公开/公告号CN101280016A
专利类型发明专利
公开/公告日2008-10-08
原文格式PDF
申请/专利权人 中国人民解放军第二军医大学;
申请/专利号CN200810038100.8
申请日2008-05-27
分类号C07K16/44;A61K39/395;A61P25/36;A61P25/30;
代理机构上海德昭知识产权代理有限公司;
代理人丁振英
地址 200433 上海市翔殷路800号
入库时间 2023-12-17 20:49:36
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-07-15
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K16/44 授权公告日:20111109 终止日期:20140527 申请日:20080527
专利权的终止
2011-11-09
授权
授权
2008-12-03
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-10-08
公开
公开
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种能对抗可卡因等精神活性物质引起精神依赖(复吸)的抗体的制备及其应用。
背景技术：
精神活性物质依赖(吸毒)和复吸是当今社会严重的问题，目前，尚无较理想的方法来防治脱毒后的复吸。近年来科学界对可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)研究不断深入，可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)是一类与药物的成瘾和依赖效应相关的肽类物质，可卡因和苯丙胺等精神活性物质可导致可卡因-苯丙胺调节转录肽明显表达，但其受体目前尚未克隆成功。增加与药物成瘾密切相关脑区中脑腹侧背盖区(VTA)CART的水平可诱导大鼠产生可卡因样行为，诱导条件性位置偏爱的形成(Kimmel HL，et.al.，(2000).Intraventral tegmental area injectionof rat cocaine and amphetamineregulated transcript peptide 55-102 induceslocomotor activity and promotes conditioned place preference.J PharmacolExp Ther 294：784-792)。尸检发现，可卡因成瘾患者的CART的表达也显著增加(Kuhar MJ，Dall Vechia S.(1999)CART peptides：novel addiction-and feeding-related neuropeptides.Trends Neurosci 22：316-20.)，表明精神活性物质诱导的中枢CART水平的增加可能是导致复吸的重要原因之一。提示减少可卡因-苯丙胺调节转录肽的表达就可削弱机体对可卡因和可苯丙胺等精神活性长期使用而引起的精神依赖(林琴，可卡因-苯丙胺调节转录肽抗体抑制吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱的形成和重建，2006，第二军医大学硕士论文)。
1974年，Bonese等人第一次提出用免疫疗法来治疗药物依赖(Bonese，K.F.et.al.，(1974).Changes in heroin self-administration by a rhesus monkeyafter morphine immunization.Nature 252，708-710.)，1986年，Owens和Mayersohn首次提出了被动免疫疗法应用于治疗药物依赖的概念(Owens，S.M.，& Mayersohn，M.(1986).Phencyclidine-specific Fab fragments alterphencyclidine disposition in dogs.Drug Metab Dispos 14，52-58.)。九十年代初期单克隆抗体应用于药物依赖这一治疗概念的提出(McClurkan，M.B et.al.，(1993)Disposition of a monoclonal anti-phencyclidine Fab fragmentin rats.J Pharmacol Exp Ther 266，1439-1445.Valentine，J.L.，et.al.，(1994)Anti-phencyclidine monoclonal Fab fragments dramatically alter phencycli-dine pharmacokinetics in rats.J Pharmacol Exp Ther 269，1079-1085.Valentine，J.L.，& Owens，S.M.(1996).Antiphencyclidine monoclonalantibody therapy significantly changes phencyclidine concentraions in brainand other tissues in rats.J Pharmacol Exp Ther 278，717-724.)，单克隆抗体具有可重复、纯度高、特异性强及可大量制备等的优点，而且单克隆抗体可以对药物过量及自身给药产生即时和长期的作用。
