筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的方法

摘要

本发明公开了一种筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的方法，其具体步骤如下：(1)采集奶牛乳样；(2)测定采集乳样的体细胞数SCC和乳脂率、乳蛋白、乳糖、总固形物；(3)利用体细胞数SCC计算得出体细胞评分SCS；(4)计算IgG指数；(5)筛选奶牛：选择IgG指数大于－4.3的奶牛。经过实验表明，本发明可以准确的在奶牛群中筛选出牛奶中IgG含量高的奶牛，管理人员可明确得知IgG产量高奶牛并对其进行集中饲喂，与未经筛选的奶牛群比较可以大幅提高所得奶产品中IgG含量19.5％以上，且饲喂成本大幅降低。应用本发明方法可以显著的提高牛奶中的IgG的含量，为富含高免疫球蛋白的牛奶的生产提供可能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选奶牛的方法，具体地说是一种筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的方法。

背景技术

免疫球蛋白是初乳和常乳里最重要的免疫活性蛋白。牛奶中的免疫球蛋白主要有IgG、IgM、IgA。免疫初乳或免疫乳含有特异性抗体具有预防和治疗肠道疾病的功能，能预防人类的一些传染病，如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、顽固梭菌(Clostridium difficile)、小似隐孢菌(Cryptosporidiumparvum)、变异链球菌(Streptococcus mutans)和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)。牛奶中的特异性Ig能够有效的抑制细菌的繁殖，抑制细菌定植，抑制对底物的结合，抑制细菌分泌毒素，阻止毒素与人体细胞受体的结合，中和毒素，降低细菌活性，能有效的抗病毒。泌乳期牛乳中IgG的含量为0.03～1.2mg/mL，平均为0.33mg/mL。提高牛奶中IgG的含量是目前研究的热点和难点之一。

目前常用的提高牛奶中免疫活性蛋白的含量的方法有，利用免疫乳生产提高免疫球蛋白含量、利用乳品深加工技术增加牛奶中生物活性肽、利用乳腺反应器等基因工程技术生产乳铁蛋白等免疫活性蛋白，这三项技术属于完全不同的研究领域，各有特色。但免疫乳生产成本过高和加工工艺的特殊要求成为了免疫乳进一步发展的制约因素；许多生物活性肽的构效关系和分子作用机制仍不清楚。生物活性肽的浓度低、酶解条件复杂、分离提纯难度大成为制约乳品深加工技术工业化生产的主要因素；转基因动物制备的效率低，转基因个体的后代存在不能表达或表达混乱及不能遗传给后代等问题，限制了免疫活性蛋白产业化生产。因此，现阶段急需一种成本低，效果好的可以提高牛奶中免疫球蛋白IgG含量的方法。

发明内容

本发明的主要目的是为了提高奶牛乳中IgG含量而提出一种筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的方法，用本发明方法对奶牛群体进行筛选可以选出具有高免疫球蛋白IgG合成能力的奶牛进行生产，从而提高乳中的IgG含量，为富含免疫球蛋白IgG的牛乳的生产提供了可能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的方法，其具体步骤如下：

(1)采集奶牛乳样，记录采集时间点个体奶牛的产奶量、泌乳天数和胎次；

(2)测定采集乳样的体细胞数和乳脂率、乳蛋白、乳糖、总固形物；

(3)利用体细胞数计算得出体细胞评分SCS：

计算公式为SCS＝log₂[SCC/100,000]+3；

(4)计算IgG指数，公式为：

IgG指数＝0.4475×x1-0.0061×x2-0.0274×x3-1.140×x4-1.261×x5-2.172×x6+1.1776×x7+0.1044×x8

其中x1：胎次；x2：泌乳天数；x3：产奶量；x4：乳脂；x5：乳蛋白；x6：乳糖；x7：总固形物；x8：体细胞评分SCS。

(5)筛选奶牛：

选择IgG指数大于-4.3的奶牛。

以上所述的为一种筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的方法。其中，所述步骤(1)中的奶牛首先以隐性乳房炎诊断液进行乳房炎检测以剔除隐性乳房炎奶牛，健康奶牛采用TMR饲喂，饲料精粗比为45∶55，日喂三次，自由采食，分早中晚三次采集牛奶乳样，按早中晚4∶3∶3混合，4℃保存备用。

本发明思路及IgG指数公式来源：通过前期采集样本，中期8项数据的测定，后期利用SAS 9.0系统的CANCORR程序对8项数据与牛奶中IgG含量进行典型相关分析，将8项数据(胎次、泌乳天数、产奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物、体细胞评分SCS)中重叠进行剔除，对自变量进行选择，建立最优回归方程，即为计算牛奶IgG含量的多元回归方程，将此方程命名为IgG指数公式(Immunoglobulin G Index)，可以筛选牛奶中IgG含量高的奶牛个体。

