷酸6501-6819(互 补体)代表ocs 3′终止区域。核苷酸6944-7113代表右侧T-DNA边界。

实施例11：植物中的植物转化和ATR免疫黏附素表达

上述表达盒用于通过土壤杆菌介导的转化，在植物中产生装配的免疫 黏附素。向根癌土壤杆菌菌株LBA4404分别引入质粒 pGPTV-hpt-ocs-35SJ/SC和pGPTV-kan-ocs-ATR-IgA2。按照标准方案，将 这两种菌株的过夜培养物用于与烟草叶片的同时共培养(Horsch等，1985)。 在含有卡那霉素(100μg/mL)和潮霉素(25μg/mL)的再生培养基上选择转化 的植物组织。

对在抗生素存在下再生的小植物进行转基因表达的筛选。这是通过制 备磷酸盐缓冲液(PBS)中的叶组织提取物和在硝化纤维纸上点样净化的 提取物完成的。用特异于人IgA，J链或分泌性元件的碱性磷酸酶缀合抗 血清探测这些“点”印迹。使该第一次筛选中测试阳性的植物经历进一步 的筛选，其涉及蛋白质印迹法和PCR。预测ATR-IgA2免疫黏附素具有 MW为59kDa的亚单位。由于重链恒定区的天然二聚作用，还预料会形成 ～118kDa的二聚体。这些二聚体在植物细胞中，J链的存在下，进一步二 聚化，从而形成～252kDa的分子。随着分泌性元件的添加，观察到～320kDa 的分子种类。

信号肽在嵌合重链，J链和分泌性元件构建体中的存在对于装配引入 多聚体免疫黏附素非常重要。根据mRNA的翻译，预言了信号肽的分裂， 从而将每种蛋白质存放在植物细胞的内质网(ER)中。预测向多聚体免疫 黏附素中的装配发生在ER和高尔基体中，并且装配的分子再从细胞中分 泌出来。

实施例12：装配的ATR免疫黏附素的纯化

基本上如对以上实施例3的ICAM-1免疫黏附素所述地，完成装配的 ATR免疫黏附素的纯化。

实施例13：ATR免疫黏附素抑制对哺乳动物细胞的毒素作用

上述表达盒用于产生装配的免疫黏附素，其纯化自植物提取物。纯化 的免疫黏附素用于防止CHO-K1细胞在简单生物测定中被杀死。CHO-K1 细胞具有在其细胞表面上与PA结合的受体，但是它们对所述毒素不敏感。 当受到PA和LFN-DTA的攻击时，它们被杀死，所述LFN-DTA是由LF 的N末端255个氨基酸组成的融合蛋白，所述N末端255个氨基酸与 diptheria毒素的催化性A链连接。该重组毒素使用相同的LF-PA-受体相互 作用，所述相互作用对天然LF和OF蛋白的结合和侵入是必需的。为了 测试免疫黏附素的保护作用，在恒定(毒性)量PA和LFN-DTA的存在 下，将CHO-K1细胞混合于增加量的ATR-IgA2，并且测量了其对蛋白质 合成的后继作用。ATR-IgA2是毒素作用有效的抑制剂，其以比可溶性ATR 更低的摩尔浓度抑制毒素。

实施例14：ATR免疫黏附素抑制人类受试者中的毒素作用

在药用缓冲液中制备纯化的免疫黏附素，并且将其施用于感染了炭疽 的人类受试者。施药途径可以是吸入气雾剂或注射。通常会死亡的处于感 染晚期的受试者受到免疫黏附素的保护，以避免毒素作用。

实施例15：备选ATR免疫黏附素表达盒的构建

通过PCR克隆制备编码人ATR的完整细胞外部分(氨基酸24-320) 的盒。特别地，利用下列寡核苷酸引物，从质粒ATR(Bradley et al.，2001) 或质粒TEM8(St Croix et al.，2000)扩增878bp的片段：

5′-GGGGGACGCAGGGAGGATGGGGGTC    (SEQ ID NO：95)

CAG-3′

5′-GAGCTCCCGTCAGAACAGTGTGTGG     (SEQ ID NO：96)

TGGTG-3′

为了向ATR细胞外结构域编码区域的3’末端引入Sac I位点(实下划 线)，设计了第二引物(SEQ ID NO：96)。用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR， 从而减少错误的累积。利用下列寡核苷酸引物，从质粒δ.ATG-TOPO#4扩 增121bp的第二片段，其包括5’未翻译区域和植物信号肽：

5′-GGTACCACTTCTCTCAATCCAACTTTC-3′    (SEQ ID NO：93)

5′-ATCCTCCCTGCGTCCCCCAGCCAAACTAGTA    (SEQ ID NO：97)

GAGGTGAACAAAAGC-3′

为了向PCR片段的5’末端引入Kpn I位点(实下划线)，设计了第一 引物(SEQ ID NO：93)。这两个PCR片段具有20nt的互补序列(虚下划线)。 将这两个PCR片段混合在一起，并且利用SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：96 扩增981bp的片段。将由此产生的PCR片段克隆到植物表达盒中，从而 以与部分ATR细胞外结构域(实施例1)相同的方式与人IgA2形成遗传 融合体。