抗体作为一种新的诊断和治疗手段有巨大的潜力，大量的实验结果表明，抗体可以用于人类，有治疗疾病的作用。基因工程抗体很多，其中单链抗体(single chain antibody)是一个重要的基因工程抗体，是利用基因工程方法使抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段约5-25个氨基酸的连接肽，首尾拼接而成的重组蛋白。它能较好地保持抗原亲和活性，并具有分子量小、免疫原性低、组织穿透力强、体内清除快、易于进行基因工程改进和大肠杆菌发酵生产等优点，且易与效应分子相连构建多种新功能的抗体分子。噬菌体表面展示文库技术是获得基因工程抗体的关键技术，其要点是：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因；PCR扩增抗体全套基因片段(如VH.VL)，将体外扩增的VH.VL基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因III(g3)或基因VIII(g8)的先导系列的下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gpIII或gpVIII的N端。研究发现这样展示的多肽能保持其活性，据此可用固相化抗原经“亲和结合-洗脱-扩增”数个循环，直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。
目前尚无文献报道通过噬菌体展示技术筛选出用于治疗由于可卡因等精神活性物质(包括阿片类、可卡因、苯丙胺和氯胺酮等)导致的成瘾行为的抗体。
发明内容：
本发明的目的是筛选出用于治疗由于可卡因等精神活性物质导致的成瘾行为的抗体基因，表达和纯化该抗体以及该抗体的应用。
本发明是基于可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)而研发出的一种可以对抗可卡因-苯丙胺调节转录肽的单链抗体。
本发明以GST-CART融合蛋白(氨基酸序列见本申请人的中国专利申请200510025292.5，发明名称为“可卡因-苯丙胺调节转录肽基因疫苗及其制备与应用”中公开的序列)作为抗原免疫小鼠，获得cDNA文库，应用噬菌体展示技术筛选出可卡因-苯丙胺调节转录肽单链抗体基因，将该基因克隆到原核表达载体pET28a上，运用原核表达系统，诱导表达并纯化可卡因-苯丙胺调节转录肽单链抗体，直接注射到动物体内从而减少了机体对可卡因和苯丙胺等精神药物长期使用而引起的精神依赖。
本发明提供一类可卡因-苯丙胺调节转录肽单链抗体，共6种，分别命名为AH1，AH4B，AH6，AH19，AH33B，AH36，单链抗体的蛋白结构N端和C端序列具有小鼠免疫球蛋白重链和轻链特征，本单链抗体的特征性序列位于NC端之间，被柔性短肽GGGGSGGGGSGGGGS相连，柔性短肽NC端包含与CART特异性结合的序列，其分子量为29.9～33.4Kd，等电点为5.22～6.61之间。
AH1具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
AH4B具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
AH6具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
AH19具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
AH33B具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
AH36具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述抗体在制备治疗由于可卡因等精神活性物质导致的成瘾行为中的应用。
本发明的抗体，体外可有效识别合成的CART活性片段CART55-102；腹腔注射抗体后，可显著抑制可卡因诱导的小鼠自发活动增强，大剂量(1mg/kg)可完全逆转可卡因诱导的行为敏化；对正常小鼠的自发活动，在观察的剂量(0.04～1mg/kg)下无明显影响。
附图说明
图1.GST-CART融合蛋白考马斯亮蓝染色图
其中：第1泳道为纯化的GST-CART55-102融合蛋白，第2泳道为纯化的GST蛋白。M为蛋白质MARKER，自上而下分别为116KDa，66KDa，45KDa，35KDa，25KDa。
图2.Western blotting验证GST-CART特异性图
其中：第1泳道为纯化的GST-CART(55-102)融合蛋白，第2泳道为纯化的GST蛋白，一抗为CART单抗(1∶1000)，二抗为goat anti mouseIgG-HRP(1∶10000)，作为免疫原的融合蛋白特异性良好。
图3.pET28a-CARTscFv模式图和cDNA及蛋白序列(AH36)
图4.纯化后pET28a-CARTscFv抗体(AH36)考马斯亮蓝染色图
其中：M为蛋白质Maker，自上而下分别为116KDa，66KDa，45KDa，35KDa，25KDa，第1泳道为纯化后单链抗体蛋白(AH36)。
图5.ELISA检验pET28a-CARTscFv(AH36)抗体滴度
其中：横坐标为抗体稀释度，纵坐标为450nm波长OD值，抗体原液浓度为200ug/ml。
图6.pET28a-CARTscFv抗体(AH36)对正常动物自发活动的影响