上述IgG指数公式为IgG指数＝0.4475×x1-0.0061×x2-0.0274×x3-1.140×x4-1.261×x5-2.172×x6+1.1776×x7+0.1044×x8

其中x1：胎次；x2：泌乳天数；x3：产奶量；x4：乳脂；x5：乳蛋白；x6：乳糖；x7：总固形物；x8：体细胞评分SCS。

公式的验证：

1、奶牛乳样采集：

选择健康泌乳奶牛，以隐性乳房炎诊断液进行乳房炎检测剔除隐性乳房炎病牛。试验牛均采用一般试验管理方式，奶牛饲料配方根据产奶量进行调整，TMR饲喂，精粗比为45∶55，奶牛自由采食，日喂三次，挤奶三次，采用Delaval鱼骨式挤奶台进行机械挤奶，挤奶时“二次药浴，一次纸巾擦干”。记录每头牛的产奶量并采集乳样，采乳样时采集三次，按早中晚比例4∶3∶3混合，共取样100mL，4℃保存；50mL用于检测牛奶体细胞总数和乳脂、乳蛋白等常规成分；50mL奶样用于分离乳清测定IgG的含量。

2、检测指标及方法

(1)数据测定

根据牛场记录统计试验奶牛的胎次、泌乳天数，记录采样时间点奶牛的个体产奶量；牛奶乳成分测定于农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)进行。取50mL乳样以乳成分分析仪测定体细胞数(SCC)和乳脂率(Fat)、乳蛋白(Pro)、乳糖(Lac)、总固形物(TS)5项常规成分。体细胞评分由体细胞数计算得来(SCS＝log₂[SCC/100,000]+3)。

(2)夹心ELISA方法测定牛奶中Ig的含量

以ELISA定量试剂盒(Bethyl，Montgomery，TX，USA)来检测牛奶中IgG含量。以兔抗牛IgG包被酶标板用以捕获待检样品中的IgG，然后再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG作为二抗结合牛IgG。采用TMB(四甲基联苯胺)为显色底物，颜色的深浅与样品中的IgG含量呈正比，以OD值为纵坐标，标准IgG含量为横坐标绘制标准曲线，建立回归方程检测牛奶中IgG含量。牛奶样品进行1∶1000倍稀释，每个样品进行三个重复样检测。

(3)数据统计

按IgG指数进行分组的奶牛，统计其牛奶中IgG含量的变化，利用SAS 9.0程序中的方差分析来进行统计分析，差异显著性水平分别为显著(p＜0.05)和极显著(p＜0.01)。

3、结果

经数据对比显示可见，IgG指数与牛奶中IgG含量呈现明显的正相关，随着IgG指数的增加，牛奶中IgG的含量也随之增加。

利用IgG指数＞-4.3来筛选高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛的依据：

IgG指数与牛奶中IgG含量的关系见图1。根据上述方法，实验证实随着IgG指数的升高，牛奶中IgG含量亦升高。如图1所示，当IgG指数＞-4.3时，筛选出的奶牛头数为总头数的50％。经过进一步验证，全群奶牛牛奶中IgG含量平均为0.318mg/mL，IgG指数＞-4.3筛选出的奶牛牛奶中IgG含量平均为0.380mg/mL，而未筛选的奶牛IgG含量平均为0.256mg/mL。当筛选指数更高时，牛奶中IgG可以提高更高的比例，但筛选的奶牛头数少，不利于重新组群进行生产，且总体产奶量会减少。因此，利用IgG指数＞-4.3进行筛选，即可以筛选出足够数量的高免疫球蛋白IgG合成能力泌乳奶牛，又可以提高牛奶中IgG的含量19.5％以上，筛选效果显著。

筛选出的奶牛进行组群，仍采用TMR饲喂方式、选用和筛选前相同的饲养管理方法及相同的饲料配方。

本发明的优点及有益效果：

经过长期和反复的实验验证表明，本发明可以准确的在奶牛群中筛选出所产牛奶中IgG含量高的奶牛，牧场管理人员可以明确得知IgG产量高的奶牛并对筛选后的奶牛进行集中饲喂，与未经筛选的奶牛群比较可以大幅提高所得奶产品中IgG含量19.5％以上，且饲喂成本大幅降低。应用本发明方法进行筛选，可以显著的提高牛奶中的IgG的含量，为富含高免疫球蛋白的牛奶的生产提供可能。