利用这种相同方法的备选结构应该扩增氨基酸41-227。

实施例16：炭疽嵌合毒素受体蛋白的生产：CMG2-IgG和高亲和性抗PA 抗体

与IgG融合的CMG2的构建体(CMG2-IgG)和高亲和性抗PA抗体

简要地，合成了编码密码子最优化的抗PA重和轻链可变区的DNA片 段和编码人炭疽毒素受体(CMG2)部分细胞外结构域的片段。将CMG2 和抗PA重链可变区序列在组成型的植物启动子(CaMV35S)和植物3’多聚 腺苷化作用信号序列的控制下，分别连接到土壤杆菌二重载体中编码人 IgG1重恒定区结构域的DNA片段上。为了1H轻链V区域制备了相似的 κ链载体。这些载体的结构详述如下。

程序“信号IP”用于预测位于氨基酸33-34⁴⁵间的CMG2的信号肽分 裂位点。利用源自高表达植物基因的密码子用法表，我们设计并合成了 697bp的DNA片段，其包括短5’未翻译区域，鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)⁴⁶的2S2清蛋白储存蛋白的信号肽，和CMG2的氨基酸34-232(图14)。CMG2 编码的部分对应于被Scobie等用作可溶性蛋白质的部分³¹。证实了序列后， 在已经包含人IgG1的恒定区的载体pMSP-IgG的Kpn I和Sac I位点之间 克隆该片段，从而产生质粒pMSP-CMG2-IgG。这导致CMG2的细胞外结 构域和人IgG1的恒定区的遗传融合。为了使用对烟草中的表达最理想的 密码子，合成了该人IgG1恒定区。在由此产生的构建体中，嵌合 CMG2-IgG1分子的表达受到高表达的组成型启动子CaMV35S47和ags 3’ 终止区域的控制。所预测的成熟蛋白质的氨基酸序列显示在图14中。

将完整表达盒(启动子+CMG2-IgG1+终止子)从pMSP-CMG2-IgG 亚克隆到二重土壤杆菌Ti质粒载体pGPTV-kan-ocs中，从而产生质粒 pGPTV-kan-ocs-CMG2-IgG。载体pGPTV-kan-ocs来源于pGPTV-kan， pGPTV-kan自身来源于更常见的二重载体pBIN19。⁴⁸表达盒使用来自 Nicotiana sylvestris psaDb基因的5’未翻译区域，其具有翻译增强子的特 征。⁴⁹将起始ATG周围的上下序列设计为与在高表达植物基因中发现的相 匹配。⁵⁰

为了抗PA抗体的表达，利用植物最佳的密码子，合成了在3’末端具 有Sac I位点的编码1H重链可变区的DNA片段，从而与我们的密码子最 优化的人IgG1恒定区序列相连接。相似地，还合成了在3’末端具有Hind III的编码抗体1H的Vk区域的序列，从而与我们的密码子最优化的人κ 恒定区相连接。这些序列引入与CMG2基因所使用的相同的5’UTR和信 号肽。在CaMV35S启动子的控制下，在对应于重和轻链恒定区的框架中， 将这两个可变区均克隆到分离的表达载体中。

利用根瘤土壤杆菌介导的瞬时表达系统在烟草中生产的蛋白质

使两种携带表达1H重和轻链的土壤杆菌菌株共渗透到Nicotiana benthamiana的叶子中，7天后对其进行收获，并立即进行抗体的纯化。⁵¹相似地，使携带CMG2-IgG表达盒的土壤杆菌菌株渗透到叶子中。制备了 来自瞬时转染的烟草植物的叶提取物，并通过蛋白质A层析对其进行分 馏。利用这种快速、高容量且可重复的方法，我们纯化了1H和CMG2-IgG 的小样品。表6显示典型性试验的结果。

表6.从瞬时转染的N，benthamiana叶中分离和纯化蛋白质

          克       μg/gm                 μg/gm

                                          产量

蛋白质    叶子     (ELISA)    μg回收的   (OD280)     纳摩尔

1H IgG    100      18         1740        17.4        11.6

CMG2-IgG  74       无数据     1140        15.4        9.8

在还原和非还原的条件下，通过SDS-PAGE分离纯化的蛋白质，并对 其进行银染色(图15)。1H IgG制剂含有150kDa的单一条带，其降低为 两条50和26kDa的条带。蛋白质印迹法将这两条条带证实为人β重链和 κ轻链(未显示)。从蛋白质A中洗脱的CMG2-IgG制剂是蛋白质的异种 混合物，其具有非还原条件下的位于45kDa的主条带和还原条件下的29 kDa。基于氨基酸序列所预测的CMG2-IgG单体的尺寸是58kDa。在还原 条件下，存在少量的53kDa条带，其可能代表完整的CMG2-IgG单体。 更快速迁移的条带是蛋白质水解的降解产物，其缺少VW A/I结构域以及 全部或部分Cγ1。所有的条带都与抗IgG1抗血清反应(数据未显示)。

在还原的条件下，再次在SDS-PAGE上运行CMG2-IgG制剂，并且将 该凝胶印迹到PVDF上，并用考马斯染色。将含有53，34和29kDa片段 的三个切片(图15)发送到UC Davis的分子结构研究室(Molecular Structure Facility)，从而进行埃德曼(Edman)降解(N末端氨基酸测序)。 从53kDa的条带中不能回收任何序列。这暗示了“阻断的”残基的存在， 这与对CMG2氨基末端所预期的Gln相一致。34和29kDa片段的氨基末 端分别位于氨基酸268和297(图14中的粗体氨基酸编号1和2)。这些 结果与图15中的卡通模型相一致。