其中：横坐标为实验组，分别是完全对照组，生理盐水组，0.04mg/kgCART抗体组和1mg/kgCART抗体组。纵坐标为水平运动距离(mm)，*表示OD值大于阴性对照组2.1倍。
图7.单次给予CART单链抗体(AH36)对可卡因诱导的动物行为敏化表达的影响
其中：纵坐标为水平运动距离(mm)，横坐标为实验组，分别生理盐水，0.04mg/kg抗体，0.2mg/kg抗体，1mg/kg抗体组。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
pGEX-4T3-CART55-102(林琴，可卡因-苯丙胺调节转录肽抗体抑制吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱的形成和重建，2006，第二军医大学硕士论文，pGEX-4T3购自amersham phaemacia公司)表达甘油菌30μl转接于3ml包含100μg/ml的LB培养基中，37℃摇床培养过夜；转接菌液1ml于100ml包含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃摇床培养至OD600值为0.4时，加入1M IPTG 400μl使其终浓度为0.4mM，37℃，230r.p.m.摇床诱导表达5h后，4℃低温离心机12,000r.p.m.离心20min收集菌体，以10ml/湿重(g)加入PBS悬浮菌体。将细菌悬夜置于冰浴中，100W超声1秒，间歇1秒，超声20min。4℃低温离心机12,000r.p.m.离心20min，GST-CART55-102存在于上清中，小心移取上清至一干净离心管中备用。彻底悬浮Glutathione-Sepharose 4B beads，移取适量至层析柱中，先用2倍体积的去离子水洗，再用三倍体积的1×PBS洗。加入含目的蛋白的上清溶液，并将流速控制在2-10倍柱体积/小时。当含有目的蛋白质的溶液不再流出时，加入PBS洗涤树脂，将流速控制于10-20倍柱体积/小时，当流出液的280nm值接近洗涤液值时，洗涤完成。加入3-10倍柱体积的50mMGSH洗脱液洗脱目的蛋白，将流速控制于2-10倍柱体积/小时，分步收集流出液，并测定出目的蛋白所在的收集管。将洗脱下来的含目的蛋白的溶液在PBS中4℃透析过夜。
纯度及特异性良好的GST-CART蛋白(见说明书附图1，2)免疫动物，取脾脏细胞，按O′Brien PM and Aitken R编著《抗体噬菌体展示方法与操作指南》构建建cDNA文库，用PCR扩增出带酶切位点的抗体VH-linker-VL片段，SfiI酶和NotI酶双酶切PCR产物，胶回收片段，SfiI酶和NotI酶双酶切pCANTAB5E(购自amersham phaemacia公司)噬菌体载体，胶回收载体。将胶回收后的抗体片段和pCANTAB5E载体进行粘端连接，转化入大肠杆菌TG1型菌株，通过筛选富集，挑取阳性克隆菌株，表达分泌性抗体，ELISA及Western bloting检验抗体特异性，识别CART，抽提质粒，委托生工生物技术公司测序。PCR扩增加入酶切位点的抗体基因，XhoI酶和NcoI酶双酶切PCR产物，XhoI酶和NcoI酶双酶切pET28a载体，将胶回收后的抗体片段和pET28a载体进行粘端连接，测序(见说明书附图3，为AH36克隆到pET-28a NcoI和Xho I中的序列)。验证后转化到表达菌株内，运用原核表达系统表达单链抗体，亲和层析柱纯化抗体(见说明书附图4)，ELISA检验单链抗体特异性及滴度(见说明书附图5)。
实施例2：CART单链抗体(AH36)对可卡因引起的药物依赖的影响
将抗体用于动物实验，证实可卡因-苯丙胺调节转录肽抗体减少了机体对可卡因等精神药物使用而引起的药物依赖。结果如下：
(一)行为敏化模型
1.自发活动记录设备
本实验采用的条件位置偏爱穿梭箱黑箱作为自发活动记录设备。黑箱放置于100×100×100的隔音箱内，内径为15x15x35cm，箱底上方5cm处分别安置有光滑铁丝网一块；穿梭门关闭。观察箱具有隔光、隔音的效果，声强衰减为20-25dB。在箱子的顶部，安装有白光照明灯和红外LED，并有通风通道和小风扇；装有1个微摄像头，并有DC 12V电源线和A/V视频线的接头；箱底部垫有一块垫板，可有效防止光线的反射，使成像清晰。
2.动物模型构建
将实验用小鼠按体重以随机数字表随机分组。第1到7天上午10:00-12:00之间持续给予可卡因20mg/kg，非饲养环境中1h后放回饲养笼中，第8到14天撤药，第15天给予可卡因20mg/kg诱导动物行为敏化的表达，观测其在给可卡因后30分钟之内的水平运动距离。
3.实验结果
(1)pET28a-CARTscFv抗体(AH36)对正常动物自发活动无影响。
小鼠腹腔注射pET28A-CARTscFv抗体0.04mg/kg，1mg/kg，2h后观测其30分钟之内的水平运动距离。0.04mg/kg，1mg/kg与生理盐水对照组相比较，小鼠水平活动距离没有明显差异(P＞0.05)，表明pET28A-CARTscFv抗体本身没有影响动物自发活动(见说明书附图6)。(2)单次给予pET28a-CARTscFv抗体(AH36)抑制可卡因诱导的动物行为敏化的表达。
在第15天给予可卡因诱导行为敏化表达之前2h分别给小鼠腹腔注射生理盐水、0.04mg/kgpET28A-CARTscFv抗体、0.2mg/kgpET28A-CARTscFv抗体、1mg/kgpET28A-CARTscFv抗体。