附图说明

图1为IgG指数与牛奶中IgG含量关系图。

具体实施方式

本发明发明人在北京市大兴区四个牛场约1600头奶牛中随机选取299头奶牛，利用本发明方法计算奶牛IgG指数，并进行筛选，并将所筛选奶牛牛奶中IgG含量与全群奶牛牛奶中IgG含量进行比较。

具体步骤：

(1)采集奶牛乳样，记录采集时间点个体奶牛的产奶量、泌乳天数和胎次：

于北京市大兴区沧达福、创新、安定及东胜园四牛场随机选择299头健康泌乳中国荷斯坦奶牛，以隐性乳房炎诊断液进行乳房炎检测剔除隐性乳房炎病牛，隐性乳房炎诊断液(DeLaval公司)。试验牛均采用一般试验管理方式，奶牛饲料配方根据产奶量进行调整，TMR(全混合日粮)饲喂，精粗比为45∶55，奶牛自由采食，日喂三次，挤奶三次，采用Delaval鱼骨式挤奶台进行机械挤奶，挤奶时“二次药浴，一次纸巾擦干”。记录每头牛的产奶量并采集乳样，采乳样时采集三次，按早中晚比例4∶3∶3混合，共取样100mL，4℃保存；50mL用于检测牛奶体细胞总数和乳脂、乳蛋白等常规成分；50mL奶样用于分离乳清测定IgG的含量。

根据牛场记录统计试验奶牛的胎次、泌乳天数，记录采样时间点奶牛的个体产奶量。所选牛的平均胎次为2.08±1.02，平均泌乳天数为121.6±59.2d，平均产奶量为23.5±6.0kg。

(2)测定采集乳样的体细胞数和乳脂率、乳蛋白、乳糖、总固形物：方法：牛奶乳成分测定于农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京)进行。取50mL乳样以乳成分分析仪(型号：Fossomatic 5000、Milkoscan 4000)测定体细胞数(SCC)和乳脂率(Fat)、乳蛋白(Pro)、乳糖(Lac)、总固形物(TS)5项常规成分。数据见表1。

(3)体细胞评分由体细胞数计算得来(SCS＝log₂[SCC/100,000]+3)。数据见表1。

(4)计算IgG指数，公式为：

IgG指数＝0.4475×x1-0.0061×x2-0.0274×x3-1.140×x4-1.261×x5-2.172×x6+1.1776×x7+0.1044×x8；

所述x1：胎次；x2：泌乳天数；x3：产奶量；x4：乳脂；x5：乳蛋白；x6：乳糖；x7：总固形物；x8：体细胞评分SCS；数据见表1。

(5)筛选奶牛：

选择IgG指数大于-4.3的奶牛，筛选出的奶牛头数为总头数的50％。

利用夹心ELISA方法测定筛选奶牛和未经筛选的奶牛所产牛奶中IgG的含量。具体测定方法：以牛ELISA定量试剂盒(Bethyl，Montgomery，TX，USA)来检测牛奶中IgG绝对含量。采用捕获抗体、标准参照蛋白、HRP标记抗体等建立标准曲线，建立回归方程检测其IgG含量。牛奶样品进行1∶1000倍稀释，每个样品进行三个重复样检测。

筛选奶牛和未筛选奶牛其乳中IgG含量的测定数据见表1。将筛选奶牛和未筛选奶牛乳中的IgG含量(0.380±0.146vs 0.318±0.138mg/mL)运用SAS统计程序进行分析，比较差异显著性。结果经过50％筛选后，IgG的含量提高了19.5％，且差异显著(p＜0.05)。

数据统计

对IgG指数分组的奶牛统计其牛奶中IgG含量的变化，利用SAS程序中的方差分析来进行统计分析，差异显著性水平分别为显著(p＜0.05)和极显著(p＜0.01)。

利用本发明方法即IgG指数＞-4.3进行筛选，筛选出的奶牛头数为总头数的50％，筛选结果见表1。可见，IgG指数筛选后，可以有效的提高牛奶中IgG的含量，牛奶中IgG含量提高19.5％，筛选效果显著。

表1  应用IgG指数筛选奶牛的结果

注：^*为差异显著，^**为极显著。

结论：

利用本发明方法筛选出的指数筛选免疫球蛋白IgG高产奶牛，当IgG指数大于-4.3时，筛选后的奶牛IgG含量可以提高19.5％。

本发明虽然以北京郊区规模养殖场为研究对象而得到的研究结果，但是可以大规模普遍使用，无随机性因素，原因如下：规模养殖场的奶牛遗传基础接近，只要根据本发明所述的步骤首先进行隐性乳房炎诊断液筛查，然后进行样品采集和奶牛筛选，将筛选出的奶牛进行组群，仍采用TMR饲喂方式、选用和筛选前相同的饲养管理方法及相同的饲料配方，都可以达到本发明所述的筛选效果。