实施例17：测试炭疽嵌合毒素受体蛋白的体外抗炭疽毒素的活性

该实施例说明了用于测试本文所述的嵌合毒素受体蛋白和免疫黏附 素的抗炭疽毒素活性的方法。

测试了纯化的1H IgG植物产抗体和CMG2-IgG1抗毒素在使用了致 死毒素的小鼠巨噬细胞测定中的中和PA能力。确定了施用PA加上致死 因子(100ng/ml PA，50ng/ml LF)以及不同浓度植物产1H IgG或 CMG2-IgG1后的RAW 264.7小鼠巨噬细胞状细胞的存活²⁵。在加入巨噬 细胞前，用毒素预培养抗毒素蛋白30分钟。暴露于毒素3小时后，进行 了间接生存力测定。植物产1H IgG的滴定确定了所述抗体具有～0.3μg/ml 的IC₅₀，其与动物细胞中产生的相同抗体非常相似(未显示)。CMG2-IgG 制剂在浓度范围1-10μg/ml内还保护巨噬细胞。这暗示CMG2-IgG是有效 的抗毒素。

实施例18：炭疽毒素受体蛋白免疫黏附素CMG2-IgG变体

该实施例说明了为了改善本文所述嵌合毒素受体蛋白和免疫黏附素 的稳定性和产量而进行的代表性修饰。

变体的产生和表达

利用PCR，在CMG2-IgG构建体的CMG2和IgG编码区域之间的结 合处接近Sac I位点引入修饰。在变体1中去除了14个氨基酸，所述氨基 酸不是如由晶体结构所定义³⁴的VW A/I结构域的一部分(图14中的V1)。 以下提供所述去除的氨基酸序列及其对应的核苷酸序列：

TEILELQPSSVCVG(SEQ ID NO：102)

act gaa atc cta gaa ttg cag ccc tca agt gtc tgt gtg ggg(SEQ ID NO：103)

对应变体2a(图14中的V2a)，去除了Cγ1结构域，其原因在于以上 分析提示了该区域中存在蛋白酶敏感位点。在变体2b中，去除了所述14 个氨基酸和Cγ1结构域。在变体3中，保留了Cγ1结构域，但是将所述 14个氨基酸替换为挠性的连接体(Gly₃Ser)₃。

将全部这四种变体和原始CMG2-IgG瞬时表达于N.benthamiana中， 并且由蛋白质A层析法从叶提取物中纯化。另外，与人κ链一起表达原始 CMG2-IgG。在非还原和还原条件下，对等量的每种蛋白质进行 SDS-PAGE，并且用考马斯蓝染色凝胶(图16)。所有的变体均含有显著 多于原始CMG2-IgG的最高分子量形式。变体V1和V3似乎具有与原始 CMG2-IgG相同的降解片段(30和33kDa)，而变体V2a具有两个不同的 大约30kDa的片段。这些片段的氨基末端测序(在图16中，被方框环绕 并通过编号4和5识别的)显示它们刚好起始于V2a的铰链区前(图15)。

变体V2b，其正好包含CMG2的VWA/I结构域加上IgG的Cγ2/Cγ3， 比其他更稳定。在还原条件下(泳道11，图16)，大部分蛋白质以50kDa 的条带出现，其具有不明显的降解(基于aa序列对该蛋白质预测的尺寸 是46.5kDa)。在非还原条件下(图16，泳道5)，在～40kDa和～97kDa 处存在主要条带。这两个条带均降为50kDa的单体，这说明它们对应于 单体和二硫键合的二聚体形式(数据未显示)。V2b蛋白质的大小排阻层 析(SEC)在75kDa处显示出单峰(图17)。SDS-PAGE和SEC的组合提 示所述蛋白质是二硫键合的二聚体和非共价结合的二聚体的混合物，其可 能是通过Cγ3结构域之间的相互作用保持在一起的。 κ轻链存在下的CMG2-IgG表达

同样感兴趣的是在κ链存在下表达的CMG2-IgG发生了什么。它形成 条带梯，其开始于大约137kDa，并以35kDa为单位增加(泳道6，图16)。 当减少时，该梯分解为60，40和28kDa三条条带(泳道13)。该28kDa 条带是κ链，且60kDa条带是全长CMG2-IgG。对来自这条泳道的40kDa 条带(图16中的编号3)进行埃德曼降解，这显示出其氨基末端位于V196。 这说明了κ链能够防止Cγ1中，而非来自CMG2的额外14个氨基酸序列 中的分裂。

测试抗毒素的活性

在具有阴性对照抗体的巨噬细胞保护测定中，测试了原始CMG2-IgG 和CMG2-IgG V2b的抗毒素活性(图18)。CMG2-IgG V2b比原物更优越， 而其他变体具有中等活性(数据未显示)。为了50％地中和炭疽毒素活性 (IC₅₀)所需要的CMG2-IgG V2b的浓度是35ng/ml(两个测定的平均值，表 2)。这有利地与抗PA抗体比较，所述抗PA抗体是通过人类基因组科学 (Human Genome Sciences)(IC₅₀＝50ng/ml)，⁵²Elusys(IC₅₀＝80ng/ml)，²⁷和Avanir(IC₅₀＝30-70ng/ml)²³开发的。CMG2-IgG V2b与PA在IC₅₀的摩 尔比是0.38，这意味着每个CMG2-IgG V2b分子可以中和差不多3个炭疽 致死毒素分子。