生理盐水组为连续7天给小鼠皮下注射可卡因20mg/kg，第15天给予可卡因20mg/kg诱导前2h给小鼠腹腔注射生理盐水10ml/kg，0.04mg/kg抗体组为连续7天给小鼠皮下注射可卡因20mg/kg，第15天给予可卡因20mg/kg诱导前2h给小鼠腹腔注射PET28A-CARTSCFV抗体0.04mg/kg，0.2mg/kg抗体组为连续7天给小鼠皮下注射可卡因20mg/kg，第15天给予可卡因20mg/kg诱导前2h给小鼠腹腔注射pET28a-CARTscFv抗体0.2mg/kg，1mg/kg抗体组为连续7天给小鼠皮下注射可卡因20mg/kg，第15天给予可卡因20mg/kg诱导前2h给小鼠腹腔注射pET28a-CARTscFv抗体1mg/kg。*P＜0.05，**P＜0.01与生理盐水组比较有显著性差异。
结果表明三个剂量的pET28A-CARTscFv抗体均能抑制可卡因引起的行为敏化的表达(见说明书附图7)。
AH1，AH4B，AH6，AH19，AH33B与AH36一样可有效与CART55-102结合。
SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>可卡因-苯丙胺调节转录肽单链抗体及其应用
<130>说明书，权利要求书
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>311
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
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210 215 220
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu
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Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Ser Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr
245 250 255
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260 265 270
Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu Ile
275 280 285
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<211>293
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<210>4
<211>277
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
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<210>5
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<212>PRT
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Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val
35 40 45
Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln
50 55 60
Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly
65 70 75 80
Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg
85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Thr Gly Tyr Trp Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val
165 170 175
Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp
180 185 190
Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr
195 200 205
Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser
210 215 220
Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe
225 230 235 240
Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro
260 265 270
Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Glu Ile Lys Arg Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His His
290 295 300
His His His His
305
机译： 药物组合物，其包含衍生自可卡因和苯丙胺调节的转录物（CART）的肽以及一种成分
机译： 可卡因和苯丙胺调节转录本（CART）衍生的肽及其制剂
机译： 可卡因和苯丙胺调节的转录蛋白衍生的生物活性肽