结构分析

通过覆盖三种晶体结构——IgG Fc(蛋白质数据库⁵³中的1E4K)， CMG2的VWA/I结构域(具有内部二硫键，1SHU³⁴)，和与PA键合的CMG2 (1T6B³⁶)，推导出CMG-IgG V2b可能像什么以及它可能怎样与PA键合 的预测模型(图19)。大小排阻层析法提示几乎全部的CMG-IgG Var2b处 于二聚体形式，但是SDS-PAGE分析提示至少50％的这些二聚体是非共价 连接的。这可能是由于CMG2VWA/I结构域的形状，其比更长形的免疫 球蛋白Cγ1结构域更偏球状(图19)空间位阻可防止IgG Fc铰链区中的 半胱氨酸靠到足够近以有效地形成二硫键。

CMG2-IgG在CMG2-κ存在下的表达

装配了由CMG2的前199个氨基酸和人κ链恒定结构域组成的构建体 (CMG2-κ)。使CMG2-κ与变体1或变体3(这两种变体均含有完整的Cγ1 结构域)一起进行瞬时表达，并且利用蛋白质A琼脂糖纯化由此产生的蛋 白质。在这两种情形中，优势分子种类是约180和160kDa的一对条带(图 20)。在还原条件下，在57kDa，34kDa和13kDa处存在条带。免疫印迹 (未显示)说明57kDa条带含有IgG重链，而更小的条带与κ-链特异性 抗血清反应。最小条带的尺寸应该与CMG2VWA/I结构域和κ恒定区之 间的14个氨基酸中的分裂相一致。主要的非还原条带与抗IgG和抗κ抗 血清反应，并且可能代表具有两条“重链”和两条“轻链”的装配四聚体 分子。在RAW巨噬细胞保护测定中测试了这些分子。V1/k的IC₅₀是44 ng/ml，且V3/k的是32ng/ml(表2)。由于它们较大的尺寸，这两种新蛋 白质的抗毒素：PA在IC₅₀的摩尔比低得多：V1/k是0.25且V3/k是0.18。

表7.计算的IC₅₀(ng/mL)和抗毒素与PA在IC₅₀的摩尔比。

在RAW巨噬细胞保护测定中，将原始CMG2-IgG和变体的制剂与80 ng/ml的PA和80ng/ml的LF混合(方案参见D.1.5)。结果来自于不同三 天的测定。

通过FcγR和N-聚糖作用的IgG清除

对由目前正在开发的多种抗毒素引起的炭疽毒素和/或B.anthracis感 染的体内中和和清除中所涉及的机制没有很好地理解。在抗体和免疫黏附 素的情形中，毒素：抗毒素复合物的体内中和可以依赖于与FcγR的相互 作用。许多类型的白细胞具有对IgG上Fc区域的细胞表面受体，称为FcγR。 抗原-抗体复合物与这些细胞通过Fc-FcγR相互作用的结合可以导致大量 的响应，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和受体-配体复合物的 内在化。

晶体结构显示FcγR与重链Fc区域的Cγ2的较低铰链区结合。⁵⁵遗传 和生化方法已经识别了调控该相互作用的氨基酸残基，以及N-连接的聚糖 对IgG Fc的作用。N-连接的聚糖是寡糖结构，其共价附着于糖蛋白的某 些天冬酰胺残基。晶体结构分析提示位于人IgG的Asn²⁹⁷的N-聚糖稳定 Fc区域的特异性构造，所述特异性构造促进FcγR结合^55，56(图21)。该 N-聚糖的消除显著地降低IgG对这三种主要FcγR同种型在体外的亲和性， 但是不影响体内半衰期。^57，58，59

尚不知是什么影响糖基化或缺乏什么将具有使CMG2-IgG免遭炭疽致 死毒素或B.anthracis感染的体内保护作用。如果抗毒素-PA复合物的有效 清除/破坏受到与FcγR结合的影响，则它可以受到抗毒素糖基化状态的影 响。Avanir制药(Avanir Pharmaceuticals)的科学家比较了两种它们的抗 PA抗体的糖基化的和无糖基(aglycosly)形式的体内活性，并且发现在保 护功效上具有非常小的区别。²³由此，他们推断致死毒素中和不是Fc效应 子介导的。然而，这仅仅是一个试验，并且对其中一个无糖基抗体存在降 低的功效。为了这个原因，测试CMG2-IgG免疫黏附素的无糖基(在这 些实施例中测试的形式)和糖基化形式。

动物和植物糖蛋白的N-聚糖中存在着微妙的差别，并且有些已经唤起 了对植物糖蛋白的潜在免疫原性/变应原性的关注。^60，61利用无糖基重链恒 定区制造了这些实施例中的1H IgG和CMG2-IgG。相信免疫原性不是基 于植物产免疫黏附素的炭疽中和疗法的主要问题，即使所述免疫黏附素是 糖基化的。如果免疫原性证明是显著的问题，则应该可能遗传地修饰植物， 从而“人源化“它们的N-聚糖。^62-67

结论

植物产免疫黏附素，其由与人IgG1的Fc区域融合的人炭疽毒素受体 CMG2的细胞外结构域组成(CMG2-IgG)，能够保护小鼠巨噬细胞免遭纳 摩尔浓度的炭疽致死毒素的致死作用。所述免疫黏附素的特异性活性似乎 与可用的最佳单克隆抗体相当。

实施例19：另外的CMG2-IgG嵌合变体

该实施例说明了可以用于改善本文所述嵌合毒素受体蛋白和免疫黏 附素的稳定性和产量的代表性修饰。

修饰变体2b，从而进一步增大产量。在VWA/I和Cγ2结构域之间(参 见图19中的结构)引入挠性的(Gly₃Ser)₃连接体产生具有含有较高百分比 二硫键合的二聚体的变体，这使其在体内更加稳定和/或活跃。将CMG2-κ 构建体中CMG2VWA/I结构域和Cκ之间的14个氨基酸替换为(Gly₃Ser)₃连接体。在瞬时转染的烟草中产生这两种新蛋白质，并且利用蛋白质A琼 脂糖层析法对它们进行纯化。测试它们的恰当装配和稳定性。通过表面胞 质基因共振(plasmon resonance)确定结合常数。在RAW巨噬细胞保护 测定中将它们的活性与现存的免疫黏附素的活性进行比较。预测糖基化不 影响这个基于细胞的测定中的活性。然而，糖基化可以影响体内活性，因 此，在选择最有效的免疫黏附素抗毒素后，在Cγ2结构域中再引入糖基化 位点。在体内测试糖基和无糖基形式。

用于在烟草中表达CMG2-IgG的分子构建体

加入挠性连接体后变体4与变体2b相同，并且通过连接编码来自变 体3的VW A/I结构域加上(Gly₃Ser)₃连接体(氨基酸1-196，图14)的 DNA片段和编码来自变体2b的IgG铰链和恒定结构域Cγ2-Cγ3(氨基酸 298-531，图14)的DNA片段对其进行构建。

另外，通过用挠性的(Gly₃Ser)₃连接体替换所述额外的14个氨基酸来 修饰CMG2-κ。在组成型植物启动子(CaMV35S，或我们选择的其他启动 子)和植物3’多聚腺苷化作用信号序列的控制下，将每种变体置于表达 盒中。将所述表达盒克隆到二重载体pGPTV中⁴⁸，并且将由此产生的质 粒转化到根瘤土壤杆菌菌株EHA 105中。

表8

  免疫黏附素   结构域排列   预测的PA结   合位点的数量   V2b   CMG2-Cγ2-Cγ3   2   V4   CMG2-(G₃S)₃-Cγ2-Cγ3   VWA/I-GGGSGGGSGGGS-EPKSCDKTHTCP-   CH2-CH3   2   V3/CMG-κ   CMG2-(G₃S)₃-Cγ1-Cγ2-Cγ3/   CMG2-(G₃S)₃-Cκ   4

选择了最有效的抗毒素(利用巨噬细胞保护测定)后，应该利用可以 商业购买的试剂盒进行位点指导的诱变，从而将Gln的密码子(图14中 的位置381)转变为Asn。

烟草瞬时表达系统

使携带用于表达变体2b，4，5或6的二重载体的根瘤土壤杆菌菌株， 或两种携带变体3加上新CMG2-κ的土壤杆菌菌株，与另外的携带编码病 毒沉默抑制子的二重载体(P19)的菌株一起，渗透到Nicotiana benthamiana 的叶子中(大约100)。使用该沉默抑制子，从而获得高水平的表达。渗透 后，每种土壤杆菌将其T-DNA(含有表达盒)从二重载体转移到植物细胞 中，所述T-DNA在其中整合和转录。然后免疫黏附素在叶子中积累高水 平，在渗透后7天时收获该叶子，并进行免疫黏附素的纯化。利用这个烟 草瞬时表达系统可以在短时间内产生少量的(＜5mg)这5种嵌合蛋白中每 一种，其足以进行体外和细胞培养分析，以及大鼠体内毒素中和研究。⁵¹小规模的免疫黏附素纯化和生物物理表征

匀化烟草叶(N.tabacum或N.benthamiana)并在水性缓冲液中对其进行 提取，进行离心和过滤从而去除固体，并且利用蛋白质A琼脂糖层析法对 具有完整IgG-Fc区域的蛋白质进行纯化，对其进行针对PBS的透析，和 过滤灭菌。通过考马斯染色和通过利用对人IgG1(或κ链)的抗体的免疫 印迹对纯化的蛋白质进行表征。为了在该阶段评估成功，使用四种标准。 第一，通过蛋白质A纯化的嵌合蛋白主要由一种尺寸的种类组成。第二， 它具有与编码的蛋白质序列一致的表观分子量。第三，它与抗IgG抗血清 反应。第四，它在RAW巨噬细胞保护测定中具有比当前的CMG-IgG V2b 更高的活性。我们应该通过BIAcore(Pharmacia Biosensor)中的表面胞质基 因共振测量免疫黏附素与保护性抗原(List Biological Labs)的结合动力学， 应该将其用于计算K_d。

使小鼠巨噬细胞免于毒素攻击的保护

基本如所述确定与毒素一起施用了CMG2-IgG后，RAW 264.7小鼠巨 噬细胞状细胞(ATCC #TIB-71)的存活⁶⁸。在10-1000ng/ml内滴定 CMG2-IgG，并且在加入到细胞中前，用毒素(80ng/ml PA，80ng/ml LF)对 其进行预培养30分钟。暴露于毒素3小时后，利用MTT(3-(4，5-二甲基噻 唑-2-基)-2，5-二苯四唑溴)进行间接生存力测定。用含有2mg/ml MTT的培 养基培养细胞30分钟，并用酸性异丙醇(90％的异丙醇中含有40mM HCl， 0.5％SDS)将其溶解，且在A₅₉₅处测量吸光率。如通过MTT测定所测量地， 报告与假装处理的细胞相比，特殊试剂剂量的毒素攻击中存活的细胞的百 分数((测试孔的平均值-8个仅含毒素的孔的平均值)x100％/8个无毒素的 孔的平均值)。从剂量响应曲线，估算IC₅₀值(中和了50％活性的抗毒素 浓度)。还确定每种嵌合蛋白的有效摩尔比，或抗毒素与毒素在IC₅₀时的 比例。

挠性的(Gly₃Ser)₃连接体的添加在二聚体的二硫键合，或体外中和活 性，或此二者中产生可测量的进步。

实施例20：CMG2-IgG在炭疽感染的动物模型中的抗毒素活性

该实施例说明了可以用于识别本发明的嵌合毒素受体蛋白和免疫黏 附素的动物测试。

所选择的免疫黏附素的Fc上存在或缺乏N-聚糖可以影响对抗毒素或 对抗B.anthracis孢子攻击的体内功效，其原因在于与Fc受体和/或抗毒素 的血清半衰期的相互作用中的区别。在Fischer大鼠毒素中和测定中测试 CMG2-IgG的无糖基和糖基化形式。其后在兔中进行这两种形式的体内半 衰期测试，随后在兔孢子攻击测定中测试功效。大鼠体内毒素中和测定需 要每种抗毒素大约3mg，所述抗毒素容易地由瞬时烟草转染提供。兔子的 药物动力学和孢子攻击研究需要每种抗毒素大约200mg，所述抗毒素由稳 定转化的烟草纯化而来。

Fischer大鼠体内炭疽毒素中和

基本如Ivins所述，利用CMG2-IgG的糖基化和无糖基形式，进行体 内炭疽毒素中和试验。⁶⁹按照生产商的指导，在异荧烷EZ-麻醉室(Euthanex Corp，PA)内麻醉具有颈静脉导管的雄性Fischer 344大鼠，所述大鼠重 200-250g(Charles River实验室)。在0.2ml PBS/0.1％BSA pH 7.4中，通过 导管施用一剂抗毒素(0.25和0.12纳摩尔/大鼠，其对应于1x和0.5x致死 毒素的摩尔等价量)。5分钟后，施用致死毒素(在0.2ml/200g大鼠中PA 20 μg/LF 4μg)。阴性对照是无关的植物产人IgG1(我们的实验室)。在每个 测试组中使用5只动物(5只动物/组x2剂x2种抗毒素＝20只动物)，且 每组对照中使用4只动物(4只动物/组x2剂对照IgG＝8只动物)。如通 过估计呼吸和心跳的停止，监测动物的不适和死亡对应存活的时间。在暴 露于致死毒素后，将大鼠保持在麻醉状态5小时，或直至死亡，从而最小 化不适。对存活5小时的大鼠监测更长一段时期(长达72小时)。以5小 时的间隔，从存活的大鼠收集血清样品，并且通过ELISA测定抗毒素的浓 度。在相似的研究中，由Avanir制药生产的一种抗体以毒素的0.5x摩尔 等价量保护所有的动物对抗该剂量的致死毒素。²³我们认为我们的植物产 免疫黏附素也可以实现。如果需要，使用与致死毒素甚至更低摩尔比的免 疫黏附素重复试验。对这两种抗毒素形式的每一种确定最小有效剂量。

为了确定通过静脉内(i.v.)途径注射的CMG2-IgG的药物动力学(PK)， 将通过内侧耳动脉，以10mg/兔，对荷兰条纹兔(每组3只，1.5-2.0kg) i.v.注射CMG2-IgG。在下列时间点从每只动物的耳动脉收集血液样品：注 射前1小时和注射后1，4，和8小时，和1，2，3，4，5，6，8，10，12，15，17，19 和21天。凝集和离心后获得血清，并将其冷冻储存在-80℃，直到分析。

通过功能性ELISA测量兔血清样品中CMG2-IgG的浓度。将纯化的 CMG2-IgG用作标准。将浓度1μg/ml的保护性抗原(列表生物实验室(List Biological Labs))包被在微滴定板的孔上(100μl/孔)(Costar Corp.)，并在4 ℃培养过夜。将未结合的抗原洗掉，并且用PBS+5％脱脂乳粉在室温下 封闭孔1小时。然后吸出封闭溶液。在37℃，将样品和标准物应用到由 PA包被的板上1小时，随后洗涤3次。该过程后，在37℃下，添加山羊 抗人IgG辣根过氧化物酶(HRP)缀合物1小时，并且再洗涤3次。通过 加入HRP底物并在室温培养30分钟，检测抗体复合物。利用Benchmark 微板读数器(Benchmark Microplate Reader)确定颜色的形成(在405nm 处的吸光率)。使用ELISA测试兔血清干扰和非特异性结合。

通过基于个体血清浓度-时间数据的标准模型独立方法⁷⁰确定 CMG2-IgG的描述性PK参数。对iv施药的预剂量时间点分配第一时间点 的浓度值，从而进行PK计算。对每只兔子分析最大血清浓度(Cmax)， 达到Cmax所花费的时间，曲线下的面积，系统性清除，恒定态分配的体 积，末端半衰期，和绝对生物利用率(F)。

用炭疽杆菌孢子气雾攻击兔子

已经开发了动物模型，以研究豚鼠^29，71，72、小鼠^9，73-75和兔⁷⁶中针对 炭疽感染的被动保护作用。小鼠模型的一个优势是它们需要少得多的抗毒 素。然而，利用抗PA抗体的最佳保护存在于兔子中，^24，27因此我们计划 使用该相同的模型测试我们的CMG2-IgG。

开始于大约第16个月，在暴露前预防研究中测试糖基和无糖基嵌合 毒素受体蛋白。如果在该研究中兔子成功地得到保护(在最高抗毒素剂量 是为100％)，我们则进行暴露后治疗研究，其开始于大约第21个月。将 荷兰条纹兔(1.5-2kg)随机分配到小组中，所述小组包含4只雄性和4 只雌性动物。为了暴露前预防，处于第0天的兔子在炭疽孢子攻击前30-45 分钟时，接受i.v.施用的单次剂量CMG2-IgG(通过内侧耳动脉的1，2，或4 mg的CMG2-IgG/兔)或作为对照iv施用的磷酸盐缓冲液(PBS)。为了评 估暴露后的功效，在第0天用孢子攻击兔子，并且然后在攻击后24，36，或 48小时给予单次i.v.注射的4mg CMG2-IgG/兔，或攻击后48小时i.v.给予 PBS。通过按照标准方案的仅为鼻口暴露系统攻击兔子。用于攻击的目标 气雾暴露是Ames株(Ames LD₅₀＝1.05x10⁵孢子⁷⁶)50％致死剂量(LD₅₀)的 200倍。由起始浓度和贯穿该暴露集聚的累积分时输出量(minute volume)， 确定实际攻击剂量。对所有的动物进行每日两次的观察，并在攻击后持续 28天。在攻击前和攻击后第1，2，7，10，14，21，和28天收集血液和血清。 当可能时，从垂死或刚刚死亡(“死亡中”)的动物中收集血液和血清样品， 并且分析B.anthracis的存在。在第28天，对所有的存活者处以安乐死， 并且获得并培养肺、脾和胸内淋巴结。在发送到行星生物技术(Planet Biotechnology)进行ELISA分析从而确定血清CMG2-IgG水平(如D.2.3 中)和兔抗PA滴定(如下所述)前，通过培养对血清样品进行无菌过滤， 并且认为它是非传染性的。

兔抗PA抗体对免疫黏附素响应的测量

先前的研究发现受到抗PA单克隆抗体保护免遭吸入性炭疽感染的兔 揭示了对它们自身抗PA抗体的保护性滴定量。与用于定量血清中 CMG2-IgG相似的ELISA用于测量被炭疽孢子攻击的兔子中针对PA的免 疫响应。在该测定中，用浓度为1μg/ml的PA包被微滴定板，并且在4℃ 培养过夜。洗掉未结合的抗原，并且封闭所述孔。然后吸出封闭溶液。

在37℃下，在所述板上培养血清样品的稀释液1小时。在37℃加入 山羊抗兔IgG HRP缀合物(Santa Cruz生物技术(Santa Cruz Biotech))1小时， 通过加入HRP底物和室温培养30分钟形成颜色。利用Benchmark微板读 数器(Benchmark Microplate Reader)确定颜色的形成(在405nm处的吸 光率)。导致光密度信号为1.0的血清稀释液将用作响应的量度标准(滴定 量)。

实施例21：肉毒杆菌嵌合毒素受体蛋白

通过将肉毒杆菌毒素受体融合于重链恒定区，构建嵌合肉毒杆菌毒素 受体蛋白。构建了突触结合蛋白I(STI)肉毒杆菌嵌合毒素受体蛋白和SV2 肉毒杆菌嵌合毒素受体蛋白。

与重链融合的肉毒杆菌毒素受体

将部分STI(fragSTI)和SV2(fragSV2)融合于具有另外蛋白质序列的重 链恒定区，所述部分STI(fragSTI)和SV2(fragSV2)是足以进行毒素结合那 些氨基酸序列，所述另外的蛋白质序列对积累、溶解性、纯化、蛋白酶抗 性、后继修饰所必需，从而在患者和目标中改变免疫原性或增长半衰期， 如与神经节苷脂，如Gt1b和Gd1a顺利地相互作用的能力。还包括多肽连 接体，如((Gly)xSer)n，从而孤立这些序列的折叠需要和功能性。将编码这 些多肽的核酸序列最优化为包括同义密码子的使用，从而避免克隆和转化 过程中的重组，以及避免小RNA介导的表达抑制。

与重链恒定区融合的肉毒杆菌毒素受体蛋白还可以是fragSTI或 fragSV2的纯合和杂合多聚体。对于纯合多聚体，与重链恒定区融合的肉 毒杆菌毒素受体蛋白是单多肽链，其中fragSTI或fragSV2的序列存在2 或更多次，即该片段的序列在单初级氨基酸序列中连续存在。认为多聚结 合片段通过亲和力作用增加表观结合亲和性，并且由此增强潜力。对于杂 合多聚体，与重链恒定区融合的肉毒杆菌毒素受体蛋白是单多肽链，其中 fragSTI和fragSV2的序列存在1或更多次，即该片段的序列在单初级氨基 酸序列中连续存在。改变线性排列中重复片段序列的位置，从而增强结合 的亲和力，并且由此增高潜力。

嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白

每种上述肉毒杆菌毒素受体部分融合于IgG或IgA的Fc区域，特别 是融合于重链恒定区1，2和3(α1，α2，α3和γ1，γ2和γ3)或重链恒定 区2和3(α2和α3或γ2和γ3)的氨基或羟基末端。还可以构建重链恒定 区的嵌合体。例如，恒定重链区域γ1，γ2，α2和α3的嵌合体可以用于通 过蛋白质G亲和层析法促进纯化。

具有轻链恒定区的改良嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白

每种上述肉毒杆菌毒素受体部分如上融合于IgG或IgA的Fc区域， 并且在单独的多肽链中，还在氨基或羟基末端融合于轻链(κ或λ)的恒 定区。在合成和细胞成熟过程中，将所述抗体恒定区装配为四聚体，其中 依靠不同恒定区之间的共价和非共价蛋白质-蛋白质相互作用将重链和轻 链恒定区装配为规范形式。

具有轻链恒定区和抗体可变结构域的改良嵌合肉毒杆菌毒素受体蛋白

将具有改善诱杀剂表现的结合特异性的抗体可变结构域引入到具有 肉毒杆菌毒素受体部分和轻链恒定区的复合物中。下列类型的可变结构域 特异性可以用于改善诱杀剂的表现：将诱杀剂指引向突触膜的抗神经节苷 脂结合特异性，在那里对浓缩而言肉毒杆菌毒素是已知的；指引诱杀剂远 离突触膜而朝向其他血清或细胞成分，从而确保迅速破坏结合的毒素的结 合特异性，其中所述其他血清或细胞成分诸如参与Fc介导的清除的那些； 通过具有识别其他毒素氨基酸序列的可变区增加毒素结合或扩大毒素识 别的抗毒素特异性，其中可以选择所述其他毒素氨基酸序列以鼓励毒素的 交联和增加的结合。

更高级的多聚体

通过融合上述多肽和重链恒定区α2和α3，形成更高级的多聚体sIgA 状的融合体，这指导连接链(J链)和分泌性元件(SC)或保护蛋白(PP) 的进一步装配。

还可以通过融合上述多肽和IgM的重链恒定区，形成更高级的多聚 体，这容许了J链和若干(5个)抗体状融合体装配成IgM状诱杀剂受体。

附加参考文献

将下列参考文献的全部内容引入本文作为参考。

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92.MacDonald M H，Mogen B D，Hunt A G(1991)来自T-DNA编码 的真蛸碱合成酶基因的多聚腺苷化作用信号的特征(Characterization of the polyadenylation signal from the T-DNA-encoded octopine synthase gene).核 酸研究(Nucleic Acids Res)19：5575-81

93.Martin等.(1993)，由嵌合ICAM-1/免疫球蛋白分子引起的鼻病 毒的有效中和和破坏(Efficient Neutralization and Disruption of rhinovirus by Chimeric ICAM-1/Immunoglobulin Molecules).病毒学杂志(J.of Virology)，67：6，p.3561-3568.

94.Mogen B D，MacDonald M H，Leggewie G，Hunt A G(1992)有效的 mRNA 3’末端在豌豆rbcS基因中的形成所需要的若干不同类型的序列元 件(Several distinct types of sequence elements are required for efficient mRNA 3′end formation in a pea rbcS gene).分子细胞生物学(Mol Cell Biol)12：5406-14

95.Ni M，Cui D，Einstein J，Narasimhulu S，Vergara C E，Gelvin S B (1995)源自真蛸碱和甘露碱合成酶基因的嵌合启动子的强度和组织特异 性(Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from the octopine and mannopine synthase genes).植物杂志(Plant Journal)7： 661-676

96.Sawant S V，Singh P K，Gupta S K，Madnala R，Tuli R(1999)植物 高表达基因中保守的核苷酸序列(Conserved nucleotide sequences in highly expressed genes in plants).遗传学杂志(Journal of Genetics)78：123-131

97.St Croix B，Rago C，Velculescu V，Traverso G，Romans K E， Montgomery E，Lai A，Riggins G J，Lengauer C，Vogelstein B，Kinzler K W (2000)在人肿瘤内皮中表达的基因(Genes expressed in human tumor endothelium).科学(Science)289：1197-202.

98.Yamamoto Y Y，Tsuji H，Obokata J(1995)Nicotiana sylvestris中光 合体系I基因的5’前导区，即psaDb含有翻译增强子(5′-leader of a photosystem I gene in Nicotiana sylvestris，psaDb，contains a translational enhancer).生物化学杂志(J Biol Chem)270，12466-70.

前述实施例不限制而且仅代表本发明的不同方面和实施方案。所有引 用的文献指示本发明所属领域的技术水平。尽管没有承认文献是现有技 术，将每篇文献的公开内容以与每篇单独的以全部内容引入作为参考的相 同的程度引入本文作为参考。

本领域中的技术人员容易地理解本发明充分适合于实现目标和获得 上述的以及那些于此固有的结果和优势。所述方法和组合物举例说明了优 选的实施方案是示范性的，并且不意欲作为本发明范围的限制。本领域的 技术人员会进行某些改进和其他应用，它们在本发明由权利要求范围所定 义的精神范围内。

对本领域技术人员显而易见的是在不偏离本发明范围和精神的条件 下可以对本发明进行不同的取代和修饰。因此，这样的另外的实施方案是 在本发明和下列权利要求范围内的。

本文例证性地描述的发明可以在缺乏任何一种或多种元件，一种或多 种本文未具体公开的限制的条件下进行。所使用的术语和表述是用作描述 的，而非限制的术语，并且不存在使用排除了所示和所述特征的任何等 价物或其部分的术语和表达的意图。公认不同的修饰可能在本发明所要求 的范围内。因此，应该理解尽管通过本发明是通过优选的实施方案具体公 开的，但是本文所公开概念的任选特性、修饰和变化可以被本领域的技术 人员所采用，并且认为所述修饰和变化在本发明如通过说明书和所附权利 要求所定义的范围内。

另外，当以马库什组或其他选择性分组的术语描述本发明的特性或方 面时，本领域中的技术人员应该承认本发明也因此是通过马库什组或其他 组的任何个体成员或成员的亚组的术语描述的，并且适当时排除个体成 员。

其他实施方案在下列权利要求的范围内。